全 文 ：雷公藤甲素大鼠在体肠吸收特性研究
薛 　璟1 ,2 ,贾晓斌1 ,2
①
,谭晓斌1 ,王静静1 ,陈 　彦1 ,张陆勇3
(11 江苏省中医药研究院 中药新型给药系统重点实验室 ,国家中医药管理局中药口服制剂释药系统重点研究室 ,
江苏 南京 　210028 ;21 南京中医药大学 ,江苏 南京 　210045 ;31 中国药科大学 ,江苏 南京 　210009)
摘 　要 :目的 　考察雷公藤甲素在大鼠肠道的吸收情况 ,为其安全合理应用提供生物药剂学依据。方法 　采用大
鼠在体肠灌流实验 ,利用超高效液相色谱 (U PLC) 法测定雷公藤甲素的量 ,分别研究吸收部位和药物浓度对雷公
藤甲素吸收的影响。结果 　4、813、20μmol/ L 雷公藤甲素灌流液在各肠段的有效渗透系数 ( Peff 3 ) 和 10 cm 肠段
吸收百分比 (10 cm % ABS) 依次为十二指肠 > 结肠 > 空肠 > 回肠 ,各肠段之间无显著性差异 ( P > 0105) 。不同
质量浓度 (4～20μmol/ L) 的雷公藤甲素在肠道内的吸收无显著性差异 ( P > 0105) 。结论 　雷公藤甲素在大鼠肠
道内有较好的肠吸收 ,对肠段无明显的吸收部位选择性 ,一定范围内的药物浓度对雷公藤甲素的 Peff 3 和 10 cm %
ABS 无影响 ,初步判断其吸收机制为被动扩散。
关键词 :雷公藤甲素 ; 超高效液相色谱 ; 在体肠灌流 ; 吸收
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 01 - 0086 - 04
Studies on rat intestinal absorption of triptolide in situ
XU E Jing1 ,2 , J IA Xiao2bin1 ,2 , TAN Xiao2bin1 , WAN G Jing2jing1 , CH EN Yan1 , ZHAN G L u2yong3
(1. Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Meteria Medica , the State Administ ration of
Traditional Chinese Medicine , Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine , Nanjing 210028 , China ;
21 Nanjing University of Traditional Chinese Medicine , Nanjing 210045 , China ;
3. China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 , China)
Abstract : Objective 　To investigate t he rat intestinal absorption behavior of t riptolide and provide the
biop harmaceutic basis for reasonable application. Methods 　The intestinal absorption of t rip tolide was de2
tected by t he i n si t u single pass intestine perf usion met hod. The content of t riptolide in the perf usate was
determined by U PL C. Results 　The effective permeability coefficient s ( Peff 3 ) and absorption percentage of
10 cm intestinal segment s (10 cm % ABS) of t riptolide had no significant difference ( P > 0105) at concen2
t ration of 4 , 8. 3 , and 20μmol/ L in four different regions of intestine of rat , which showed duodenum >
colon > jejunum > ileum. The Peff 3 and 10 cm % ABS of t riptolide had no significant difference ( P > 0105)
among t he concent ration ranges of 4 —20μmol/ L . Conclusion 　Triptolide could be well absorbed in general
intestinal t ract wit hout specific absorption site. The concent ration of t riptolide has no influence on it s Peff 3
and 10 cm % ABS in t he certain range , which preliminarily judges t hat t riptolide is absorbed by passive dif2
f usion mechanism.
Key words : t rip tolide ; U PL C ; i n si t u intestinal perf usion ; absorption
　　雷公藤甲素又名雷公藤内酯醇 (t riptolide) ,是
从卫矛科 植 物 雷 公 藤 T ri ptergi um w i l f ordi i
Hook. f 中分离出的环氧二萜内酯类成分 ,具有免
疫抑制、抗炎、抗生育及抗肿瘤等生物活性[1 ,2 ] ,既
是雷公藤的主要有效成分之一 ,同时又是雷公藤引
起不良反应的主要成分[3 ] 。本研究采用大鼠在体单
向肠灌流的方法建立了雷公藤甲素肠吸收模型 ,采
用 U PL C 法测定雷公藤甲素的量 ,并对其吸收特性
进行研究 ,以期为雷公藤甲素的安全合理应用提供
生物药剂学依据。
1 　材料
111 　仪器 :AcQuityTM超高效液相色谱仪 ,二元泵 ,
DAD 检测器 ( Waters 科技公司 ,美国) ; Met tler
Toledo 分析天平 (Mettler Toledo 分析仪器有限公
司) ;Anke 离心机 T GL216 G (上海安亭科学仪器
厂) ;数显恒温搅拌循环水箱 H H260 (常州国华仪
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①　　收稿日期 :2009204217
　　基金项目 :中医药行业科研专项基金资助项目 (200707008)
　　作者简介 :薛　璟 (1985 —) ,女 ,江苏苏州人 ,南京中医药大学药学院 2007 级药剂学硕士 ,研究方向为药物新剂型与生物药剂学。
Tel : (025) 85637809 　E2mail : szxuejing @hot mail . com
　　3 通讯作者　贾晓斌　Tel/ Fax : (025) 85637809 　E2mail : jxiaobin2005 @hot mail . com
器厂) ;p H 计 (Metller2Toledo 公司) ;恒流泵 P HD
2000 Inf use/ withdraw Pump ( Harvard Apparat us
Inc. 美国) 。
112 　药品与试剂 :雷公藤甲素 (南京泽朗医药科技
有限公司 ,质量分数 > 98 %) ;泼尼松龙对照品 (中
国药品生物制品检定所 ,批号 1001532199603) ;乙
腈、甲醇、磷酸为色谱纯 ,水为纯净水 ,其他试剂均为
分析纯。
113 　实验动物 :SD 大鼠 ,雄性 ,体质量为 280～300
g ,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供 ,许可证
号 :SCXX(沪) 200720005。
2 　方法与结果
211 　灌流液中雷公藤甲素定量测定
21111 　色谱条件 :仪器为 Waters AcQuityTM Ult ra
Performance L C ,色谱柱为 B EH C18 (211 mm ×50
mm , 1. 7μm) ,流动相为乙腈2水 (30 ∶70) ,柱温 :
35 ℃,样品室 : 4 ℃,体积流量 : 013 mL/ min ;进样
量 :5μL ;检测波长 :220、246 nm。分别取空白肠灌
流液、雷公藤甲素与内标对照品溶液 ,以及含有药物
的供试液灌流后收集液 ,0122μm 微孔滤膜滤过 ,
U PL C 测定 ,色谱图见图 1。结果表明 ,雷公藤甲素
与内标的保留时间分别为 11459、11173 min ,供试
液主峰位置与对照品保留时间一致 ,空白肠灌流液
在此色谱条件下无干扰。
12内标 (泼尼松龙) 　22雷公藤甲素
12internal standard ( Prednisolone) 　22t riptolide
图 1 　空白肠灌流液( A) 、雷公藤甲素与内标对照品溶液( B)和供试液( C)的 UPLC图
Fig. 1 　UPLC Chromatograms of blank perfusion solution ( A) , triptolide and internal standard ( B) , and sample ( C)
21 11 2 　溶液的配制 :雷公藤甲素储备液的配制 :精
密称取雷公藤甲素 9100 mg 置 10 mL 量瓶 ,用甲醇
溶解定容至刻度 ,即得 215 mmol/ L 的雷公藤甲素
储备液。泼尼松龙内标液的配制 :精密称取泼尼松
龙 18123 mg , 加入甲醇定容至 10 mL , 即得 5
mmol/ L 储备液。使用前用甲醇稀释至 20μmol/
L ,备用。HBSS 溶液的配制 :精密称取 CaCl2 0. 14
g、MgSO4 ·7 H2 O 0. 245 g、KCl 0. 4 g、NaCl 9. 164
g、KH2 PO4 0. 06 g、Na2 H PO4 ·12 H2 O 0. 126 g、
D2葡萄糖 415 g、Na HCO3 0. 37 g、H EPES 5. 96 g ,
加水稀释至 1 000 mL ,用 5 mol/ L NaO H 调节 p H
值至 7. 4。
21113 　样品处理 :分别精密移取各肠段不同时间段
的流出液 400μL ,置于 115 mL 离心管中 ,加入 100
μL 内标溶液 ,涡旋混匀 ,14 000 r/ min 离心 15 min
后 ,取上清液进样测定。
21114 　雷公藤甲素标准曲线的制备 :将雷公藤甲素
储备液用 HBSS 溶液分别稀释成 01625、1125、
2150、5100、10100、20100、25100μmol/ L 的系列标
准溶液 ,取上述各溶液 400μL ,与 100μL 内标溶液
混匀离心后取上清液进样。以浓度 (μmol/ L) 为横
坐标 ,雷公藤甲素与内标峰面积比为纵坐标 ,进行线
性回归。计算回归方程 : Y = 01209 3 X - 01012 8 ,
r
2
= 0. 999 9。雷公藤甲素在 01625～25μmol/ L 线
性良好。
21115 　回收率的测定 :精密吸取雷公藤甲素储备液
适量 ,用空白肠灌流液配制成低、中、高 ( 1125、
5100、20100μmol/ L) 3 个添加浓度 ,按“样品处理”
项下方法操作 ,在上述色谱条件下测定 ,以标准曲线
计算浓度 ,以测定浓度与加入浓度之比计算回收率。
结果 3 个浓度的回收率分别为 (104146 ±1170) %、
(99153 ±031) %、(99164 ±0137) % ( n = 5) 。
21116 　精密度考察 :取 21115 项下 3 个浓度的待测
溶液 ,以 1 d 内测定同一样品 5 次的结果计算日内
精密度 ,以连续 5 d 测定同一样品的结果计算日间
精密度。根据标准曲线分别计算雷公藤甲素的浓
度 , 结果日内精密度 RSD 为 0171 %、0131 %、
0137 % , 日 间 精 密 度 RSD 分 别 为 1137 %、
1106 %、0145 %。
21117 　稳定性考察 :精密量取雷公藤甲素储备液适
量 ,分别用不同 p H 值 ( 515、616、714、810 ) 的
HBSS 溶液稀释成 4、10、20μmol/ L 3 个浓度。将
上述配制的不同 p H 值的溶液用塞子封闭 ,置于
37 ℃恒温水浴中 ,分别于 0、1、2、4、8、12、24 h 取
·78·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
样 ,按“样品处理”项下方法操作 ,在上述色谱条件下
测定 ,以药物残留百分比自然对数值对时间作图 ,按
一级动力学方程求得不同 p H 值时的降解反应常
数。结果 4、10、20 μmol/ L 的雷公藤甲素在
p H5. 5～8. 0 范围内的降解反应常数分别为
(0168～1126) ×10 - 3 、(0117～6175) ×10 - 3 、(1134～
4153) ×10 - 3 , 表明不同浓度的雷公藤甲素在
p H 5. 5～8. 0 范围内降解很少 ,24 h 内均比较稳定。
212 　大鼠在体肠吸收实验[4 ] :实验前将大鼠禁食过
夜 (自由饮水) ,im 0. 2 g/ mL 乌拉坦溶液麻醉 (5
mL/ kg) ,固定 ,沿腹中线切口 4 cm 打开腹腔 ,分别
在十二指肠、空肠、回肠、结肠 4 个肠段插入导管 ,用
线结扎固定 ,插管后将小肠部分小心放回肠腔 ,尽可
能避免卷曲和扭结。切口用等渗生理盐水浸润的纱
布覆盖以保湿 ,用 37 ℃恒温的生理盐水以 5 mL/
min 的体积流量将肠内容物冲洗干净。将进口管隔
离 ,在 37 ℃循环水浴中保持灌注温度恒定。取预
热至 37 ℃的供试药液 50 mL ,以 012 mL/ min 的
体积流量灌流 ,平衡 30 min 后 ,每隔 30 min 分段收
集流出液 ,并精确称定流出液质量 ,实验结束后 ,测
量各肠段长度。出口管中药物浓度采用 211 项下方
法检测。
213 　数据分析[ 5 ] :小肠不仅吸收药物 ,也吸收和分
泌水份 ,导致灌流液体积变化 ,因此 ,不能用直接测
定药物浓度的方法计算药物的吸收。本实验采用质
量分析法对灌流液的流入和流出的体积进行校正 ,
消除其体积变化的影响。药物的肠壁有效渗透系数
( Peff 3 ) 计算公式如下 :
Cout (corr) = Cout ×Qout / Qin
Peff 3 = (1 - Cout (corr) / Cin) / 4 Gz
Paq 3 =〔A ·( Gz) 1/ 3〕- 1
A = 1010 Gz + 1101 　01004 ≤Gz ≤0101
A = 415 Gz + 11065 　0101 ≤Gz ≤0103
A = 215 Gz + 11125 　0103 ≤Gz
式中 Cout (corr) 为出口溶液的校正浓度 , Cout为出口处的药物浓
度 (nmol/ L) ,Qout为出口溶液的流出流速 ( nmol/ L ) , Qin为
入口溶液的流速 ( nmol/ L ) 。Gz ( Gz =πDL / 2Q) 为流速
( Q) 、小肠长度 (L) 和扩散系数 ( D) 无因次的渗透性换算
因子 , A 为小肠持水性因子
214 　药物在不同肠段吸收情况的考察 :用 HBSS
溶液配制雷公藤甲素浓度为 20μmol/ L 的供试品
溶液 ,按照 212 项下操作 ,考察其在大鼠十二指肠、
空肠、回肠和结肠中的吸收情况。实验考察的分段
肠段区间均取约 10 cm ,各肠段区间如下 :十二指肠
段为距幽门 1 cm 处开始往下取 10 cm ;空肠段为距
幽门 15 cm 处开始往下取 10 cm ;回肠段为从回盲
连接处 2 cm 开始上行取 10 cm ;结肠段为从回盲连
接处 2 cm 开始往下取 10 cm。计算雷公藤甲素在
各个肠段的 Peff 3 和 10 cm 肠段吸收百分比 ( 10
cm % ABS) ,结果见表 1。可见 ,雷公藤甲素在各肠
段的 Peff 3 和 10 cm % ABS 按十二指肠、结肠、空肠
和回肠的顺序依次降低。经 SPSS 1310 统计软件
分析 ,结果表明雷公藤甲素在各肠段之间的 Peff 3 和
10 cm % ABS 两两比较均无显著性差异 ( P >
0105) ,说明雷公藤甲素在肠道内无明显的特定吸收
部位。
表 1 　雷公藤甲素在大鼠不同肠段的 Peff 3 和 10 cm % ABS 值
( x ±s , n = 4)
Table 1 　Peff 3 and 10 cm % ABS value of triptolide at various
intestine segments in rats ( x ±s , n = 4)
肠　段 Peff 3 (10 cm % ABS) / %
十二指肠 21 34 ±0110 42162 ±51 28
空肠 11 74 ±0126 32113 ±51 98
回肠 11 67 ±0126 31177 ±51 51
结肠 11 95 ±0123 36174 ±41 36
215 　不同药物浓度对肠吸收的影响 :取大鼠 12
只 ,每只分别取 4 个肠段各约 10 cm ,用低 (4μmol/
L) 、中 (813μmol/ L) 、高 (20μmol/ L) 3 种浓度的
灌流液按 212 项下方法分别灌流 ,计算 Peff 3 和 10
cm % ABS ,结果见表 2。经 SPSS 1310 统计软件分
析 ,结果表明雷公藤甲素在浓度为 4～20μmol/ L
的吸收参数均无显著性差异 ( P > 0105) ,提示雷公
藤甲素的肠吸收不受自身浓度的影响 ,主要表现为
被动扩散机制。
3 　讨论
　　药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄 (ADM E)
表 2 　不同浓度雷公藤甲素灌流对大鼠肠段中的吸收的影响
( x ±s , n = 4)
Table 2 　Effects of triptolide perfusion at different
concentration on its absorption in various
intestine segments of rats ( x ±s , n = 4)
肠　段 C/ (μmol ·L - 1) Peff 3 (10 cm % ABS) / %
十二指肠 4 2129 ±01 42 431 68 ±7107
813 2130 ±01 43 431 36 ±8102
20 2134 ±01 10 421 62 ±5128
空肠 4 1165 ±01 46 311 06 ±8167
813 1185 ±01 32 341 83 ±5199
20 1174 ±01 26 321 13 ±5198
回肠 4 1140 ±01 39 251 06 ±7142
813 1131 ±01 34 241 70 ±6147
20 1167 ±01 26 311 77 ±5151
结肠 4 2116 ±01 16 411 60 ±3192
813 2115 ±01 28 401 54 ±5121
20 1195 ±01 23 361 74 ±4136
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及毒性是药物的基本性质 ,决定了药物的安全性及
有效性 ,是研究药物药效及毒性的基础和关键。雷
公藤作为一种常用中药 ,临床广泛用于治疗类风湿
性关节炎、肾小球疾病、皮肤病及其他疾病。雷公藤
甲素是雷公藤中活性最高的环氧二萜内酯化合物 ,
是雷公藤的主要成分之一 ,同时也是雷公藤引起不
良反应的主要成分 ,对心、肝、骨髓、胸腺、脾、肾及生
殖系统等都有一定的毒性[ 6 ] 。目前上市的雷公藤制
剂一般多以雷公藤甲素的量为质控指标 ,采用口服
的形式用药 ,因此了解雷公藤甲素口服后体内的吸
收情况 ,对安全用药具有重要的指导意义。
311 　大鼠单向在体肠灌流的应用 :评价药物在肠道
吸收 (透过性) 的方法有离体法、在体法和体内法
等多种方法。本实验采用大鼠单向在体肠灌流法 ,
以较低的体积流量 (012 mL/ min) 对 4 段肠段分别
进行单向灌流 ,考察药物在不同肠段的吸收 ,该方法
在保证了肠道神经与内分泌输入的完好无损 ,以及
血液和淋巴液的供应的同时 ,实验条件与口服给药
后药物接触的肠道环境较接近 ,吸收速率稳定 ,与人
体有良好的相关性[5 ] 。
312 　质量分析法的应用 :大鼠在体肠灌流实验方法
基于测量灌流前后肠腔内药物浓度的变化 ,而小肠
在吸收药物的同时也吸收或分泌水份 ,肠腔内的水
份改变显著影响药物的浓度 ,因此有必要对其进行
校正。校正方法主要有酚红标示法、14 C2PEG 标示
法以及质量法。然而有文献报道 ,酚红本身能部分
被吸收以及对某些化合物的肠道转运或分析测定有
干扰 ,而14 C2PEG 存在放射性和安全性问题[ 7 ] ,故本
实验采用更为准确的质量分析法 ,用预先称质量的
具塞离心管收集一段时间的灌流液 ,实验结束后称
质量 ,通过计算质量差对灌流液的浓度进行校正[8 ] 。
313 　U PL C 检测方法的应用 :U PL C 是近年来新兴
的色谱技术 ,它的色谱柱使用 117μm 的填料作固
定相 ,使塔板数和分离度大大提高 ,并且缩短了分析
时间。它在精密度、准确性等方面与 HPL C 相近 ,
但灵敏度要高于 HPL C ,且分析时间短 ,流动相消
耗也较少[9 ] 。本实验首次建立了 U PL C 检测雷公
藤甲素的分析方法 ,能够快速、准确地分析检测
样品。
314 　雷公藤甲素的肠吸收特性 :文献报道雷公藤甲
素在大鼠体内生物利用度高 ,口服绝对生物利用度
为 72108 %[10 ] 。本实验考查了低、中、高 3 种浓度
(4、813、20μmol/ L) 的雷公藤甲素在十二指肠、空
肠、回肠以及结肠的吸收情况 ,测得雷公藤甲素在各
肠段的 Peff 3 值在 (1131 ±0134) ～ (2134 ±0110) ,
10 cm % ABS 值在 (24170 ±6147) %～ (43168 ±
7107) % ,各肠段吸收参数无显著性差异 ,结果表明
雷公藤甲素吸收较好 ,且在肠道内无明显的吸收部
位选择性 ;在不同药物浓度条件下 ,雷公藤甲素在小
肠的吸收参数无显著性差异 ,初步确定吸收机制为
被动扩散。
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