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Bennear M
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微柱离心HPLC法测定鬼臼毒素醇质体的包封率研究
于燕燕, 赵继会,冯年平*  ,翁海挺,张永太
(上海中医药大学中药学院, 上海
201203)
摘
要:目的
建立鬼臼毒素醇质体包封率的测定方法。方法
采用葡聚糖凝胶微柱离心法分离醇质体与游离药
物;用 H PLC 法测定醇质体中鬼臼毒素, 计算包封率。结果
在本法选择的色谱条件下, 鬼臼毒素得到良好的分
离,辅料不干扰测定, 鬼臼毒素在 2
5~ 101
1
g/ mL( r= 0
999 9)线性关系良好。微柱离心法能有效的将鬼臼毒
素醇质体与游离药物分离,用该方法测得鬼臼毒素醇质体的包封率为 51
03% , RSD 为 1
24% ( n= 3)。结论
建
立了微柱离心HPLC法 ,该方法便捷, 准确,重现性好, 可用于测定鬼臼毒素醇质体的包封率。
关键词:鬼臼毒素; 醇质体;微柱离心; 包封率
中图分类号: R286
02


文献标识码: A


文章编号: 02532670( 2010) 10163404
Entrapment efficiency of podophyllotoxinencapsulated ethosome
by minicolumn centrifugationHPLC
YU Yanyan, ZHAO Jihui, FENG N ianping , WENG H aiting, ZHANG Yongtai
( Co llgeg of Chinese Mat eria Medica, Shanghai Univ ersity of T raditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)
Abstract: Objective
To establish a method for determining the entrapment ef f iciency of podophyllo
to xin in etho somes
Methods
Glucose gel m inico lumn centrifug ation w as employed to separ ate the free
drug fr om the etho somes
The content of podophyllo to xin w as quant if ied by HPLC
Results
In the cur
r ent chromatog raph condition, the excipient had no inf luence on the determ inat ion o f podophyllo to xin
The
assay w as linear during the podophy llotox in concentrat ion range of 2
5- 101
1
g / mL ( r= 0
999 9)
The
ethosomes w ere well separated using the method o f minicolumn centrifugat ion
T he entrapment ef f iciency
of podophyllo to xinencapsulated ethosomes w as 51
03% , w ith RSD 1
24% ( n= 3)
Conclusion
The es
tablished m inico lumn centr ifugat ionHPLC method is simple, accurate, reproducible, and applicable fo r
the determination of ent rapment ef ficiency of podophyllo to xinencapsulated ethosomes

Key words: podophyllo to xin; ethosomes; minicolumn centrifugat ion; entr apment ef f iciency


鬼臼毒素是从小檗科植物桃儿七、八角莲或六
角莲的根及根茎中提取分离得到的木脂素类化合
物[ 1] , 它是世界卫生组织 ( WHO )推荐使用治疗尖
锐湿疣( CA)的一线药物,主要作用机制是通过其细
胞毒作用使受人类乳头瘤( HPV)感染的细胞死亡,
常用的是 0
5%鬼臼毒素酊剂。鬼臼毒素酊剂虽然
能去除肉眼可见的病变, 但过量大面积的使用会产
生严重的毒副作用,因此寻找低毒的鬼臼毒素衍生
物已成为现代抗肿瘤药物研究的热点[ 2]。通过脂质
体包封虽然能够减少不良反应, 但是其作用也仅限
于皮肤表层,所以难以消除皮肤深部的 HPV 潜伏
感染而导致其复发 [ 34]。醇质体( ethosomes)与普通
脂质体相比,显著提高了透皮速率、皮肤滞留量, 且
具有良好的生物相容性 [ 5]。包封率是评价醇质体质
量的重要指标[ 67]。目前常用于测定包封率的方法
有柱色谱法、渗析法、离心法等, 本实验采用微柱离
心法测定鬼臼毒素醇质体的包封率, 取得了较好的
效果。
1634 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100412





















基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划项目( NECT080898) ;上海市教委重点学科建设项目( J 50302)作者简介:于燕燕( 1982 ! ) ,女,江苏滨海人,讲师,博士, 2007 ! 2010年就读于上海中医药大学,现工作于上海应用技术学院,从事中药新型给药系统研究。Email: ssh nhyyy@ 163. com
* 通讯作者
冯年平
T el/ Fax: ( 021) 51322198
Em ail: n pfeng@ hotmail
com
1
仪器与试药
LC 2010 高效液相色谱仪 (日本岛津公司) ;
LXJ ! ∀B低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂) ;
CP225D微量电子分析天平(德国 Sartot ius公司)。
鬼臼毒素对照品(中国药品生物制品检定所, 批
号 111645200301) ; 鬼臼毒素原料药 (福建华海药
业公司,批号 081201) ; Sephadex G50葡聚糖凝胶
(瑞典 Pharmacia 公司) ;大豆磷脂(上海太伟药业有
限公司) ; 鬼臼毒素醇质体(自制, 含鬼臼毒素 3
5
mg/ mL,含磷脂为 5
0% W/ V, 乙醇体积分数为
30% ,平均粒径为 97 nm, 分散系数为 0
137) ; 甲醇
为色谱纯;其他试剂均为分析纯。
2
方法与结果
2
1
分析方法的建立
2
1
1
色谱条件: Diamonsil C18色谱柱( 250 mm #
4
6 mm, 5
m) ; 流动相:甲醇1%醋酸( 65∃ 35) ;检
测波长: 292 nm,体积流量 1 mL/ min;柱温: 25 % 。
2
1
2
标准曲线的绘制:精密称取鬼臼毒素对照品
25
28 mg ,置 25 mL 棕色量瓶中,乙醇稀释至刻度,
摇匀,得 1 011
2
g/ mL 对照品储备液。用乙醇分
别将对照品溶液稀释成 101
1、50
6、10
1、5
1、2
5

g/ mL,液相色谱仪进样 20
L 测定,以鬼臼毒素的
峰面积 ( A ) 对质量浓度 ( C ) 进行回归, 得 A =
12 808
31 C- 2 099
14( r= 0
999 9) ,结果表明鬼
臼毒素质量浓度在 2
5~ 101
1
g/ mL 与峰面积呈
良好的线性关系。色谱图见图 1。
图 1
空白醇质体( A)、鬼臼毒素对照品( B)、鬼臼毒素醇质体( C)色谱图
Fig
1
HPLC Chromatograms of blank ethosomes ( A) , podophyllotoxin reference substance ( B) ,
and podophyllotoxinencapsulated ethosmes ( C)
2
1
3
回收率试验: 精密量取空白醇质体 0
2 mL
于 10 mL 量瓶中, 依次准确加入鬼臼毒素储备液,
用乙醇定容, 配制成质量浓度为 10
1, 50
6, 101
1

g/ mL 供试品溶液; 另取相同质量浓度的鬼臼毒素
对照品溶液;分别精密量取上述溶液 20
L 注入液
相色谱仪进行测定, 结果低、中、高浓度回收率( n=
5)分别为 99
83% , 100
26% , 100
10% ; RSD 分别
为 0
73%, 0
81% , 0
29% 。
2
1
4
精密度试验:精密吸取鬼臼毒素醇质体 0
2
mL,置于 10 mL 量瓶中, 乙醇溶解并稀释至刻度,
摇匀得供试品溶液, 分别于 1天内测定 5次, 连续进
样 5 d,记录出峰面积,计算日内和日间精密度。结
果在该色谱条件下日内及日间精密度分别为
0
57%和 0
91% , RSD< 2%。
2
2
微柱离心对脂质体及游离药物的分离
2
2
1
微型凝胶柱的制备:将 Sephadex G50葡聚
糖凝胶浸泡在蒸馏水中, 100 % 煮沸 1 h,充分溶胀后
冷却,装入 2
5 mL 注射器。待水分自然留下,将注射
器置于离心机, 3 000 r/ min 离心 3 min, 使凝胶柱失
水皱缩,皱缩后凝胶高度不得少于 2
5 cm,待用。
2
2
2
微型凝胶柱对空白醇质体的吸附:空白醇质
体中磷脂、乙醇的浓度及制备方法同鬼臼毒素醇质
体。精密量取空白醇质体 0
2 mL,加于微型凝胶柱
的顶端, 3 000 r/ min离心 3 m in, 收集离心液,继续
加入 0
2 mL 蒸馏水于凝胶柱的顶端, 3 000 r/ min
离心 3 min,连续洗脱 4次后, 合并 5次离心液用蒸
馏水定容至 10 mL, 另精密吸取 0
2 mL 空白醇质
体蒸馏水定容至 10 mL, 分别于 500 nm 处 [ 89]测定
上柱前后空白醇质体的吸附情况,经过 3次测定,上
柱后与上柱前空白醇质体 的回收率分别为
103
3%、98
5%、98
4%,表明 Sephadex G50对空
白醇质体基本无吸附。
2
2
3
微型凝胶柱对鬼臼毒素的吸附: 取浓度 3
5
mg/ mL 鬼臼毒素溶液 0
2 mL, 加于微型凝胶柱的顶
端, 3 000 r/ min离心 3 min,继续加入 0
2 mL 蒸馏水
于凝胶柱的顶端,连续洗脱 6次后,每次加入蒸馏水
的量改为 0
5 mL,再连续洗脱 16次, 每次收集的洗
脱液用蒸馏水定容至 0
5 mL。分别按 2
1
1项下色
谱条件检测药物量,并绘制洗脱曲线,结果见图 2。


可知,鬼臼毒素游离药物在第 9 次离心后的洗
脱液中被检出,说明 Sephadex G50 微型凝胶柱对
鬼臼毒素具有一定吸附能力, 回收率为 99
92%,
1635 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
图 2
微型凝胶柱对鬼臼毒素的洗脱曲线
Fig
2
Elution curve of podophyllotoxin on minicolumn
of Sephadex G50
RSD为 0
15%( n= 3)。
2
2
4
微型柱对空白醇质体及鬼臼毒素水溶液物
理混合物的分离:精密量取 0
2 mL 质量浓度为 3
5
mg/ mL 的鬼臼毒素 30%乙醇溶液及 0
2 mL 空白
醇质体溶液,离心方法同 2
2
3微型凝胶柱对鬼臼
毒素的吸附前 5次的洗脱液用乙醇破乳, 与其他洗
脱液注入高效液相色谱仪进行测定,并绘制洗脱曲
线,结果见图 3。
图 3
微型凝胶柱对空白醇质体及鬼臼毒素物理
混合物的洗脱曲线
Fig
3
Elution curve of blank ethosomes and podophyllo
toxin on minicolumn of Sephadex G50


可知,第 8次洗脱液中含有微量的鬼臼毒素, 微
型凝胶柱对物理混合物中鬼臼毒素的吸附能力没有
受到空白醇质体的影响。
2
2
5
微型柱对鬼臼毒素醇质体的分离:精密量取
鬼臼毒素醇质体 0
2 mL 上样于微型凝胶柱中,
3 000 r/ min离心 3 min,补加 0
2 mL 蒸馏水,再次
离心,连续洗脱 6次后,每次加入蒸馏水的量改为0
5
mL,再连续洗脱 16次,带乳光的流份用乙醇破乳,其
他流份定容至0
5 mL, HPLC测定浓度,绘制洗脱曲
线,结果见图 4。可知,微型凝胶柱能够较好的分离
含药醇质体与游离药物,微型柱对鬼臼毒素醇质体的
回收率为 99
85%, RSD为0
55%( n= 3)。
2
2
6
包封率的测定:精密量取 0
2 mL 醇质体溶
液,加入乙醇定容于 10 mL 量瓶中, 按 2
1
1 项下
图 4
微型凝胶柱对鬼臼毒素醇质体的洗脱曲线
Fig
4
Elution curve of podophyllotoxin ethosomes
on minicolumn of Sephadex G50
色谱条件检测总的药物量( WT )。精密量取 0
2 mL
醇质体溶液, 加于微型凝胶柱顶端, 3 000 r/ m in 离
心 3 min,再加入 0
2 mL 蒸馏水溶液, 再次离心,连
续 4次后合并洗脱液于 10 mL 量瓶中,加入乙醇定
容,注入 H PLC检测被包封药物的量(W E ) , 根据公
式 E = W E / W T # 100% , 结果平均 包封率为
51
03% , RSD为 1
24% ( n= 3)。
3
讨论
采用不同的有机试剂破坏醇质体,并溶解药物,
测定醇质体中的药物, 考察不同溶剂对醇质体的破
坏效果。结果 10% T riton X100不能完全破坏醇
质体,溶液有乳光;加入丙酮后溶液变浑浊;加入乙
醇和甲醇效果较好,能够完全溶解脂质囊泡,综合考
虑选择乙醇作为破坏醇质体的溶剂。
常用分离醇质体的方法有凝胶柱色谱法,超速
离心法, 超滤法等。笔者曾尝试采用超速冷冻离心
法,在 4 % , 15 000 r/ m in 条件下离心2 h,未能很好
的分离出醇质体, 在试管底部有极少量沉淀,乳光显
著,与未离心时几乎没有差异。改用 4 % , 80 000
r/ min离心 2 h, 出现了分层现象, 共三层, 上层为乙
醇水溶液,下层为醇质体沉淀,中间有一层占很多比
例的胶体溶液,上述实验说明超速冷冻离心法不能
够很好的将醇质体与游离药物乙醇水溶液分离开
来,可能因为醇质体的膜流动性较大,强大的离心力
造成了脂质囊泡的变形破裂造成了药物的泄露, 还
有一少部分的磷脂溶解于乙醇水溶液中形成了较小
的胶态溶液。采用凝胶柱色谱法分离醇质体及游离
药物,由于极大的稀释了醇质体而造成包封在囊泡
中的药物泄露严重。采用超滤离心法分离醇质体和
游离药物,由于醇质体的黏度较大,选择相对分子质
量为10 000及 30 000的超滤管, 4 % , 15 000 r / min
离心时,醇质体不能透过超滤膜。
在分离醇质体和游离药物实验过程中发现使用
1636 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
水平式离心机效果较好, 且离心速度及时间对微型
凝胶柱的分离能力有很大影响, 转速过低则醇质体
的洗脱速度较慢, 稀释倍数增大, 造成药物的泄露;
转速过高则容易引起凝胶柱的断裂而导致分离效果
不好。经实验证实, 3 000 r/ min离心 3 min 能够达
到理想的分离效果。
洗脱游离药物过程中,为加快速率,将洗脱体积
加大至每次 0
5 mL,既节约了时间又达到了较好的
分离效果。
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银杏内酯注射液的 HPLC指纹图谱研究
章晨峰1, 2 ,付小环2 , 毕宇安2 , 尚
强2 ,王振中2 ,盛龙生1 * 
( 1
中国药科大学,江苏 南京
210009; 2
江苏康缘药业股份有限公司, 江苏 连云港
222001)
摘
要:目的
建立银杏内酯注射液的合适质量控制方法。方法
采用 H PLC/ ELSD 法, 指纹图谱相似度用中药
色谱指纹图谱相似度评价系统(版本 2004A )计算。结果
10 批注射液的指纹图谱相似度均大于 0
95,确定了 4 个
共有峰,建立了该注射液的指纹图谱。结论
本法可作为银杏内酯注射液的质量控制方法。
关键词:银杏内酯注射液; 指纹图谱; H PLC/ ELSD
中图分类号: R286
02


文献标识码: A


文章编号: 02532670( 2010) 10163703
HPLC Fingerprint of Ginkgolide Injection
ZHANG Chenfeng1, 2 , FU Xiaohuan2 , BI Yuan2 , SHANG Q iang2 , WANG Zhenzhong2 ,
SHENG Longsheng1
( 1
China Pharmaceutical U niversit y, Nanjing 210009, China; 2
Jiangsu Kanion Pha rmaceutica l Co
, L td
,
L ianyungang 222001, China)
Abstract: Objective
T o establish the proper quality cont ro l method for Ginkgo lide Inject ion
Methods
The Ginkgo lide Injection w as analyzed by using HPLC/ ELSD technolog y
The sim ilar ity of f ing erprints
w as calculated by the S imi lar ity Ev aluation Sy stem f or Chromatographic Fingerp rint of Chinese T radi
tional M edicine ( Version 2004A )
Results
Similarity o f ten batches of inject ions w as all over 0
95
The
fingerprint for Ginkgo lide Inject ion was established and four common peaks w ere indicated
Conclusion

This method is suitable for the quality cont rol of Ginkgolide Inject ion

Key words: Ginkgo lide Injection; fingerprint ; HPLC/ ELSD


银杏内酯是银杏叶中含有的一组具有较强生物 活性的萜类化合物, 已分离得到的包括银杏内酯
1637 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100415





















基金项目:国家 863计划课题( 2002AA2Z3215, 2005AA2Z3E60)作者简介:章晨峰( 1976 ! ) ,男,江西抚州市人,工程师,博士,主要从事中药质量控制方法研究。
T el : ( 0518)85521955
Email: zh angchen f@ 163
com
* 通讯作者
盛龙生
T el: ( 025) 83307338
Email: sh englsh@ yahoo
com
cn