全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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黄芪多糖对大鼠原代成骨细胞的影响及其机制研究
孔祥鹤 1，牛银波 1，王婷梅 1，王 娟 1，梅其炳 1, 2*
1. 西北工业大学生命学院，陕西 西安 710072
2. 第四军医大学 药理教研室，陕西 西安 710032
摘 要：目的 研究黄芪多糖对体外培养大鼠原代成骨细胞增殖、分化及矿化的影响及其作用机制。方法 体外培养的新生
SD 大鼠颅骨原代成骨细胞体系中分别加入不同质量浓度（0.1、0.3、1、3、10、30、100 μg/mL）的黄芪多糖，24、48 h 后
MTT 法检测细胞增殖，碱性磷酸酶（AKP）活性检测法检测细胞分化，茜素红染色法观察黄芪多糖 10 μg/mL 对细胞矿化的
影响，Western blotting 法检测黄芪多糖 1、10 μg/mL 作用于细胞 24 h 后，对细胞中骨形成蛋白（BMP-2）的表达、MAPK
信号通路中关键蛋白 ERK、P38、p-ERK、p-P38 等表达的影响。结果 黄芪多糖能剂量相关地促进大鼠原代成骨细胞的增
殖、分化及矿化，同时上调 BMP-2、p-ERK、p-P38 蛋白的表达，提高 p-ERK/ERK、p-P38/P38 值。结论 黄芪多糖可通过
促进 BMP-2 的表达、上调其下游的 ERK MAPK 和 P38 MAPK 的磷酸化水平来促进成骨细胞增殖、分化。
关键词：黄芪多糖；原代成骨细胞；增殖；分化；矿化；BMP-2；MAPK
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)10 - 2065 - 05
Effect of Astragalus polysaccharides on rat primary osteoblast and its mechanism
KONG Xiang-he1, NIU Yin-bo1, WANG Ting-mei1, WANG Juan1, MEI Qi-bing1, 2
1. School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, Xi’an 710072, China
2. Department of Pharmacology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

Key words: Astragalus polysaccharides; primary osteoblast; proliferation; differentiation; mineralization; BMP-2; MAPK

骨质疏松症是一种全身性的骨骼老化或废用退
化相关的代谢障碍性疾病，其防治主要从促骨形成
与抑骨吸收两方面入手。研究表明，骨形态发生蛋
白（bone morphogenetic proteins，BMP）对胚胎骨
形成及出生后成骨有重要作用，在体外能诱导成骨
细胞分化。BMP-2 是最主要的骨形成调控因子，通
过一系列信号转导途径，其中包括较为重要的促分
裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，
MAPK）途径发挥骨形成诱导作用。有研究表明
MAPK 家族中的细胞外调节激酶（extracellular-
regulated kinase，ERK）途径、p38 途径是参与成骨
细胞增殖与分化的重要信号通路[1-2]。
黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus mem-
branaceus（Fisch.）Bunge var. mongholicus（Bunge）
Hsiao 或膜荚黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）
Bunge 的干燥根，具有补气健脾、利尿托毒等功效，
《神农本草经》将其列为上品。中医临床常用含有黄
芪的方剂、黄芪水煎液等治疗骨质疏松症[3]，然而
对其抗骨质疏松症作用的活性部位、作用机制尚不
清楚。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，具有
免疫调节、保护心肌、降血糖、延缓衰老等多种药
理作用[4-7]。因此本实验研究黄芪多糖对大鼠原代成
骨细胞增殖、分化及矿化能力的影响，探讨其是否
影响 BMP-2、MAPK 信号通路相关蛋白的表达，以
揭示黄芪抗骨质疏松症作用的有效部位及作用机
制，为深入研究黄芪防治骨质疏松提供理论依据。
1 材料
1.1 药物与试剂
黄芪多糖（质量分数 98%，陕西森弗生物技术
有限公司），DMEM 高糖培养基（美国 Hyclone 公
司），胎牛血清（杭州四季青生物制剂公司），雌二
醇（E2）、胰蛋白酶、I 型胶原酶、EDTA、二甲基

收稿日期：2010-12-15
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81073037）；国家“863”计划（2008AA12A220）；西北工业大学博士论文创新基金（cx201024）
作者简介：孔祥鹤（1983—），女，云南大理人，博士研究生，主要从事骨质疏松及其防治的研究。E-mail: kongxianghe@126.com
*通讯作者 梅其炳 Tel: (029)84779212 E-mail: qbmei@npwu.edu.cn
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亚砜、MTT、茜素红、西吡氯铵（美国 Sigma 公司）；
碱性磷酸酶（AKP）试剂盒（南京建成生物工程研
究所），BMP-2、p-ERK、ERK、p-P38、P38、β-actin
抗体（美国 Bio Worlde 公司）。
1.2 动物
新生（1～3 d）SPF 级 SD 大鼠，购自第四军医
大学实验动物中心，合格证号 SCXK（军）2007- 007。
1.3 仪器
倒置显微镜（日本 Olympus 公司），Bio-Rad
Model 680 酶标仪（美国），CO2 培养箱（德国 Heraeus
公司），DU800 型分光光度计（美国 Beckman 公司），
培养板（丹麦 Nunclon 公司），高速冷冻离心机（日
本 Hitachi 公司），PAC300 型电泳仪（美国 Bio-Rad
产品）。
2 方法
2.1 细胞的分离与培养
取 4 只出生 1～2 d 的 SD 乳鼠，用 75%乙醇溶
液浸泡消毒 5 min 后置无菌培养皿中，取颅盖骨放
入 PBS缓冲液中洗 3次，去除骨膜及周围结缔组织。
将骨片浸于胰酶-I 型胶原酶液（1∶4）中，剪成
3 mm×3 mm 大小，于 5% CO2、37 ℃条件下培养
箱中恒温消化 30 min，其间每 5 min 振荡 1 次，用
含 15%胎牛血清的 DMEM 培养液终止胰酶消化，
加入 I 型胶原酶 1 mg/mL，再将骨剪成约 1 mm2 大
小，于 37 ℃、恒温消化 40 min，其间每 5 min 振
荡 1 次，加入含 15%胎牛血清的 DMEM 培养液终
止消化，1 000 r/min 离心 5 min 以沉淀细胞，弃去
消化液。用含 15%胎牛血清的 DMEM 培养液重悬
细胞后接种于细胞培养瓶中，置于培养箱中 30 min
后成纤维细胞先贴壁，吸取含成骨细胞的上清液于
另一培养瓶中继续培养，重复胶原酶消化过程 1 次，
2 d 后换液，以除去未贴壁的细胞。原代细胞长满瓶
壁后，进行传代，细胞传至第 2 代时换用含 10%胎
牛血清的 DMEM 培养液继续培养。传代 3 次后，
可使细胞得到纯化，经 AKP 检测和茜素红染色鉴
定获得的细胞为成骨细胞。
2.2 MTT 法检测成骨细胞增殖
取对数生长期的第 3 代成骨细胞，以 5×103/孔
密度接种于 96 孔板，置培养箱中于 37 ℃、5% CO2
贴壁培养 12 h，黄芪多糖组分别给予黄芪多糖（用
10%血清培养液配制）0.1、0.3、1、3、10、30、100
μg/mL，对照组给予 10%血清培养液，不加细胞，
用于调零，E2 组给予 E2 1×10−9 mol/L。将 96 孔板
置于培养箱中分别继续培养 24、48 h，每孔加入 5
g/L MTT 20 μL，继续孵育 4 h 后终止培养，吸弃孔
内上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，室温振荡 10
min，使结晶物充分溶解，用酶标仪检测 570 nm 波
长处各孔吸光度（A）值。
2.3 AKP 活性检测法检测成骨细胞分化
取对数生长期的第 3 代成骨细胞，以 1×105/孔
密度接种于 24 孔板中贴壁培养 12 h，分组与给药同
“2.2”项。分别于 24、48 h 后，按照 AKP 试剂盒
说明书进行操作，采用分光光度计测定各组 520 nm
处 A 值，计算 AKP 活性。
2.4 茜素红染色法检测成骨细胞矿化
将成骨细胞按 2×105/孔密度接种于 24 孔板，
12 h 贴壁后更换含黄芪多糖 10 μg/mL 的培养液，并
设对照组。在细胞培养箱中每 3 d 换液 1 次，连续
培养 21 d 后弃去培养液，PBS 清洗 3 次，95%的乙
醇固定 1 h，蒸馏水清洗 3 次，加入 40 mmol/L 茜素
红（pH 4.2）染液，于 37 ℃培养 15 min，再用蒸
馏水清洗 3 次，在显微镜下观察矿化结节并照相。
然后加入 100 mmol/L 西吡氯铵溶液，室温放置 1 h，
使与钙结合的茜素红充分溶解，用酶标仪检测 570
nm 处溶液 A 值，对矿化结节进行量化[8]。
2.5 Western blotting 法检测 BMP-2、ERK、P38
蛋白表达
取对数生长期的第 5 代成骨细胞，以 5×105/孔
密度接种于 6 孔板中贴壁培养 12 h，根据前面实验
结果选择两个较适质量浓度（1、10 μg/mL）的黄芪
多糖给药，并设对照组。24 h 后用细胞刮刮下并收
集细胞，加入 RI-PA（含 PMSF 蛋白酶抑制剂）细
胞裂解液提取总蛋白，用酶标仪进行蛋白定量。蛋
白变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，将膜浸
泡在 5%脱脂牛奶中 4 ℃封闭过夜，依次加兔抗
BMP-2、p-ERK、ERK、p-P38、P38、β-actin，一
抗 4 ℃培养 8 h，PBST 洗膜后加二抗，室温培养 1
h，用 PBST 及 PBS 洗膜后，进行化学发光，将条
带进行灰度分析以观察各蛋白表达水平的变化。
2.6 统计学处理
实验数据采用 SPSS 11.0 统计软件中的方差分
析（ANOVA）进行统计，Western blotting 条带用
Quantity One 4.6.2 软件进行灰度值定量分析。
3 结果
3.1 对原代成骨细胞增殖的影响
MTT 法检测结果显示，与对照组相比，黄芪多
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糖 0.3、1、3、10、30、100 μg/mL 作用于原代成骨
细胞 24、48 h 后，均能剂量相关地促进细胞增殖
（P＜0.05、0.01），30 μg/mL 时作用最强，在 48 h
时的作用强于 24 h；E2的细胞增殖促进作用强于黄
芪多糖。结果见图 1。

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P<0.05 **P<0.01 vs control group
图 1 黄芪多糖对大鼠原代成骨细胞增殖的影响
( 6=± n , sx )
Fig. 1 Effect of Astragalus polysaccharides on proliferation
of rat primary osteoblast ( 6=± n , sx )
3.2 对原代成骨细胞 AKP 活性的影响
黄芪多糖 1、3、10、30、100 μg/mL 时作用 24
h，原代成骨细胞的 AKP 活性高于对照组；作用 48
h 后，黄芪多糖 0.3、1、3、10、30、100 μg/mL 组
原代成骨细胞的 AKP 活性均显著高于对照组（P＜
0.05、0.01）；10 μg/mL 时的作用最强，48 h 时的作
用强于 24 h，且均呈质量浓度相关性变化。E2 对原
代成骨细胞分化的促进作用强于黄芪多糖。结果见
图 2。
3.3 对原代成骨细胞矿化的影响
各组细胞连续培养 21 d，在不同时间内出现肉
眼可见的白色结节。茜素红染色后细胞呈现大小、
形态不一的红色阳性结节，镜检和茜素红量化结果

与对照组比较：**P＜0.01
**P<0.01 vs control group
图 2 黄芪多糖对大鼠原代成骨细胞 AKP 活性的影响
( 6=± n , sx )
Fig. 2 Effect of Astragalus polysaccharides on AKP activity
of rat primary osteoblast ( 6=± n , sx )
显示，与对照组相比，黄芪多糖 10 μg/mL 显著增加
成骨细胞矿化结节的数量。结果见图 3。
3.4 对原代成骨细胞 BMP-2、P38、ERK 蛋白表
达的影响
在原代成骨细胞中加入质量浓度为 1、10
μg/mL 的黄芪多糖培养 24 h 后，黄芪多糖不仅能使
BMP-2 蛋白表达升高，而且能使 MAPK 通路中的
磷酸化 p-ERK、p-P38 蛋白表达升高，且呈质量浓
度相关性变化，而总的 ERK、P38 蛋白水平则无明
显改变，因此 p-ERK/ERK、p-P38/P38 值升高。结
果见图 4。
4 讨论
现有的抗骨质疏松化学药作用靶点较单一，长
期使用有一定的不良反应，因此发掘安全有效、适
合长期使用的防治药物已成为抗骨质疏松症研究的
重要内容。骨质疏松症归属于中医骨痿、骨枯、骨
痹范畴，中医临床上采用补肾壮骨、健脾益气、活
血养肝等措施防治骨质疏松症。长期的临床实践发

与对照组比较：**P＜0.01
**P<0.01 vs control group
图 3 黄芪多糖对大鼠原代成骨细胞矿化结节的影响 (n = 6)
Fig. 3 Effect of Astragalus polysaccharides on mineralization of rat primary osteoblast (n = 6)
0.8
0.6
0.4
0.2
0
对照 E2 0.1 0.3 1 3 10 30 100
黄芪多糖/(μg·mL−1)
A 5
70

24 h
48 h
**
**
*
*
**
**
**
** **
**
**
**
**
**
0.8

0.6

0.4

0.2

0
A
K
P/
(U
·m
g−
1 )

对照 E2 0.1 0.3 1 3 10 30 100
黄芪多糖/(μg·mL−1)
24 h
48 h**
**
** **
** **
** **
**
**
**
****

对照组 黄芪多糖组 对照组 黄芪多糖组
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
**
矿化
结节
(以
对照
组
A
值为
1）

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与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01
*P<0.05 **P<0.01 vs control group
图 4 黄芪多糖对大鼠原代成骨细胞 BMP-2、ERK 和 P38 蛋白表达水平的影响 (n = 4)
Fig. 4 Effect of Astragalus polysaccharides on protein expression level of BMP-2, ERK, and P38 in rat primary osteoblast (n = 4)
现了包括黄芪在内的许多疗效确切、不良反应少、
可长期使用的中药[9]。黄芪多糖是黄芪的主要活性
成分之一，邹丽宜等[10]发现黄芪多糖能预防肝纤维
化小鼠骨丢失，提示黄芪多糖可能是中药黄芪抗骨
丢失的有效部位之一。本实验探讨黄芪多糖对成骨
细胞增殖、分化的影响，从细胞水平考察黄芪多糖
的活性。
成骨细胞不仅决定骨形成，同时也调节破骨细
胞的骨吸收，是骨代谢的重要功能细胞。骨质疏松
病理机制的一个重要方面就是成骨细胞的增殖、分
化受到抑制，从而使骨质量和骨量下降，骨小梁稀
疏、断裂。因此防治骨质疏松的关键是提高成骨细
胞的增殖和分化水平。AKP 是参与骨代谢的重要蛋
白质，是识别和评价成骨细胞分化程度的早期指标。
在预实验中，黄芪多糖 0.01、0.1、1、10、100、1 000
μg/mL 分别作用于原代成骨细胞，发现其在 0.1～
100 μg/mL 均有促进细胞增殖作用，其中 0.1～10
μg/mL 的作用与质量浓度呈正相关，10～100 μg/mL
作用降低，1 000 μg/mL 时则抑制细胞增殖，因此最
终选择 0.1～100 μg/mL 用于实验。在此质量浓度范
围内，黄芪多糖能质量浓度相关地促进细胞增殖和
分化，其中 30 μg/mL 的作用较强，10 μg/mL 时促
分化作用较强。黄芪多糖对成骨细胞增殖、分化的
促进作用虽弱于雌激素，但雌激素对子宫具有明显
的刺激作用[11]，而黄芪多糖明显的不良反应尚未见
报道。
成骨细胞是促进骨矿化的主要细胞，矿化结节
的形成是成骨细胞体外成骨的重要标志之一，是成
骨功能的形态表现[12]。在本实验中，黄芪多糖 10
μg/mL 作用于成骨细胞，能显著促进矿化结节的形
成，从细胞水平证实黄芪多糖具有促骨形成作用。
骨形态发生蛋白系列（BMPs）属于转化生长
因子-β（TGF-β）超家族，其主要生物学作用是诱
导未分化的间充质细胞增殖及发生成骨性分化，是
调节成骨细胞生长最重要的生长因子，其中以
BMP-2 活性最强，对人骨髓间充质干细胞有强烈的
成骨诱导活性，而且能使诱导性骨细胞向确定性骨
细胞转化，从而促进骨形成[13]。在本实验中发现，
黄芪多糖能剂量相关地促进大鼠原代成骨细胞
BMP-2 蛋白表达，提示黄芪多糖促成骨细胞增殖、
分化的作用机制与其上调骨形成蛋白 BMP-2 的表
达水平密切相关。
BMP 受体属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶跨膜受
体，可分为 I 型和 II 型。当 BMP 配体与 I 型或 II
型受体组成的同源二聚体结合后，MAPK 通路则被
激活[14]。MAPK 是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，




对照 1 10 对照 1 10 对照 1 10
黄芪多糖/(μg·mL−1) 黄芪多糖/(μg·mL−1) 黄芪多糖/(μg·mL−1)
对照 1 10 对照 1 10 对照 1 10
黄芪多糖/(μg·mL−1) 黄芪多糖/(μg·mL−1) 黄芪多糖/(μg·mL−1)
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
BMP-2

β-actin
p-ERK
ERK
p-P38
P38
B
M
P-
2
p-
ER
K
/E
R
K

p-
P3
8/
P3
8
*
**
**
**
*
**
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MAPK 信号通路参与细胞生长、发育、分裂以及细
胞间功能的协调等多种生理过程。研究表明，MAPK
中的 ERK（细胞外相关信号蛋白激酶）、MAPK、p38
MAPK参与了成骨细胞增殖分化的信号转导过程[1-2]。
MAPK 通路通过磷酸化级联反应激活，ERK 通过
Ras→Raf（MAPKKK）→ERK1/2（MAPKK）→ERK
（MAPK）被激活，P38 则通过 TAK（MAPKKK）→
MKK3/6（MAPKK）→P38（MAPK）被激活。活
化（磷酸化）的 MAPK 将信号转导到转入核内，促
使 c-fos、c-myc、c-jun 及成骨细胞特异性转录因子
Osf2/Cbfa1 等多种转录因子的激活，最终促进细胞
的增殖与分化，而且对成骨细胞的粘附、伸展、位
移及整合素的表达均具有重要意义[15]。本实验中，
黄芪多糖不仅能使 BMP-2 蛋白表达升高，而且能使
MAPK 通路中的 p-ERK/ERK、p-P38/P38 值升高，
即促进 ERK MAPK 和 P38 MAPK 的磷酸化。
综上所述，黄芪多糖能促进大鼠原代成骨细胞
的增殖、分化与矿化，证实了该有效部位的促成骨
活性。其可能的机制是通过上调骨形成蛋白 BMP-2
的表达，激活下游的 MAPK 信号通路，促进 ERK
和 P38 的磷酸化，最终促进细胞的增殖、分化。
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