全 文 ：3
讨论
热稳定性试验表明, 此酶在30~ 60  稳定性较
差,保温 150 min 酶活基本降至原来的 20% , 提示
在炮制过程中温度的控制至关重要。pH 值稳定性
试验表明,在 pH 5
0~ 7
0比较稳定,而 pH 值低于
4时酶的稳定性较差, 尤其是在酸性条件下酶活下
降较快。保存稳定性试验表明, 在 4  下保存 10 d
酶活性仍较高, 保存稳定性较好。基本的酶学性质
为青黛炮制过程中浸泡环节温度和 pH 值的控制提
供了依据,对阐明炮制原理奠定了基础。
本研究试图证明马蓝叶细胞外存在
葡萄糖苷
酶,并研究它的最佳酶解条件,以证明马蓝叶的浸泡
过程是由
葡萄糖苷酶水解吲哚苷为吲哚酚的过
程。并在此研究基础上, 确证了由马蓝叶中获取吲
哚酚可以利用马蓝叶中的细胞外酶,而不需要通过
发酵获取
葡萄糖苷酶, 这样不仅大大缩短了生产
时间,而且使生产环境和浸泡液的卫生条件得到了
很大的改善,还为马蓝叶的再利用拓宽了道路。
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毛鸡骨草中异夏佛塔苷对照品的制备研究
宁丽娟1, 2 ,叶志文3 ,欧
彪3 ,汪
豪1, 2* , 叶文才2, 4 ,赵守训2
( 1
中国药科大学 现代中药教育部重点实验室, 江苏 南京
210009; 2
中国药科大学 天然药物化学教研室, 江苏 南京
210009; 3
广西玉林制药有限责任公司, 广西 玉林
537001; 4
暨南大学中药及天然药物研究所 ,广东 广州
510632)
摘
要:目的
建立毛鸡骨草中异夏佛塔苷对照品的制备分离方法。方法
取毛鸡骨草药材醇提浸膏的正丁醇萃
取部分用硅胶柱色谱分离,氯仿甲醇( 90 10~ 70 30)梯度洗脱, 收集异夏佛塔苷富集流份, 继续采用低压 C18柱
色谱及制备 H PLC 进行分离纯化,通过 NM R、MS 等波谱方法鉴定化合物结构, 经 T LC、HPLCUV 及 MS 联用等
技术进行质量分数检测。结果
从毛鸡骨草中制备分离的异夏佛塔苷对照品, 质量分数> 99 %。结论
本法得到
的异夏佛塔苷对照品符合中药化学对照品的相关技术要求, 为药材毛鸡骨草和含毛鸡骨草的成方制剂的质量控制
及药效物质基础研究提供化学对照品。
关键词:毛鸡骨草; 异夏佛塔苷;对照品; 制备高效液相色谱
中图分类号: R284
2; R286
02


文献标识码: A


文章编号: 02532670( 2010) 09146403
Preparation of isoschaftoside reference substance from Abrus mollis
NING Lijuan1, 2 , YE Zhiwen3 , OU Biao3 , WA NG Hao1, 2 , YE Wencai2, 4 , ZHAO Shouxun2
( 1
Key Laborat or y of Modern Chinese M edicines, China Pharmaceutical Univ ersit y, M inistry of Education, Nanjing 210009,
China; 2
Department of Natura l Medicinal Chemistry , China Pharmaceutical Univ ersity , Nanjing 210009, China;
3
Guangx i Yulin Pharmaceutical Co
, Lt d
, Yulin 537001, China; 4
Inst itute of T r aditional Chinese Medicine
and Natur al P roducts, Jinan Univer sity , Guangzhou 510632, China)
Abstract: Objective
T o establish a preparat ive method fo r reference substance o f isoschaftoside f rom
Abr us moll i s
Methods
T he nbutanol f ract ion f rom the ethanol ex tract o f A
moll i s was subject to co l
umn chromatog raphy on silica gel eluted w ith a gradient of CHCl3MeOH ( 90 10 to 70 30)
The co l
lected f ract ion o f isoschaf toside w as successively purif ied by lowpressure ODS column and prepar at ive
HPLC
It s str ucture w as ident ified by spect roscopic analy sis and the purity w as detected by TLC and
HPLCUVMS
Results
The T LC and HPLC analy sis show ed that the pur ity o f the reference substance
!1464! 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 20100323





















基金项目:科技部∀ 十一五#重大新药创制项目( 2009ZX09103315) ;广西科学研究与技术开发项目(桂科攻 08150051)作者简介:宁丽娟,女,硕士生。T el: 15850686765
Email: lijuan
nin g621@gm ail
com
* 通讯作者
汪
豪
T el: ( 025) 86185376
Email: btwanghao@ yahoo
com
cn
was more than 99%
Conclusion
T he reference substance of isoschaftoside acquired by this method could
meet the relat ive demands of the chemical reference substance in Chinese mater ia medica
It could be used
as a reference standard of the quality cont rol and the research of herbal medicine

Key words: A br us mol li s Hance; isoschaf toside; reference substance; preparat ive HPLC


鸡骨草为豆科相思子属植物鸡骨草 A br us can
toniensis Hance和毛鸡骨草 A
moll is Hance 的干
燥全草。本品具有清热利湿、舒肝止痛、活血散瘀的
功效,临床用于治疗急慢性肝炎、肝硬化腹水、胃痛、
风湿痹痛等症 [ 1]。毛鸡骨草又名大叶鸡骨草, 为广
西特产药材,也是广西玉林制药有限公司生产的中
药名优产品∀鸡骨草胶囊#等肝胆疾病治疗系列中成
药的主要原料, 年需求量 2 000 t 以上。为了寻找广
西特产药材毛鸡骨草治疗肝病的药效活性成分, 本
课题组对毛鸡骨草进行了较为系统的药效物质基础
研究,发现毛鸡骨草治疗肝炎的主要药效活性成分
为芹菜素黄酮碳苷类化合物, 其中异夏佛塔苷(芹菜
素6C阿拉伯糖8C葡萄糖苷,结构式见图 1) 的
量较大[ 23]。∃中国药典%2005 年版一部鸡骨草药材
质量标准只收载了显微、化学法鉴别等项目。本实
验以毛鸡骨草为原料, 采用制备高效液相色谱等分
离方法制备异夏佛塔苷化学对照品并进行标准物质
研究,为药材毛鸡骨草和含毛鸡骨草的成方制剂的
质量控制及药效物质基础研究奠定基础。
图 1
异夏佛塔苷的结构式
Fig
1
Structure of isoschaftoside
1
仪器与材料
X & 4型熔点测定仪; Shimadzu 8400 型红外光
谱仪( KBr 压片) ; Br uker A vance 500 型核磁共振
仪( 1HNMR 500 MHz, 13 CNMR 125 MHz) ; Shi
madzu 2020型液质联用仪(包括 LD20AD 高压二
元泵, SPDM20A 型二级管阵列检测器, SIL &
20AC 自动进样器, CTD & 20AC 柱温箱, LC & 2020
型单级四级杆质谱, LC M Sso lut ion 工作站) ; Agi
lent 1100型制备高效液相色谱仪( G1361 型高压二
元泵, G1365B 型 MWD检测器)。
柱色谱及薄层色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂
生产;聚酰胺板为浙江黄岩化工厂生产; C18薄层色
谱板及柱色谱用 C18 ( 40~ 63 m)均为 Merck公司
产品;其他试剂均为分析纯。
毛鸡骨草药材采自广西玉林市,经广西玉林制
药有限责任公司叶志文高级工程师鉴定为毛鸡骨草
A brus mol li s Hance 的干燥地上部分, 模式标本保
存于中国药科大学天然药物化学教研室。
2
方法与结果
2
1
原料处理:取毛鸡骨草药材 5 kg, 70%乙醇回
流提取 2次,每次2 h, 合并醇提液,减压浓缩至浸膏
状,加水混悬,分别用石油醚、氯仿及正丁醇萃取,取
正丁醇部位浓缩成浸膏( 200 g ) , 加硅胶拌样, 上样
于硅胶柱 ( 200~ 300 目) , 以氯仿甲醇( 90 10~
70 30)梯度洗脱, 取( 80 20)的洗脱流份上样于
Sephadex LH20 柱, 甲醇洗脱, 合并黄酮碳苷富集
流份,继续采用 C18低压色谱柱( 40~ 63 m, 200 g)
分离, 30%甲醇洗脱, 所得流份经 T LC 检识。TLC
条件为聚酰胺,乙醇水( 40 60)展开, 2% AlCl3 乙
醇溶液显色, U V365 nm 检视。合并异夏佛塔苷富
集流份, 减压回收至干, 得异夏佛塔苷粗品 ( 750
mg,质量分数约 65%)。
2
2
色谱条件
2
2
1
制备型 HPLC 条件: Waters RCM NovaPak
HR C18Cartridge( 300 mm ∋ 25 mm, 6 m) ;流动相为
甲醇水 ( 30 70) ; 体积流量 20 mL/ min; 检测波长
272 nm;进样量 1
0 mL( 25 mg/ mL, MeOH)。
2
2
2
分析型 HPLC 条件: Ag ilent Zorbax C18
( 250 mm ∋ 4
6 mm, 5 m) ; 柱温 40  ;流动相为甲
醇水( 30 70) ;体积流量为 1
0 ml/ m in;检测波长
272 nm; 进样量 20 L ( 100 g / mL, M eOH)。
2
3
对照品的制备分离: 取异夏佛塔苷粗品加甲醇
配制成 25 mg/ mL 的溶液,制备高效液相色谱法多次
进样分离纯化,每次进样量为 1 mL,收集保留时间为
7
0 min色谱峰(制备 HPLC色谱图见图 2,虚线内为
制备收集范围) , 减压回收至干后置恒温干燥箱
( 60  )干燥 24 h,得到黄色无定性粉末( 220 mg)。
3
样品的检测
3
1
薄层色谱检测:取异夏佛塔苷自制品,加甲醇配
制成 2 mg/ mL 的溶液,分别点样 5 L于硅胶 G薄层
色谱板和聚酰胺色谱薄膜。其中硅胶 G薄层色谱展
!1465!中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
图 2
异夏佛塔苷的制备高效液相色谱图
Fig
2
Preparative HPLC chromatogram of isoschaftoside
开剂:正丁醇醋酸水(4 1 5,上层) ,聚酰胺薄层色
谱展开剂:乙醇水( 40 60)。显色剂: 2% AlCl3 乙醇
溶液。105  加热 5 min,紫外光灯( 365 nm)下检视,
见单一黄色荧光主成分斑点,无杂质斑点。
3
2
HPLCUV 检测:取异夏佛塔苷自制品, 加甲
醇配制成 100 g / mL 的溶液,按照 2
2
2项下条件
分析,面积归一化法定量,结果自制品的质量分数为
99
01%, H PLCUV 质量分数检查图谱见图 3。改
变流动相为乙腈水( 18 82)进行质量分数检查, 质
量分数均> 98%。
图 3
异夏佛塔苷的 HPLCUV质量分数检查图谱
Fig
3
HPLCUV Chromatogram of isoschaftoside
3
3
HPLCMS检测: 取异夏佛塔苷自制品, 加甲
醇配制成 100 g / mL 的溶液, 进样 20 L, 液质联
用仪检测。质谱条件: ESI 源, 负离子模式, 离子源
电压 4
5 V, 采用总离子流监测( T IC)方式, 扫描进
样物质的总离子流, 扫描范围(m/ z )为 50~ 2 000,
扫描间隔 0
5 s, HPLCMS 质量分数检查图谱见图
4。可知样品经高效液相色谱柱分离,仅产生一个显
著的离子峰,该离子峰经选择性离子监测发现其负
离子质荷比为 563的化合物, 未见其他离子峰。
4
结构鉴定
淡黄色粉末, AlCl3 反应阳性,盐酸镁粉反应阳
图 4
异夏佛塔苷的 HPLCMS质量分数检查图谱
Fig
4
HPLCMS Spectra of isoschaf toside
性, mp 200~ 201  ; Posit iveESIMS m/ z : 563[ M
H] - ,结合1H、13CNMR 信息推断该化合物的分子
式为 C26H 28O 14。IR( KBr) max cm- 1 : 3 362( OH ) ,
1 649( C= O) , 1 582( C= C) , 1 520( C= C) , 1 090
( CO)。1HNMR ( 300 MHz, DM SOd6 ) !: 13
80
( 5OH) , 7
99 ( 2H , d, J = 8
4 Hz, H2(, 6() , 6
89
( 2H , d, J = 8
2 Hz, H3(, 5() , 6
73 ( 1H , s, H3) ,
4
80( 1H , d, J = 9
2 Hz, H1 of Glc) , 4
65 ( 1H ,
d, J= 8
8 Hz, H1) o f Ar a)。13 CNMR( 75 MHz,
DM SOd6 ) !: 163
5 ( C2) , 102
3 ( C3) , 181
8 ( C
4) , 161
1( C5) , 108
2( C6) , 161
1( C7) , 104
4( C
8) , 154
8( C9) , 102
3( C10) , 121
6( C1() , 128
7
( C2(, 6() , 115
8( C3(, 5() , 158
4( C4() , 74
3( C
1) o f Ara) , 74
0( C2) of Ara) , 71
0( C3) of Ara) ,
70
0( C4) of Ar a) , 68
6( C5) of A ra) , 73
3 ( C1
of Glc) , 70
6 ( C2 o f Glc) , 78
9 ( C3 o f Glc) ,
70
5( C4 of Glc) , 81
8 ( C5 of Glc) , 61
2( C6
of Glc)。综合以上信息, 与文献对照[ 4] , 确证该化
合物为异夏佛塔苷( isoschaf toside)。
5
讨论
毛鸡骨草的保肝降酶的药效活性成分为芹菜素
黄酮碳苷类化学成分, 本课题组选择异夏佛塔苷作
为本植物特征性指标成分并进行标准物质研究, 专
属性较强,具有质量控制意义,符合国家食品药品监
督管理局颁布的∀中药新药质量标准用对照品研究
的技术要求#的相关规定,为药材毛鸡骨草和含毛鸡
骨草的成方制剂的质量控制及药效物质基础研究奠
定基础。
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第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月