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北柴胡移栽试管植株与种子植株中皂苷的动态分析
郝建平1 ,王丽荣1 ,徐笑飞1 ,秦雪梅2 , 张丽增2 , 赵玉臣3*
( 11 山西大学 生命科学学院, 山西 太原 030006; 21 山西大学中医药现代研究中心,山西 太原 030006;
31 山西省药物培植场, 山西 绛县 043610)
摘 要:目的 为应用离体快速繁殖技术进行北柴胡优良种质选育提供实验依据。方法 应用分光光度法测定北
柴胡移栽试管植株不同生长期的根、茎叶中柴胡总皂苷的量,应用柱前衍生化 HPLC-UV 法测定柴胡皂苷 a和 d
的量,并以同型、同时的种子植株作为对照。结果 北柴胡试管植株根、茎叶中柴胡总皂苷及皂苷 a 和 d 的量在试
管苗阶段最低,在一年生植株中最高, 在两年生植株中的营养生长期次高, 在花期、果期、枯萎期依次降低; 在根中
的量远高于茎、叶; 引种自山西左权的移栽试管植株的量均高于引种自山西陵川和万荣的类型;移栽试管植株根、
茎叶中的量均高于相同类型的种子植株中的量。结论 离体快速繁殖是纯化北柴胡种质和提升药材品质、提高药
材产量的有效方法;快速繁殖植株具有优良的遗传稳定性 ,选择综合性状好的种质作为繁殖的起始材料, 能够保证
后代性状的优良和整齐一致;果期二级花序的种子成熟期为移栽试管植株根的适宜采收期。
关键词:北柴胡; 试管植株;种子植株; 柴胡皂苷
中图分类号: R2821 6 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1527-04
Dynamic analysis of saikoside in tes-t tube plants of Bupleurum chinense
compared with seeding plants
HAO Jian-ping1 , WANG L-i rong1 , XU Xiao- fei1 , QIN Xue-mei2 , ZHANG L-i zeng 2 , ZHAO Yu-chen3
( 11 School of L ife Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 21Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine,
Shanx i Univ ersity , T aiyuan 030006, China; 31 Cultivat ing H erbs Farm o f Shanx i P rov ince, Jiang Count y 043610, China)
Abstract: Objective T o prov ide a scient ific basis for breeding on Bup leurum chinense by r apid propa-
gation method in v it ro1 Methods Pre-column derivat izat ion HPLC-U V and v isible-spect rophotometry
methods w er e used to determine the contents o f saiko saponin a, saikosaponin d, and saikosaponins in the
root and aerial part of test- tube plants of B1 chinense in dif ferent grow ing per iods, and compared w ith see-
ding plants of same breeding and g row ing periods1 Results The contents of saikosaponins, saiko saponin
a, and saiko saponin d w ere minimum in r oots, stems, and leaves of plantlets1 They w ere the uppermost in
annual test- tube plants, and w ere the second at vegetative grow th phase of biennial test- tube plants1 The
contents w er e reduced ordinally at bud form ing phase, seed r ipening phase, and w ilt ing phase of biennial
test- tube plants1 T he content in the roo t w as much higher than that in aerial par t of test- tube plants1 The
contents of test- tube plants w hich w ere int roduced from Shanx i Zuoquan w ere higher than which f rom
Shanxi Wanrong and Lingchuan1 The content in method o f B1 chinense breeding w as an ef fect ive w ay to
maintain and improve the yield in roots, stems, and leaves of test- tube plants w ere higher than those in
seeding plants1 Conclusion The r apid propagat ion in vi tr o is an effect ive method for purify ing germplasm
of B1 chinense and ascending honew o rt medicinal material quality and y ield1 The genetic stability of rapid
#1527#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 11-11 基金项目:山西省科技攻关计划项目( 20100311091)作者简介:郝建平( 1959 ) ) ,男,山西省忻州市人,山西大学生命科学学院副教授,硕士研究生导师,主要从事植物细胞工程的教学和研究工作,已发表相关研究论文 70余篇。 E-mail: jph ao@ sxu . edu. cn
propagat ion plants are excellent , so the star ting material should have excellent comprehensive t raits to en-
sur e of fspring w ith good characters and uniformity1 The seed maturing stag e in the secondary inflo rescence
is suitable harv est t ime for the r oot1
Key words: Bup leur um chinense DC1 ; test- tube plants; seeding plants; saikosaponin
近年来,国家出台了一系列促进中医药现代化
的政策和规定, 对中医药产业的扶持力度不断加大,
对中药材的种植和药材质量提出了更高的要求。北
柴胡是我国的传统常用大宗药材,主要以干燥根入
药。在北柴胡人工种植中, 普遍存在种源混杂和种
子成熟度不均一、发芽率低等问题, 种质纯化、品种
选育以及资源的保护已经成为柴胡产业可持续发展
的关键问题。离体快速繁殖方法是北柴胡优良种质
培育的有效手段 [ 1-4] 。本研究测定了不同生长期北
柴胡试管苗移栽植株根、茎叶中柴胡总皂苷及皂苷
a和 d的量,并与相同类型的种子植株进行了比较,
为确定移栽试管植株的生药学品质以及离体快速繁
殖技术应用于优良种质的选育提供实验依据。
1 材料与仪器
1. 1 材料来源:试验用北柴胡 Bup leur um chinense
DC1 试管植株由本课题组自行培育并移植至田间;
种子植株分别种植于山西太谷、绛县和左权,由山西
农业大学农学院王玉庆教授和山西省药物培植场赵
玉臣主管中药师鉴定(表 1)。
1. 2 仪器与试剂: UV2602紫外-可见分光光度计,
表 1 北柴胡材料来源
Table 1 Sources of B1 chinense
样品代号 样 品 生长年限 生长期 取材地 原产地
LB试 试管苗 1 生根 2个月后 组培室 山西陵川
LB移 移栽试管植株 1 移入田间 5个月后 试验田 山西陵川
LB营 移栽试管植株 2 营养生长期 试验田 山西陵川
LB花 移栽试管植株 2 花期 试验田 山西陵川
LB果 移栽试管植株 2 果期 试验田 山西陵川
LB枯 移栽试管植株 2 枯萎期 试验田 山西陵川
WB移 移栽试管植株 2 花期 试验田 山西万荣
ZB移 移栽试管植株 2 花期 试验田 山西左权
LB太 种子植株 2 花期 太谷 山西陵川
WB太 种子植株 2 花期 太谷 山西万荣
LB绛 种子植株 2 花期 绛县 山西陵川
WB绛 种子植株 2 花期 绛县 山西万荣
ZB左 种子植株 2 花期 左权 山西左权
Waters 1525高效液相色谱仪, Waters 2487双波长
紫外检测器, Breeze色谱工作站。
柴胡皂苷 a 和 d 标准品(质量分数均为 98% )
由中国药品生物制品检定所提供,乙腈为迪马公司
产色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为重蒸水。
2 方法
应用李媛媛等[ 5] 建立的分光光度法和柱前衍生
化 HPLC-U V法分别测定柴胡总皂苷及柴胡皂苷 a
和 d的量。
3 结果与分析
3. 1 北柴胡中柴胡总皂苷及皂苷 a和 d的测定:对
一年生陵川移栽试管植株根进行测定。图 1为对照
品和样品的 HPLC 色谱图。
由图 1-C 可以看出, 在 8 m in 时开始出第 1个
吸收峰, 即柴胡皂苷 d; 12 m in时开始出第 2个吸收
峰,为柴胡皂苷 a。
图 1 柴胡皂苷 a(A)、d(B)和陵川移栽试管植株根样品( C)的 HPLC色谱图
Fig. 1 HPLCChromatogram of saikosaponin a ( A) , saikosaponin d (B) , and sample-root of Lingchuan tes-t tube plants (C)
#1528# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
3. 2 陵川北柴胡试管植株在不同生长期中根、茎叶
中皂苷量的变化:如表 2所示,在陵川北柴胡试管植
株的整个生长期中, 试管苗阶段根、茎叶中柴胡总皂
苷、皂苷 a和 d的量均处于最低水平,根中柴胡总皂
苷的量为 0. 094 7%,皂苷 a为 0. 005 5%,皂苷 d为
0. 006 2% ;茎叶中 3种皂苷的量均低于 0. 001 0%。
试管苗各营养器官中皂苷的量均低于/柴胡总皂苷
不低于 1. 00%,皂苷 a不得低于 0. 100%、皂苷 d不
得低于 0. 200%0的质量标准 [ 5]。北柴胡试管苗年
繁殖系数达 1 @ 108 株,繁殖速度快[ 1-2] , 主要以营养
生长为主,使得次生代谢产物的合成量很少, 因而在
试管苗生长阶段柴胡总皂苷、皂苷 a 和 d的量很低。
表 2 不同生长期试管苗(陵川 )根、茎叶中柴胡皂苷 a 和 d
的量
Table 2 Determination of saikosaponins a and d in roots,
stems, and leaves of Lingchuan tes-t tube
plants in different growing periods
样品
根
柴胡皂
苷 a/ %
柴胡皂
苷 d/ %
柴胡总
皂苷/ %
茎 叶
柴胡皂
苷 a/%
柴胡皂
苷 d/%
柴胡总
皂苷/%
LB试 0. 005 5 0. 006 2 0. 094 1 - - -
LB移 0. 201 5 0. 364 7 1. 967 3 0. 039 6 0. 054 7 0. 235 1
LB营 0. 189 1 0. 362 4 1. 893 0 0. 037 2 0. 054 9 0. 207 4
LB花 0. 162 9 0. 334 6 1. 734 6 0. 027 7 0. 049 7 0. 196 3
LB果 0. 158 3 0. 326 9 1. 602 8 0. 020 9 0. 024 3 0. 180 5
LB枯 0. 132 9 0. 274 1 1. 496 3 0. 010 2 0. 012 5 0. 106 7
一年生和两年生陵川北柴胡移栽试管植株根中
的柴胡总皂苷、皂苷 a 和 d的量均大于质量标准 [ 5] ,
其中一年生移栽试管植株中柴胡总皂苷、皂苷 a 和
d的量分别达到 1. 967 3%、0. 201 5%和0. 364 7% ,
均高于两年生移栽试管植株。在两年生移栽试管植
株中,营养生长期中柴胡总皂苷、皂苷 a和 d 的量最
高,分别为 1. 893 0%、0. 189 1%和 0. 362 4% ;在花
期、果期较低; 枯萎期处于最低水平, 分别为
1. 496 3%、0. 132 9%和 0. 274 1%。这一规律与沈
志滨等 [ 6]在北柴胡种子植株中所得到的结果基本一
致。柴胡皂苷主要分布在北柴胡根部的维管形成层
和次生韧皮部中 [ 7] ,虽然一年生植株根的半径小于
两年生的, 但其韧皮部与木质部面积之比大于后
者[ 6] ,因此, 一年生移栽植株的皂苷的量高于两年生
的植株。移栽试管植株生长旺盛,花序数和果序数
多[ 3] ,在花期和果期以生殖生长为中心,影响到柴胡
皂苷的合成与积累。枯萎期植株为越冬做准备而使
高分子物质分解转化, 使皂苷的量降低[ 8]。由表 2
可以看出,在陵川北柴胡试管植株的各生长期中, 茎
叶中的柴胡皂苷的动态变化规律与根中的基本一
致,但远远低于根中的量。
3. 3 陵川北柴胡移栽试管植株根的适宜采收期:一
年生陵川北柴胡移栽试管植株根产量低,两年生移栽
植株在营养生长期和花期根的产量持续增加。综合
考量根产量和种子产量等经济效益影响因素,营养生
长期和花期均不宜作为根的主要采收期。果期的柴
胡皂苷的量较营养期和花期低, 但高于枯萎期, 因此
可以考虑在果期采收根。北柴胡属于有限花序、无限
分枝型植株[ 9] ,各级花序的种子成熟不同步,种子主
要来自顶花花序、一级花序和二级花序,根长、根质量
在花、果期仍然在增长和增加。因此,选择二级花序
种子的成熟时期作为根的采收期比较适宜。
3. 4 陵川、万荣及左权北柴胡试管植株中柴胡皂苷
量的比较:如表 3所示,原产于三地的两年生的北柴
胡移栽试管植株根中的柴胡总皂苷、皂苷 a 和 d的
量均高于茎叶。根中柴胡总皂苷和皂苷 d的量以左
权北柴胡最高,分别达到2. 102 1%和 0. 487 1% ,其
次为万荣北柴胡, 陵川北柴胡的量最低;皂苷 a 的量
为万荣北柴胡> 左权北胡柴> 陵川北柴胡,但万荣
北柴胡与左权北柴胡中的量相差不大, 分别为
0. 188 3%和 0. 187 4%。茎叶中柴胡总皂苷和皂苷
a的量为左权北柴胡> 陵川北柴胡> 万荣北柴胡,
皂苷 d的量为陵川北柴胡> 左权北柴胡> 万荣北柴
胡。北柴胡中的主要活性成分为总皂苷类, 皂苷 a
和 d仅仅是其活性较高的成分, 评价药材质量以总
皂苷为主,兼顾皂苷 a和 d的量[ 10] 。左权北柴胡移
栽试管植株根、茎叶中皂苷的量最高。北柴胡移栽
试管植株不同类型间存在柴胡皂苷量的差异,说明
种源是影响移栽试管植株皂苷量多少的主要因素。
因此,在应用离体快速繁殖技术进行种质纯化和品
种选育时,应当选择综合性状优良、有效成分量高的
类型作为起始材料。
表 3 花期移栽试管植株与种子植株的柴胡皂苷 a和 d的量
Table 3 Determination of saikosaponins a and d
in roots and aerial part of tes-t tube plants
and seeding plants at bud forming phase
样品
根
柴胡皂
苷 a/%
柴胡皂
苷d/%
柴胡总
皂苷/%
茎 叶
柴胡皂
苷 a/ %
柴胡皂
苷 d/ %
柴胡总
皂苷/ %
LB花 0. 162 9 0. 334 6 1. 734 6 0. 027 7 0. 049 7 0. 196 3
WB移 0. 188 3 0. 368 7 1. 685 2 0. 025 6 0. 031 5 0. 176 0
ZB移 0. 187 4 0. 487 1 2. 102 1 0. 029 0 0. 041 3 0. 197 4
LB太 0. 133 4 0. 254 3 1. 497 5 0. 013 6 0. 011 9 0. 132 1
WB太 0. 117 8 0. 271 2 1. 629 0 0. 013 8 0. 028 0 0. 109 4
LB绛 0. 128 4 0. 285 9 1. 520 6 0. 009 4 0. 017 9 0. 184 0
WB绛 0. 148 9 0. 358 1 1. 681 3 0. 021 3 0. 030 1 0. 163 9
ZB左 0. 186 7 0. 482 3 2. 046 8 0. 028 1 0. 032 4 0. 188 9
#1529#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
3. 5 两年生移栽试管植株与种子植株皂苷量的比
较:由表 3可以看出,两年生北柴胡移栽试管植株的
根、茎叶中柴胡总皂苷及皂苷 a和 d的量均高于其同
类型的种子植株中的量,说明在北柴胡移栽试管植株
中皂苷的量较种子植株具有优势。移栽试管植株的
根为诱导产生的不定根(图 2-A) , 与种子植株具分枝
的直根(图 2-B)相比,多条直径基本相等的不定根有
效地提高了根中韧皮部与木质部面积的比值,从而提
高了柴胡皂苷的量,提高了单株根的产量和质量。
图 2 两年生陵川北柴胡移栽试管
植株( A)和种子植株( B)的根
Fig. 2 Root of biennial tes-t tube plants ( A) and seeding
plants (B) of Lingchuan B1 chinense
4 结论
北柴胡移栽试管植株根的产量高, 根中各种皂
苷的量均高于质量标准, 亦高于同类型种子植株中
的量;茎叶中的皂苷的量与种子植株相当。此外, 试
管苗的年繁殖系数高、生长周期短 [ 1-2] , 移栽至田间
后表现出优良的植物学性状 [ 3]。因此, 离体快速繁
殖方法是选育优良北柴胡种质、提高药材产量和品
质的有效途径。
北柴胡移栽试管植株柴胡皂苷的动态变化规律
为试管苗期的量最低, 一年生植株的量高于两年生
的,营养生长期、花期、果期、枯萎期的量依次降低。
综合根和种子产量等因素,确定果期二级花序种子
成熟时期为根的适宜采收期。
北柴胡移栽试管植株具有良好的遗传稳定性。
选择综合性状优良、有效成分量高的种质作为起始
材料,能够从源头上保证后代具有优良的性状和药
材品质。
在北柴胡移栽试管植株的茎、叶中也含有柴胡
皂苷,其量与种子植株相当,故亦可全草入药。
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马比木的显微荧光组织学定位及其中喜树碱的变化研究
吕江明1 ,刘世彪2* ,蔡其辉2 ,田向荣2*
( 11 吉首大学医学院,湖南 吉首 416000; 21 吉首大学 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室, 湖南 吉首 416000)
摘 要:目的 对马比木 Nothap oty es p ittosp or oides 中的喜树碱进行组织学定位 ,并测定不同产地、不同生长季节
和不同部位的马比木中喜树碱的量。方法 采用荧光显微技术进行喜树碱的定位, 高效液相色谱法进行测定。
Hyper sil ODS2 色谱柱( 250 mm @ 4. 6 mm, 5Lm) , 以乙腈-水( 6 B 4)为流动相梯度洗脱, 体积流量 1. 0 mL/ min, 柱
温20 e , 检测波长 254 nm。结果 马比木中喜树碱主要积累于根部和茎部的韧皮部的分泌细胞内; 喜树碱的量具
有季节性变化规律, 夏季低, 春秋高; 细根中喜树碱的量最高, 主根次之, 主茎、幼茎及叶的量依次递减。结论
马比木喜树碱主要贮藏于根部树皮内,不同产地、不同季节、不同部位的马比木植物中的喜树碱量差异较大。
关键词:马比木; 喜树碱;组织定位
中图分类号: R2821 6 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1530-05
#1530# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 11-21 基金项目:湖南省自然科学基金资助项目( 09JJ3051) ;湖南省生态学重点建设学科开放基金项目( J SS2009Z03)作者简介:吕江明( 1955 ) ) ,男,湖南凤凰人,高级实验师,主要从事药物学研究。 T el: ( 0743) 8759168 E- mail : ljm5928@ 163. com
* 通讯作者 刘世彪 T el: ( 0743) 8564416 E- mail: liushibiao_1@ 163. com