全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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注射用甘草酸纳米无菌粉对大鼠慢性肝损伤的影响
黄 岩 1, 2，祖元刚 1, 2*，张 琳 1, 2，赵修华 1, 2，赵 野 1, 2，曹 姗 1, 2
1. 东北林业大学 森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040
2. 东北林业大学 林业生物制剂教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150040
摘 要：目的 探讨注射用甘草酸纳米无菌粉对 CCl4 所致大鼠慢性肝损伤的影响。方法 采用超临界反溶剂法制备甘草酸
纳米粒，高压蒸气灭菌后制备注射用甘草酸纳米无菌粉；40 只大鼠随机分为 4 组（每组 10 只），分别为甘草酸单铵组、甘
草酸纳米粉组、模型组、对照组；除对照组外，其他 3 组大鼠 ig 50% CCl4-大豆油溶液 8 周以制备慢性肝损伤模型，随后甘
草酸单铵组、甘草酸纳米粉组分别 iv相应药物 1.71×10−5 mol/(kg·d)，连续 4周；测定大鼠肝脏指数，血清中碱性磷酸酶（ALP）、
丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）活性，肝组织匀浆液中羟脯氨酸（Hyp）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）
水平和铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）的活性，HE 染色、光镜观察肝脏病理变化。结果 与甘草酸单铵组相比，甘草
酸纳米无菌粉组血清中 ALP、ALT、AST 活性分别降低 29.68%、5.51%、3.97%；肝脏指数降低 3.42%，肝组织 Hyp 降低 15.67%、
SOD 升高 15.70%、GSH-Px 升高 6.56%。病理学检查结果可见，甘草酸纳米无菌粉组肝组织变性明显减轻，肝组织病变过
程得到缓解。结论 经过粒径改造的甘草酸无菌粉注射液对 CCl4所致大鼠慢性肝损伤有更好的治疗作用。
关键词：甘草酸；纳米无菌粉；超临界反溶剂法；慢性肝损伤；CCl4
中图分类号：R282.710.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)10 - 2060 - 05
Effects of sterile glycyrrhizic acid nanoparticles for injection on chronic liver
injury in rats
HUANG Yan1, 2, ZU Yuan-gang1, 2, ZHANG Lin1, 2, ZHAO Xiu-hua1, 2, ZHAO Ye1, 2, CAO Shan1, 2
1. Key Laboratory of Forest Plant Ecology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
2. Engineering Research Center of Forest Bio-preparation, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China

Key words: glycyrrhizic acid; sterile nanoparticles; supercritical anti-solvent process; chronic liver injury; CCl4

甘草酸是甘草的主要活性成分之一，具有抗溃
疡、抗病毒、抗癌等作用[1-3]，特别是保肝、治疗肝
脏疾病的特点[4]，可使其用于以抵抗由药物等引起
的急性肝毒性[5]，治疗肝纤维化、肝硬化等晚期肝
疾病。甘草酸在水中溶解度低，吸收缓慢，在一定
程度上限制了其应用。药物粒径改造可有效提高其
溶解性，在特定粒径范围内的药物 iv 后被单核-吞
噬细胞系统所吸收，主要分布在肝、脾，使其具有
较好的被动肝靶向性[6]。本实验观察超临界反溶剂
法联合高压蒸气灭菌法制备的甘草酸纳米无菌粉对
CCl4 致大鼠慢性肝损伤模型的治疗作用，并与甘草
酸注射液中的主要有效成分甘草酸单铵进行比较，
为纳米药物的应用提供借鉴与参考，为甘草酸纳米
制剂的临床应用提供理论依据。
1 材料
1.1 药品与试剂
甘草酸（质量分数为 98%），甘草酸单铵（质
量分数为 98.8%），均为中国江苏天晟药业公司。碱
性磷酸酶（ALP）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨
酸转氨酶（AST）、羟脯氨酸（Hyp）、谷胱甘肽过
氧化物酶（ GSH-Px ）、铜锌超氧化物歧化酶
（CuZn-SOD）检测用试剂盒，南京建成生物工程公
司产品；CCl4，分析纯，中国天津进丰化工公司；
大豆油，超纯水。

收稿日期：2011-03-07
基金项目：国家科技支撑计划项目（2006BAD18B04）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（DL09BA21）
作者简介：黄 岩（1987—），男，河南省南阳市人，硕士研究生，研究方向为植物化学与植物药。E-mail: hyrocky@163.com
*通讯作者 祖元刚 E-mail: zygorl@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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1.2 仪器
超临界二氧化碳反溶剂纳米粉体制备装置，由
本实验室自行研制[7]；GF—D300 型半自动生化分
析仪，山东彩虹高密分析仪器有限公司产品；Milli-
pore超纯水系统，美国Millipore 公司；LDZX—40BI
自动电热压力蒸气灭菌器，上海申安医疗器械厂生
产；Zetasizer—3000HS 激光粒度仪，英国 Malvern
公司产品；MX2600FE 扫描电子显微镜，英国
Camscan 公司产品。
1.3 动物
Wistar 大鼠 40 只，雌雄各半，体质量（200±
20）g，由哈尔滨医科大学附属肿瘤医院实验动物中
心提供，合格证号 SCXK（黑）2006-008。
2 方法
2.1 注射用甘草酸纳米无菌粉的制备
根据本实验室前期实验研究结果[8]，超临界二
氧化碳反溶剂法制备甘草酸纳米粒的最佳制备过
程：将甘草酸溶于无水乙醇中配制成 10 mg/mL 溶
液，在压力 20 MPa、温度 90 ℃、CO2 流量为 10.6
kg/h、甘草酸乙醇溶液体积流量为 20 mL/min 条件
下，采用超临界 CO2 抗溶剂微纳米粉体制备装置制
备[9]，得到甘草酸纳米粒，高压蒸气灭菌后封装备
用。在使用前，将甘草酸纳米粒按 5 mg/mL 的质量
浓度溶解于超纯水中，0.45 μm 滤膜滤过，直接用
于注射。
2.2 分组、造模与给药
40 只 Wistar 大鼠随机分为 4 组，每组 10 只，
分别为甘草酸单铵组、甘草酸纳米无菌粉注射液（简
称甘草酸纳米粉）组、模型组、对照组。除对照组
外，其余各组 ig 50% CCl4-大豆油溶液 1 mL/kg，每
周 2 次，持续 8 周，制备慢性肝损伤大鼠模型。随
后给药组 iv 给予相应药物 1.71×10−5 mol/(kg·d)，
连续 4 周，对照组和模型组给以相同剂量的注射用
去离子水。末次给药后 24 h，采集血清及肝脏标本
待测。
2.3 检测指标
按试剂盒说明书检测血清 ALP、ALT、AST 活
性。处死大鼠，迅速剥离肝脏，冰冷生理盐水迅速
漂洗以除去血液，滤纸拭干。称肝脏质量，计算肝
脏指数（肝脏指数=肝质量/大鼠质量）；切取肝左
叶 0.2～1.0 g，制备一定浓度的肝组织匀浆液，按
试剂盒说明书测定 Hyp、GSH-Px 水平、CuZn-SOD
活性。
2.4 肝组织病理学观察
大鼠肝右叶常规切片，HE 染色，显微镜下（×
400）观察组织病理学。并按照以下标准[10]进行评
分：1 分（−）：肝小叶结构完整，肝细胞整齐，无
异常；2 分（+）：肝细胞局限性变性、轻微纤维化、
灶状坏死，有少量炎细胞浸润；3 分（++）：肝细胞
弥漫性变性、坏死、纤维化、局限性坏死，肝小叶
结构改变，有较多炎细胞浸润。4 分（+++）：肝细
胞弥漫性变性、坏死、纤维化较重，肝小叶结构严
重破坏，大量炎细胞浸润。
2.5 数据处理
所有数据以 SPSS V17.0 软件进行统计分析，包
括方差分析，组间比较采用 t 检验。
3 结果
3.1 甘草酸纳米粉收率与粒径
本实验制备得到的甘草酸纳米粉收率为 89.2%，
经激光粒度仪测定其平均粒径为（100±30）nm。由
扫描电镜图像（图 1）可进一步验证其粒径范围。

图 1 甘草酸原料和甘草酸纳米粉的扫描电镜图像
Fig. 1 SEM images of glycyrrhizic acid and glycyrrhizic
acid nanoparticles
3.2 对慢性肝损伤大鼠血清 ALP、ALT、AST 活
性的影响
与对照组相比，模型组 ALP、ALT、AST 活性
显著升高（P＜0.01），表明造模成功；与模型组相
比，甘草酸单铵组和甘草酸纳米粉组 ALP、ALT、
AST 活性均显著降低（P＜0.01）；与甘草酸单铵组
相比，甘草酸纳米粉组 ALP、ALT、AST 活性分别
降低 29.68%、5.15%、3.97%，表明甘草酸纳米粉的
效果优于甘草酸单铵。结果见图 2。
3.3 对慢性肝损伤大鼠肝脏指数的影响
与对照组相比，模型组大鼠肝脏指数显著升高
（P＜0.01）。与模型组相比，甘草酸单铵组与甘草酸
纳米粉组肝脏指数均显著降低（P＜0.05）。与甘草
酸单铵组相比，甘草酸纳米粉组肝脏指数降低了
3.42%。结果见图 3。

甘草酸原料（×1 000） 甘草酸纳米粉（×60 000）
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：▲▲P＜0.01
**P<0.01 vs control group; ▲▲P<0.01 vs model group
图 2 甘草酸纳米粉对慢性肝损伤大鼠血清 ALP、ALT、AST
活性的影响 ( 01=± n , sx )
Fig. 2 Effects of glycyrrhizic acid nanoparticles on activities
of ALP, ALT, and AST in serum of chronic liver
injury rats ( 01=± n , sx )

与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：▲P＜0.05
**P<0.01 vs control group; ▲P<0.05 vs model group
图 3 甘草酸纳米粉对慢性肝损伤大鼠肝脏指数的影响
( 01=± n , sx )
Fig. 3 Effects of glycyrrhizic acid nanoparticles on liver
index of chronic liver injury rats ( 01=± n , sx )
3.4 对慢性肝损伤大鼠肝组织 Hyp、GSH-Px 水平
及 SOD 活性的影响
与对照组相比，模型组大鼠肝组织中 SOD 活
性、GSH-Px 水平显著降低（P＜0.01），Hyp 水平显
著升高（P＜0.01），表明模型制备成功。与模型组
相比，甘草酸单铵组与甘草酸纳米粉组大鼠肝组织
中 SOD 活性和 GSH-Px 水平显著升高（P＜0.05、
0.01），而 Hyp 水平显著降低（P＜0.01）。与甘草酸
单铵组相比，甘草酸纳米粉组 SOD 活性提高
15.70%，GSH-PX 水平提高 6.56%，Hyp 水平降低
15.67%，表明甘草酸纳米粉的效果优于甘草酸单
铵。结果见图 4。
3.5 对慢性肝损伤大鼠肝组织病理学的影响
HE 染色结果显示，对照组肝细胞排列较规则，
未见脂肪变性、水肿、坏死及纤维增生。模型组肝
组织正常结构被破坏，肝索排列紊乱，肝细胞水肿，
部分呈现气球样变，纤维组织大量增生，分割肝小
叶。甘草酸单铵组与甘草酸纳米粉组肝细胞坏死区
域、纤维增生减少，细胞轻度肿胀；其中甘草酸单
铵组肝细胞弥漫性变性，有大量炎细胞浸润；甘草
酸纳米粉组肝组织轻微纤维化，有少量炎细胞浸
润，多数细胞结构较正常，部分接近正常细胞。表
明甘草酸纳米粉作用强于甘草酸单铵。结果见表 1
及图 5。
4 讨论
ALP 主要由骨细胞分解得到，随后经过肝脏、
胆道排出体外。若肝胆发生病变，ALP 不能及时排
出，导致其回流入血液中，致使血清中检测的 ALP
值偏高。肝纤维化由慢性肝炎发展而来，并与异常
的细胞外基质蛋白，尤其是胶原的积累有关。Hyp
是胶原的主要成分，其量可用来评估胶原的量，因
而可用来反映肝纤维化的程度，Hyp 的量越高，表
明肝损伤程度越重。
由 CCl4 导致的肝毒性，其机制在于 CCl4 产生

与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01
**P<0.01 vs control group; ▲P<0.05 ▲▲P<0.01 vs model group
图 4 甘草酸纳米粉对慢性肝损伤大鼠肝组织 Hyp 和 GSH-Px 的量、SOD 活性的影响 ( 01=± n , sx )
Fig. 4 Effects of glycyrrhizic acid nanoparticles on Hyp, GSH-Px levels, and SOD activity in liver tissue
of chronic liver injury rats ( 01=± n , sx )
60
50
40
30
20
10
0
肝
脏
指
数
/(m
g·
g−
1 )

对照 模型 甘草酸单铵 甘草酸纳米粉
**
▲
▲
300
250
200
150
100
50
0
酶
活
性
/(U
·L
−1
)
ALP ALT AST
对照
模型
甘草酸单铵
甘草酸纳米粉

对照 模型 甘草酸单铵 甘草酸纳米粉 对照 模型 甘草酸单铵 甘草酸纳米粉 对照 模型 甘草酸单铵 甘草酸纳米粉
800
600
400
200
0
120
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
H
yp
/(μ
g·
g−
1 )

SO
D
/(U
·m
g−
1 )

G
SH
-P
x/
(μ
m
ol
·m
g−
1 )

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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表 1 大鼠慢性肝损伤病理评分 ( sx ± )
Table 1 Pathological grading of chronic liver injury
in rats ( sx ± )
组 别 动物/只 评分
对照 10 −
模型 8 3.25±0.71**
甘草酸纳米粉 9 1.78±0.44▲▲
甘草酸单铵 8 2.25±0.38▲▲
与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：▲▲P＜0.01
**P<0.01 vs control group; ▲▲P<0.01 vs model group
活性氧自由基的生物效应。当肝脏处于过量的碳中
心三氯甲基毒性环境中时，黄嘌呤氧化酶的活性随
着细胞损伤的发展而升高，而该酶可产生致肝毒性
的超氧负离子和过氧化氢，这些活性氧簇（ROS）
量的增加导致负责清除这些物质的抗氧化酶如
SOD、GSH-PX 减少，而这些酶的减少程度也反映
了肝脏受损的程度。
注射剂由于没有首关效应，且具有较高的生物
利用度，已逐渐成为常用给药方式。甘草酸水溶性
较差，吸收缓慢，一定程度上影响了其应用。现有

图 5 慢性肝损伤大鼠肝脏病理学观察
Fig. 5 Liver pathologic image of chronic liver injury in rats
的甘草酸注射剂型以甘草酸单铵及甘草酸二铵为主
要有效成分，改善了溶解性，但屡有不良反应及安
全性问题的报道，影响肝、肾功能，引起钠水潴留、
肝性腹水等症状[11-13]。药物粒径改造可有效地解决
甘草酸的溶解性的问题，通过纳米化过程，可以增
加药物的相对表面积，提高生物利用度，增强靶向
性[14]。本实验结果表明，注射用甘草酸纳米无菌粉
对 CCl4 导致的大鼠慢性肝毒性的治疗效果优于现
有注射剂中的主要有效成分甘草酸单铵，原因可能
为：直径 10～1 000 nm 的纳米球经 iv 给药后，主
要被单核-巨噬细胞系统摄取，而该系统的分布具有
特异性，导致纳米球主要分布于肝（60%～90%），
其次分布于脾（2%～10%）、肺（3%～10%）中，
少量进入骨髓[6]，因此经过粒径改造的甘草酸 [直
径（100±30）nm ]被单核-吞噬细胞系统摄取，被
动靶向作用于肝脏，改善了原有的治疗效果。
2005 年美国 FDA 批准了纳米注射新药
Abraxane®（直径 130 nm）上市[15]，开创了纳米药
物实际应用的先河。与传统方法相比，超临界反溶
剂法制备甘草酸纳米粒具有产物粒径小、分布均匀、
水溶性好，且制备过程对环境友好等优点，有望成
为纳米制药的常用方法之一。
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对照 模型 甘草酸纳米粉 甘草酸单铵
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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