全 文 ：紫背金盘的鉴别,可为紫背金盘的开发利用、质量控
制提供方法和依据。
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HPLC法同时测定不同产地广陈皮中 5种活性黄酮成分
郑国栋1, 2 ,蒋 林1 * ∀ ,杨得坡1 ,周 芳3 ,杨 雪1 , 林乐维1
( 1 中山大学药学院 生药与天然药物化学实验室,广东 广州 510006; 2 广州医学院 基础学院药学系,
广东 广州 510182; 3 湖南中医药大学药学院 天然药物化学实验室,湖南 长沙 410208)
摘 要:目的 建立 H PLC 法测定 12 批不同产地广陈皮中 5 种活性黄酮的量。方法 采用超声法提取药材, 通过
对提取工艺及色谱条件进行优化建立测定方法,同时测定不同产地广陈皮中橙皮苷( 1)、川陈皮素( 2)、3, 5, 6, 7, 8,
3#, 4#七甲氧基黄酮( 3)、橘皮素( 4)和 5羟基6, 7, 8, 3#, 4#五甲氧基黄酮( 5) 5 种活性黄酮的量。结果 12 批广陈
皮中橙皮苷的量在 38 021~ 70 735 mg / g ,均符合药典标准 ( ∃ 35 mg / g ) ,其中, 产于新会的广陈皮中橙皮苷的量
低于广东其他两个产地(高要和龙门 ) ; 另外, 广陈皮中多甲氧基黄酮类成分的量以川陈皮素、橘皮素为高。结论
该方法简单、准确, 其结果可为广陈皮质量标准的制定提供一定的依据。
关键词:广陈皮; 高效液相色谱; 橙皮苷; 多甲氧基黄酮
中图分类号: R282 6 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 04065204
广陈皮是我国岭南地区著名的道地药材, 位列
十大广药之一。中国药典 ( 2005年版)记载, 陈皮
为芸香科柑橘属植物橘 Cit rus r et iculata Blanco 及
其栽培变种的干燥成熟果皮, 其药材可分为陈皮及
广陈皮,质量以广陈皮为优。目前对广陈皮药材质
量控制已有报道 [ 1]。广陈皮药材来源较广, 正品为
茶枝柑 Citr us reti culata %Chachi& (当地叫大红柑)
的干燥成熟果皮, 主产于广东新会, 又名新会陈皮。
具有理气健脾、和胃止呕、燥湿化痰等多种功效 [ 2]。
除挥发油外,广陈皮主含黄酮类成分。其黄酮类成
分有两大类型: 一类是黄酮苷类,主要为二氢黄酮类
成分,如橙皮苷、柚皮苷等;一类是多甲氧基黄酮类,
主要有川陈皮素、橘皮素、3, 5, 6, 7, 8, 3#, 4#七甲氧
基黄酮等。研究结果表明, 多甲氧基黄酮类成分具
有抗癌[ 3]、抗氧化[ 4] 、抗诱变[ 5]、抗炎[ 6] 及心血管保
护[ 7 ]等多种作用。多甲氧基黄酮类成分广泛存在于
芸香科柑橘属类植物中,随植物来源不同,该类植物
所含多甲氧基黄酮类成分有较大差异 [ 811]。
中国药典 2005 年版是以橙皮苷作为陈皮及
广陈皮质量控制的指标成分。然而, 资料及预实验
结果表明,广陈皮中橙皮苷的量往往低于其他陈皮,
仅通过单一指标成分已无法说明广陈皮的特色。鉴
于此,除橙皮苷外,本实验还选择了 4个多甲氧基黄
酮 (川陈皮素、3, 5, 6, 7, 8, 3#, 4#七甲氧基黄酮、橘
皮素、5羟基6, 7, 8, 3#, 4#五甲氧基黄酮) 作为指标
对来自不同产地的 12批广陈皮样品进行了测定,其
结果可为广陈皮质量标准的研究提供一定的参考。
1 仪器与材料
1 1 仪器: 高效液相色谱系统: Shimadzu LC20AT
高效液相色谱仪, SPD20A 紫外可见分光检测器,
!652! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
∀收稿日期: 20090720 基金项目:国家博士后特别资助项目∋ 岭南柑橘属道地药材的 DNA 条形码研究( ( 200902353) ; 广东省自然科学基金博士科研启动项目∋ 广陈皮及其近缘类群的 DNA 条形码研究( ; 国家科技部十一五支撑项目子课题∋ 砂仁等 5种中药材规范化生产关键技术研究(
( 2006BAI06A1102) 广陈皮子项目作者简介:郑国栋( 1979 ) ) ,男,湖北省宜昌市人,博士,讲师,主要从事生药学与天然药物化学方向的研究与开发。
T el : 15918518120 Fax : ( 020) 39943043 Email: gd200237@ 126. com
* 通讯作者 T el : ( 020) 39943041 Email: linderson_jiang@ 163. com
7725i注射阀 ( 20 L, Rheodyne, USA) , LC so lu
t ion 色谱工作站软件; M illiQ plus system 超纯水
仪 ( M illipo re, M ilfor d, MA, USA ) ; KUDOS
SK250 LH 超声波清洗器 (上海科导超声仪器有限
公司) ; Anke TDL5型台式离心机 (上海安亭科学
仪器厂)。
1 2 材料: 广陈皮药材于 200710 ) 200812 采自
于广东省江门市新会区各镇、高要市水南镇及惠州
市龙门县,经中山大学药学院杨得坡教授、蒋林研究
员鉴定为茶枝柑 Citr us reti culata %Chachi& 的干燥
成熟果皮。橙皮苷 ( 1)、川陈皮素 ( 2)、3, 5, 6, 7, 8,
3#, 4#七甲氧基黄酮 ( 3)、橘皮素 ( 4)、5羟基6, 7,
8, 3#, 4#五甲氧基黄酮 ( 5) 对照品均由笔者从广陈
皮药材中制备分离得到,通过 NMR、MS 等方法对
其结构进行了鉴定, HPLC 峰面积归一化法测定结
果表明其质量分数均大于 98%。
1 3 试剂:色谱纯试剂: 乙腈、甲醇 ( T edia Compa
ny, Fairf ield, USA) ; 分析纯试剂: 石油醚、醋酸乙
酯、甲醇 (天津市富宇精细化工有限公司) , 甲酸、冰
醋酸 (广州化学试剂厂) ; 怡宝纯净水 (怡宝食品饮
料有限公司) ;超纯水 (自制)。
2 方法与结果
2 1 HPLC 色谱条件:色谱柱为 DIKMA Diamon
sil C18 ( 250 mm ∗ 4. 6 mm, 5 m) ; 流动相: 乙腈
水;体积流量: 1 mL/ min; 柱温: 25 + ; 进样量: 20
L;检测波长: 283 及 330 nm 双波长检测。梯度洗
脱程序: 0~ 15 m in, 25% ~ 50% 乙腈; 15~ 35 m in,
50% ~ 60% 乙腈; 35~ 40 min, 60% ~ 85% 乙腈。
在该条件下,广陈皮药材及对照品色谱图见图 1。
2 2 供试品溶液的制备 :取广陈皮药材粉末(过
1~ 5代表黄酮指标化合物
1 ) 5numbers indicate flavonoids
图 1 对照品 (A) 及广陈皮药材 ( B) HPLC分析色谱图
Fig. 1 HPLC Chromatograms of reference substance ( A)
and Pericarpium Citri Reticulatae ( B)
140目筛) 0 4 g , 精密称定。精密加入 40 mL 甲
醇,超声提取 30 m in。4 000 r/ m in 离心 5 min, 取
上清液,浓缩后定容至 25 mL。溶液经微孔滤膜滤
过,即得。
2 3 对照品溶液的制备:分别精密称取橙皮苷 ( 1)
31 2 mg、川陈皮素 ( 2) 9 6 mg、3, 5, 6, 7, 8, 3#, 4#
七甲氧基黄酮 ( 3) 8 6 mg、橘皮素 ( 4) 10 2 mg 和
5羟基6, 7, 8, 3#, 4#五甲氧基黄酮 ( 5) 8 9 mg 5种
自制对照品,用甲醇溶解并定容至 25 mL,使之质量
浓度分别为 1 248、0 384、0 344、0 408、0 356 mg/
mL,并作为对照品贮备液, 冰箱 4 + 保存、备用。
临用前,用甲醇将储备液稀释到适当浓度,即为对照
品溶液。
2 4 HPLC 色谱条件的优化
2 4 1 流动相组成系统的优化: 考察了甲醇水,乙
腈水及在流动相中添加不同浓度的酸 (甲酸、乙
酸) 对样品分离的影响。结果表明,采用甲醇水系
统作为流动相时, 黄酮苷类成分有较好的分离, 但多
甲氧基黄酮类成分的分离则不理想, 采用乙腈水系
统对多甲氧基黄酮类成分的分离有明显改善;在流
动相中添加不同比例的酸,对样品各成分的分离影
响不大;采用梯度洗脱较等度洗脱,能明显改善各特
征峰的分离效果, 既能满足基线分离的要求,又有适
宜的保留时间。故实验选用乙腈水系统作为流动
相并采用梯度洗脱方式。
2 4 2 检测波长的选择: HPLCPDA 分析结果表
明, 5个黄酮指标成分橙皮苷、川陈皮素、3, 5, 6, 7,
8, 3#, 4#七甲氧基黄酮、橘皮素、5羟基6, 7, 8, 3#,
4#五甲氧基黄酮最大吸收波长分别为 283 7、
334 4、341 5、323 7、345 1 nm。因此, 选择 283 和
330 nm 分别作为二氢黄酮类及多甲氧基黄酮类成
分的检测波长,在两个波长下, 色谱峰数量较多、表
观峰度高、峰形较好且基线稳定。
2 5 药材提取方法的优化
2 5 1 提取溶剂的筛选;采用超声法提取药材。比
较了石油醚、醋酸乙酯、乙醇、甲醇 4 种不同溶剂对
广陈皮黄酮类成分的提取效率。结果表明,石油醚
是一种富集多甲氧基黄酮类成分的良好溶剂,但提
取率低,且其对橙皮苷的提取率几乎为零;醋酸乙酯
对多甲氧基黄酮类成分有较高的提取率, 对橙皮苷
的提取率则较低, 且二者均小于乙醇及甲醇;乙醇和
甲醇均是提取橙皮苷及多甲氧基黄酮类成分的良好
溶剂,但甲醇对橙皮苷的提取率略大于乙醇。因此,
实验选择甲醇作为广陈皮黄酮类成分的提取溶剂。
!653!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
2 5 2 药材粒度的筛选:以上述 5个黄酮化合物为
指标, 考察了不同粒度的广陈皮药材粉末 40、60、
80、100、120、140、160 目对提取效率的影响。结果
表明,药材粒度为 120 目时, 药材中的橙皮苷提取
效率最高, 80、100、140 目次之; 药材粒度为 140、
160 目时,多甲氧基黄酮类成分的提取率最高, 且二
者大致相当, 橙皮苷的提取率则以 140 目时为大。
故药材的粉碎度确定为 140 目。
2 5 3 溶剂倍量的优化: 分别用 40、60、80、100、
120、150 倍甲醇超声提取药材。经分析测定, 结果
表明, 采用 100倍甲醇提取, 5个黄酮化合物的提取
率均为最高,故选择 100倍体积甲醇提取药材。
2 5 4 超声时间的优化: 考察不同提取时间 12、
20、30、45 min 对 5 个黄酮化合物提取效率的影响。
结果表明,超声 30 min 后,再延长提取时间并不能
提高 5个化合物的提取率,说明提取已经基本完全,
且无必要再考察提取次数。故最终优化的提取条件
为:药材过 140 目筛, 用 100 倍甲醇溶液超声提取
30 min, 提取 1次。
2 6 线性范围、检测限及定量限考察: 精密称取对
照品储备液,用甲醇稀释配制成 6个质量浓度水平。
按 2 1色谱条件,分别对不同质量浓度的对照品溶
液进行分析,每样重复测定 3次, 取峰面积平均值。
分别以对照品 1~ 5 的质量浓度 X ( g/ mL) 为横
坐标、峰面积值 Y 为纵坐标进行回归计算。回归方
程、线性范围、相关系数见表 1。检测限 ( LOD) 和
定量限 ( LOQ) 分别是当信噪比 ( S/ N) 为 3和 10
时,化合物的质量浓度 (g/ mL) 见表 1。
表 1 标准曲线数据表 (n= 3)
Table 1 Calibration data (n= 3)
化合物
回归方程
( Y= aX+ b)
R
2
线性范围/
( g !mL- 1)
检测限/
(g !mL- 1 )
定量限/
( g !mL- 1 )
1 Y= 19 930 33 X- 152 459 75 0 999 8 19 50~ 1 2480 054 1 87
2 Y= 83 771 88 X- 42 75037 0 999 9 1 50~ 192 0 032 1 01
3 Y= 55 858 03 X- 26 19657 0 999 7 2 69~ 8600 027 0 87
4 Y= 93 661 10 X- 51 70145 0 999 9 159~ 20400 034 1 08
5 Y= 53 827 97 X- 10 18566 0 999 9 1 39~ 8900 022 0 72
2 7 精密度试验:分别取低、中、高 3个质量浓度的
混合对照品溶液。精密吸取 20 L, 注入高效液相
色谱仪, 按 2 1色谱条件进行分析。每个质量浓度
日内测 6 次,连续测 6 d。经计算, 对照品中黄酮类
成分 1~ 5 的日内及日间测定质量浓度的 RSD 均
小于 5% ,同时准确度在 95 16% ~ 104 71%, 表明
测定方法的精密度符合分析要求。
2 8 重现性试验: 取同一批广陈皮药材 6 份, 按
2 2项下方法制备供试品溶液。在 2 1 色谱条件
下,测定供试品中黄酮成分 1~ 5 的量。经计算, 5
个黄酮化合物的保留时间和定量测定值的 RSD 均
小于 3%, 表明测定方法的重现性良好。
2 9 稳定性试验: 取同一份药材, 按 2 2项下方法
制备供试品溶液。在 2 1色谱条件下,分别于 0、2、
4、6、8、10、24、48 h 进样,测定供试品中黄酮化合物
1~ 5 的量。经计算, 5个黄酮成分的保留时间和定
量测定值的 RSD 均小于 3%, 表明供试品溶液在
48 h 内稳定。
2 10 回收率试验:精密称取已测定的样品 6 份,
每份 0 2 g,精密加入混合对照品溶液,按 2 2项下
方法制得待测溶液,按 2 1项下方法进样分析, 计算
加样回收率。经计算, 1~ 5 黄酮成分的平均加样回
收率依次分别为 98 27%、101 08%、97 64%、
103 20%、96 91% , RSD 值均小于 5%。
2 11 样品测定: 12批不同产地广陈皮药材,按 2 2
项下方法处理, 按 2 1项下方法进样, 测定峰面积,
用外标法计算药材中 5 个黄酮成分的量。计算结
果见表 2。由表 2 可知, 12批广陈皮中橙皮苷的量
在 38 021~ 70 735 mg/ g ,均符合中国药典 标准
( ∃35 mg / g) , 其中,产于江门新会的广陈皮中橙皮
苷的量低于广东其他两个产地 (高要和龙门) ; 广陈
皮中多甲氧基黄酮类成分的量以川陈皮素、橘皮素
为高,其量明显高于 3, 5, 6, 7, 8, 3#, 4#七甲氧基黄
酮、5羟基6, 7, 8, 3#, 4#五甲氧基黄酮。
3 讨论
研究结果表明, 不同产地广陈皮药材中各黄酮
类成分的量相差甚大, 除生长环境不同外,该结果还
与药材采收时间、贮藏年限等因素相关。由此可知,
要全面控制药材质量就要从药材的种植、生产、采
收、加工等各个环节全面实现规范化生产,才能确保
药材质量稳定。
中国药典 ( 2005年版)采用索氏提取法,经石
油醚脱色、甲醇反复回流提取陈皮药材,并以橙皮苷
为标准, 对药材进行分析测定, 该方法繁琐、耗时。
本实验采用超声法提取药材,并对提取工艺进行了
优化, 方法简单、经济。另外, 本实验采用多指标成
分对广陈皮主要活性黄酮类成分进行分析测定, 较
单一指标更能反映广陈皮道地性特色的物质基础。
本研究针对广陈皮中主要有效成分群,首次采
用多指标成分建立了 HPLC 定量方法对不同产地
的广陈皮进行了分析测定, 方法简单、准确,为广陈
皮药材质量标准的制定提供了有益的参考。另外,
!654! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
表 2 不同产地广陈皮药材中黄酮类化合物 1~ 5 的测定结果 (n= 3)
Table 2 Determination of flavonoids 1) 5 in Pericarp ium Citri Reticulate collected from different regions in China ( n= 3)
样品采收地点 采收时间 化合物/ ( m g ! g- 1) a
1 2 3 4 5
广东省江门市新会区司前镇 200711 51 800 , 1 262 4 800 , 0 081 0 523 , 0 014 4 439 , 0 084 0 366 , 0 010
广东省江门市新会区崖南镇 200711 53 914 , 0 730 5 851 , 0 121 0 644 , 0 016 3 008 , 0 045 0 373 , 0 008
广东省江门市新会区大泽镇 200811 50 123 , 0 200 3 694 , 0 075 0 406 , 0 007 2 286 , 0 046 0 308 , 0 007
广东省江门市新会区会城镇 200810 42 817 , 0 496 3 281 , 0 088 0 381 , 0 008 1 976 , 0 037 0 277 , 0 008
广东省江门市新会区双水镇 200712 55 379 , 0 476 7 090 , 0 093 0 784 , 0 009 4 364 , 0 101 0 053 , 0 008
广东省江门市新会区三江镇 200711 38 021 , 0 544 2 830 , 0 070 0 367 , 0 010 1 749 , 0 049 0 210 , 0 006
广东省江门市新会区沙堆镇 200812 59 785 , 0 365 4 010 , 0 064 0 524 , 0 009 2 905 , 0 048 0 328 , 0 007
广东省江门市新会区古井镇 200811 51 854 , 0 950 9 473 , 0 273 1 046 , 0 024 5 166 , 0 101 0 571 , 0 015
广东省江门市新会区罗坑镇 200710 52 394 , 0 480 3 682 , 0 052 0 461 , 0 007 2 619 , 0 042 0 302 , 0 008
广东省江门市新会区小冈镇 200811 45 957 , 0 247 9 467 , 0 243 1 129 , 0 007 5 596 , 0 041 0 728 , 0 009
广东省高要市水南镇 200710 70 735 , 0 236 5 375 , 0 091 0 502 , 0 010 3 666 , 0 045 0 465 , 0 007
广东省惠州市龙门县 200809 65 470 , 0 958 6 786 , 0 063 0 520 , 0 005 5 519 , 0 040 0 541 , 0 008
a表示均值 , 标准差
aData are r epresen ted as x , s
鉴于广陈皮中富含川陈皮素、橘皮素,两种成分又有
丰富的药理活性,故在结合橙皮苷制定广陈皮质量
标准时,建议予以充分考虑。
致谢:新会农业局、新会陈皮协会、广东省水果
苗木繁育场、江门丽宫国际酒店、江门德鑫制药有限
公司等单位在样品采集及基地建设方面对本项目工
作的大力支持和协助。
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!655!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月