全 文 ：0 01) ;与模型组比较, 海南青牛胆高剂量组股骨湿
质量明显升高 ( P< 0 05) , 高、中、低剂量组均能显
著增加股骨干质量 ( P< 0 05、0 01) ,作用与尼尔雌
醇片相当 ( P> 0 05)。
2 3 海南青牛胆对维甲酸致雄性骨质疏松大鼠股
骨密度的影响: 结果见表 3。与对照组比较,模型组
大鼠股骨的骨密度显著降低, 有显著性差异 ( P <
0 01) ;与模型组比较,海南青牛胆高、中、低剂量组及
尼尔雌醇组大鼠的骨密度显著升高 ( P< 0 05) ,呈剂
量依赖关系,且海南青牛胆高剂量组作用明显优于尼
尔雌醇组 ( P< 0 05)。提示海南青牛胆可对抗维甲
酸所致骨密度下降的程度,可有效防止骨量丢失。
表 3 海南青牛胆对大鼠股骨密度的影响 ( x s, n= 12)
Table 3 Effects of T. hainanensis on bone mineral density
of rats ( x s, n= 12)
组 别 剂量/ ( g kg- 1 ) 骨密度 (像素)
对照 - 125 46 16 18
模型 - 107 44 7 35*
海南青牛胆 072 136 41 11 14 ! !
036 132 95 13 55 ! !
018 119 44 4 78 !
仙灵骨葆胶囊 0246 111 46 3 44
尼尔雌醇片 0001 118 63 7 69 ! ∀
与对照组比较: * P < 0 05; 与模型组比较: ! P < 0 05
! !P< 0 01; 与海南青牛胆高剂量组比较: ∀ P< 0 05
* P < 0 05 v s cont rol group; ! P < 0 05 ! ! P < 0 01 v s
m odel group; ∀P< 0 05 v s h ighdose group
3 讨论
海南青牛胆是海南当地黎族的常用药物,在民
间使用广泛。但是, 长期以来对其作用机制缺乏基
础研究, 限制了其开发利用。本实验采用维甲酸所
致的骨质疏松模型大鼠, 4周后, 模型大鼠的骨密度
降低,血清生化指标和骨指标也显示此模型可以用
于评价骨质疏松药物的药效学。
实验结果表明海南青牛胆能够明显改善维甲所
致的大鼠骨质疏松症, 其抗骨质疏松作用较仙灵骨
葆和尼尔雌醇明显; 证实了其在抑制钙流失和促进
成骨细胞的形成方面的显著作用, 为进一步应用和
开发提供了重要实验依据。
参考文献:
[ 1] 罗献瑞, 赵素云 中国防己科资料 [ J] 广西植物, 1986
( 6) : 51
[ 2] 刘明生 黎药学概论 [ M ] 北京:人民卫生出版社, 2008
[ 3] 季宇彬 中药有效成分药理与应用 [ M ] 哈尔滨:黑龙江科
学出版社, 1995
[ 4] 郭幼莹, 林连波, 申 静 海南青牛胆化学成分的研究 [ J ]
药学学报, 1998, 33( 5) : 350353
[ 5] 马亚兵, 高海青, 刘新春, 等 骨质疏松症预防与治疗的循
证医学研究 [ J ] 药物评价研究, 2009, 32( 2) : 135139
[ 6] 许 旺 中医药治疗骨质疏松症的研究进展 [ J ] 中草药,
2005, 36( 2) : 314315
[ 7] 海南医学院 海南青牛胆植物总甾酮的医药用途及其制备
方法 [ P] 中国专利: C N1398589, 20020803
[ 8] 姜月霞, 张俊清, 刘明生 青牛胆急性毒性试验研究 [ J] 海
南医学院学报, 2009, 15( 4) : 306308
马钱子碱经皮给药后在小鼠体内的药动学研究
陈 军, 王立杰,蔡宝昌* ,胡 巍,楼成华, 王 玮*
(南京中医药大学, 江苏 南京 210029)
摘 要:目的 考察马钱子碱经皮给药后在小鼠体内的药物动力学过程。方法 建立了利用 HPLC 法测定小鼠血
浆中马钱子碱质量浓度的方法, 测定了 iv 4 mg/ kg 马钱子碱溶液、经皮给药 40 mg/ kg 马钱子碱后的血药浓度, 并
对结果进行药动学拟合。结果 马钱子碱 iv 和经皮给药后的药动学均符合二室模型。经皮给药后的绝对生物利
用度为 32 8% , MRT 是 iv的 8 倍。结论 经皮给药途径可能有利于马钱子碱的减毒增效。
关键词:马钱子碱; 药动学;经皮给药; 高效液相色谱
中图分类号: R286 02 文献标识码: B 文章编号: 02532670( 2010) 08135003
马钱子又名番木鳖, 始载于#本草纲目∃, 是马钱
科植物马钱 Stry chnou nuxvomica L 的干燥成熟
种子,具有通络止痛、散结消肿之功效,马钱子碱、士
的宁等吲哚类生物碱成分是其主要的有效成分。研
1350 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 20091025 基金项目:国家科技重大新药创制专项课题( 2009ZX09103342)作者简介:陈 军( 1975 % ) ,男,江苏泰州人,副教授,药剂学博士,主要从事中药新剂型与药物动力学研究。
T el: ( 025) 85811050 Email: ch enjun 75@ 163. com
* 通讯作者 蔡宝昌 T el: ( 025) 85811112 Emai l: bccai@ 126. com
究表明,马钱子碱在马钱子生物碱中最具有开发前
景, 不仅药理活性显著高于士的宁等其他生物
碱[ 13] ,而且毒性相对比较低, 口服中毒剂量为士的
宁的 71倍,注射为 45 倍[ 4]。尽管马钱子碱的毒性
远低于士的宁, 但其中枢神经毒性还是成为阻碍马
钱子碱临床应用的最主要障碍。采用经皮途径给药
很可能在保证局部疗效的同时, 显著降低马钱子碱
的毒性,从而使得马钱子碱的临床应用成为可能。
马钱子碱脂质体[ 5]、微乳[ 6] 等经皮给药制剂初步研
究已有报道。马钱子碱油水分配系数适中 [ 7] , 能够
比较完全地通过小鼠皮肤 [ 8] ,经皮给药后具有确切
的镇痛作用 [ 9]。本实验在建立 HPLC 法测定小鼠
血浆中马钱子碱质量浓度的基础上,考察了马钱子
碱经皮给药后的药动学性质, 以便为马钱子碱经皮
给药制剂的研究开发提供依据。
1 材料
HP 1100 Ser ies高效液相色谱仪(美国 Agilent
公司) ; T DL80 % 2B 型离心机 (上海安亭科学仪器
厂) ; XYJ % 2型高速离心机(常州国华电器公司) ;
WH % 3微型旋涡混合仪 (上海沪西分析仪器厂) ;
AG % 285电子天平(瑞典 Mett ler公司)。
马钱子碱, 日本和光纯药工业株式会社, 批号
05917; 士的宁, 中国药品生物制品检定所, 批号
110705200306;乙腈, 色谱纯, 美国 T EDIA 公司。
ICR雄性小鼠, 18~ 22 g, 上海斯莱克实验动物有限
公司提供, 合格证号 SCXK(沪) 20030003。
2 方法与结果
2 1 马钱子碱溶液的配制: 由于马钱子碱在 PBS
中的溶解度不佳, 因此采用含 20%乙醇的 pH 7 4
PBS作为溶剂,配制 5 mg/ mL 马钱子碱溶液。
2 2 色谱条件: 色谱柱为 Phenomenex C18 ( 250
mm & 4 6 mm, 5 m) ; 流动相: 乙腈[ 0 01 mol/ L
庚烷磺酸钠0 02 mo l/ L 磷酸二氢钾( 1 ∋1, 用 10%
磷酸调 pH 2 8) ] ( 24 ∋76) ;检测波长 264 nm ;体积
流量 1 0 mL/ min;进样量 50 L; 柱温 30 ( 。
2 3 血浆样品的处理: 精密吸取血浆 0 25 mL, 加
入内标( 10 g/ mL 士的宁甲醇溶液) 20 L,加氨水
50 L,涡旋 30 s, 再加氯仿 2 5 mL,涡旋 3 m in, 超
声20 min,静置 2 h, 4 000 r/ m in离心5 min, 收集下
层液,上层液再加氯仿 1 mL, 涡旋 3 min, 超声 20
min, 静置 1 h, 4 000 r / min 离心 5 min, 收集下层
液,合并两次下层液,于 50 ( 水浴上用氮气吹干, 再
用甲醇溶解并定容至 100 L, 12 000 r/ m in离心 10
min, 取上清液, 即得。
2 4 专属性试验:取小鼠空白血浆、含药血浆以及
给药后的血浆样品处理后进样, HPLC 色谱图见
图 1。可见马钱子碱与内标士的宁的分离度良好,血
浆中内源性物质不会干扰测定。
1马钱子碱 2内标士的宁
1bruicne 2st rychnine ( internal standard)
图 1 空白小鼠血浆( A)、500 ng/ mL马钱子碱的含药血浆( B)
和经皮给药 40 mg/ kg马钱子碱溶液后 15 min的血浆样
品( C)的 HPLC色谱图
Fig 1 HPLC Chromatograms of blank plasma of mice ( A) ,
plasma sample with administration of 500 ng/ mL brucine
solution ( B) , plasma sample with percutaneous adminis
tration of 40 mg/ kg brucine solution after 15 min ( C)
2 5 标准曲线的制备:将马钱子碱溶液用空白大鼠
血浆稀释得到 50、100、200、500、1 000、2 000、5 000
ng/ mL,按血浆样品的处理项下依法操作,以血浆中
马钱子碱质量浓度为横坐标,对照品与内标峰高比为
纵坐标,用加权最小二乘法进行回归运算,得标准曲
线方程为 Y= 0 002 33 X + 0 078 63, r= 0 998 2,线
性范围 50~ 5 000 ng/ mL。
2 6 精密度试验: 精确吸取小鼠空白血浆 0 23
mL,加入甲醇配制的系列质量浓度马钱子碱对照品
溶液 20 L, 配制成高、中、低 3个质量浓度( 5 000、
500、50 ng/ mL)的马钱子碱血浆样品, 按标准曲线
的制备项下处理后进行分析, 各质量浓度日内重复
测定5次,并连续测定 5 d,每天 1次,日内精密度分
别为 6 26%、1 77%、3 49%, 日间精密度分别为
6 78%、3 18%、6 22%。
2 7 稳定性试验:取含马钱子碱 500 ng/ mL 的质
控血浆样品, 即时测定; 再置于- 20 ( 及室温反复
冻融 1~ 3次后测定,以即时测定值为 100%表示冻
融后的实验结果。冻融 1~ 3次后的质量浓度在即
时测定质量浓度的 95 91% ~ 90 45%, 表明冻融后
的稳定性良好。
2 8 回收率试验: 测定 5000、500、50 ng / mL 质控
1351 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
血浆各 3份,按标准曲线的制备项下处理后进行分
析,其马钱子碱峰高与未经提取的相同量对照品(甲
醇液)的峰高比较, 得马钱子碱的绝对回收率; 另将
马钱子碱与士的宁峰高比带入标准曲线方法, 计算
测得药物浓度, 与加入量比较,考察样品的方法回收
率。高( 5 000 ng/ mL)、中( 500 ng/ mL)、低( 50 ng/
mL)的绝对回收率分别为 ( 81 7 2 8) %、( 85
10) %、( 87 7) % ( n = 3 ) ; 方法回收率分别为
( 104 5) %、( 101 4) %、( 100 2 2 8) %。
2 9 药动学研究: 96只小鼠随机分为 2组,经皮给
药组实验前腹部机械脱毛。静脉注射组, 按 4 mg/
kg 剂量尾 iv 注射, 48只小鼠随机分为 8组, 每组 6
只,分别于给药前及给药后 5、10、20、30、40、60、90
min各取 1组处死并摘眼球取血放入肝素化试管
中,离心、分离血浆, - 20 ( 冷冻保存。经皮给药
组,按 40 mg/ kg 剂量将马钱子碱溶液涂抹于已脱
毛的腹部皮肤, 48只小鼠随机分为 8组,每组 6只,
分别于给药前及给药后 5、15、30、60、120、180、300、
480 min各取 1组处死并摘眼球取血放入肝素化试
管中,离心、分离血浆, - 20 ( 冷冻保存。
静脉注射、经皮给药后的血药浓度时间曲线见
图2。可见经皮给药后血药浓度能够迅速达到峰浓
度。静脉注射后,血药浓度波动很大,消除迅速; 而经
皮给药后,血药浓度相对平稳,且维持时间显著延长。
1静脉注射 4 mg kg- 1 2经皮给药 40 mg kg- 1
14 mg kg- 1 iv 2p ercu taneou s admin ist rat ion
of 40 m g kg- 1 b rucine
图 2 给药马钱子碱后小鼠的平均血浆药物浓度时间
曲线( n= 6)
Fig 2 Concentrationtime curves of percutaneous admi
nistration brucine solution of mice ( n= 6)
采用中国药理学会 3P97软件包进行房室模型
拟合并计算药动学参数(统计矩法)。药动学拟合结
果表明,静脉注射或两种方式经皮给药后的体内药
时曲线均符合二室模型。所拟合的药动学参数见
表 1。与静脉注射相比, 经皮吸收途径给药能够极
其显著地延长马钱子碱在体内的时间,经皮给药后,
表 1 静脉注射和经皮给药马钱子碱后的药动学参数(n= 6)
Table 1 Pharmacokinetic parameters of mice after iv
and percutaneous administration of brucine
solution (n= 6)
参 数 单位 静脉注射 经皮给药
AUC0 ) g h L- 1 553 00 1 912 00
AUC0t g h L- 1 508 00 1 669 00
MRT h 0 49 3 93
CL/ F L k g- 1 h - 1 7 23 2 09
Vs s/ F L kg- 1 3 56 8 22
K e h- 1 1 30 0 26
Cmax g L- 1 % 594 00
tm ax h- 1 0 25
MRT 为静脉注射的 8倍。经皮给药后的绝对生物
利用度为 32 8%。
2 10 经皮给药后药物残留量的测定:取 6只小鼠,
经皮给予 40 mg/ kg 马钱子碱溶液 8 h(即药物动力
学研究维持时间)后,处死,用生理盐水将给药部位
冲洗 5次,合并冲洗液, 定容后微孔滤膜滤过,取续
滤液, 按以上操作, HPLC 法测定马钱子碱质量浓
度并计算残留量。测得经皮给药 8 h 后给药部位的
药物残留量占给药剂量的( 24 8) % ( n= 6)。
3 讨论
马钱子碱具有较强的中枢神经毒性, 小鼠 iv 的
LD50仅为 12 mg / kg[ 10] , 因此静脉 iv 对照组采用了
4 mg / kg 的剂量,在此剂量下未发现有小鼠死亡。
经皮途径给药可能是避免马钱子碱毒性反应的
有效手段。马钱子碱同时具有中枢和外周镇痛作
用[ 3] ,经皮给药途径虽然在降低中枢神经毒性的同
时可能降低了其中枢镇痛作用, 但对外周镇痛作用
(如麻痹神经末梢)影响可能不大。本课题组所做的
药理学研究也表明: 马钱子碱经皮给药仍具有显著
的镇痛活性[ 9] ,采用马钱子碱溶液进行的评价未发
现其经皮给药存在皮肤刺激性。
马钱子碱的油水分配系数比较适中, 37 ( 下
lgP 为 0 70[ 7] ,体外透皮实验结果表明,马钱子碱能
够比较完全地通过小鼠皮肤 [ 8] , 但本实验测得的在
体经皮吸收的绝对生物利用度仅为 32 8%。皮肤
残留量的测定结果表明,实验结束后残留的药物仅
占给药剂量的约 1/ 4,即约有 75%的药物能够进入
皮肤,但绝对生物利用度仅为 32 8% , 是否是由于
存在经皮吸收过程中的代谢或皮肤内蓄积,还有待
于进一步的研究。
参考文献:
[ 1] Deng X K, Yin W, Li W D, e t al T he antitumor ef fect s of
alkaloids from the s eed s of st rychn os nu xvomica on HepG2
(下转第 1379页)
1352 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
平行试验 6份, RSD为 3 106% ,表明重现性良好。
2 7 仪器精密度:取同一样品溶液,连续测定 6次,
RSD 为 1 863%,表明仪器精密度良好。
2 8 加样回收试验: 取同一样品 5 份, 精密加入
1 000 g/ mL 镉标准液 0 25 L, 按 2 3 项操作。
平均回收率为 98 25% , RSD 为 4 886%。
2 9 样品测定:按 2 3项平行操作制备供试液。按
∗ 2 4+项条件测定。结果见表 3。因第 6、7 组在养
殖过程中全部死亡, 不计富集系数。
表 3 样品镉离子量测定结果 (x s, n= 3)
Table 3 Determination of cadmium in sample (x s, n= 3)
组别 躯干/ ( mg kg- 1 ) 内脏/ ( mg kg- 1) 全蚓/ ( mg kg - 1)
1 1 05 0 12 10 06 2 40 2 95 0 05
2 16 51 0 46 36 32 2 39 20 37 2 08
3 19 54 0 41 56 89 3 96 25 38 0 52
4 48 77 4 58 90 15 0 23 71 73 4 12
5 82 17 4 68 143 03 7 04 101 79 1 48
6 46 39 4 01 74 23 8 18 49 81 4 12
7 27 36 0 71 52 37 0 46 27 76 0 52
实验过程中密切观察各组参环毛蚓的活动状
态,按时随机取样检测其全蚓、躯干和内脏所含镉离
子的浓度, 并将其与各组土壤浓度进行比较分析。
结果表明, 1~ 4 组的参环毛蚓在整个 14 d 养殖过
程中均生长良好, 体质量保持不变或略有增加。此
时,蚓体内脏和全蚓的镉离子最高浓度分别为 90、
70 mg/ kg。随着养殖时间的推移, 高镉浓度污染的
第 6组和 7 组从第 5 天和第 6天开始出现异常情
况,表现为参环毛蚓活力下降, 体形变小, 体质量减
轻,或呈结节状,出现缢缩痕, 有的尾部脱落, 直到第
7天两组蚯蚓均全部死亡。在养殖至第 11 天和第
14天时,第 5组的参环毛蚓体形也发生变小或呈结
节状,并分别有 1条蚯蚓死亡。
3 讨论
本研究发现,中低浓度镉污染组中的参环毛蚓
均能正常存活,而且在此环境中蚓体内脏和全蚓的
镉离子浓度随土壤镉离子浓度递增而增加,最高可
达 90、70 mg / kg,该浓度是中国对外贸易经济合作
部发布的#药用植物及制剂进出口绿色行业标准∃中
所规定的中药材重金属镉离子限量的 233~ 300
倍。由此可见,参环毛蚓对重金属镉离子具有极强
的耐受能力, 这很可能是广地龙药材重金属超标的
重要原因之一。
实验中还发现生长良好的参环毛蚓 ( 1~ 4 组)
镉离子量内脏均高于躯干, 内脏镉量是躯干的
1 8~ 9 8倍,此结果表明,参环毛蚓主要是通过消化
系统吸收镉离子,此结果与 Sturzenbaum 等[ 3] 研究
粉正蚓 L umbricus rubellus 对镉的蓄积结果一致。
此外, 将参环毛蚓投入高浓度 ( 24 mg/ kg 以
上) 镉土壤中它会迅速死亡,而当投入到较低浓度
镉土壤中时, 参环毛蚓会适应此环境而正常存活,其
内脏和全蚓浓度可分别高达 90、70 mg/ kg 以上,该
浓度远远超过 24 mg/ kg。此结果提示参环毛蚓在
不超过生理极限的情况下,机体会产生某种有效的
重金属解毒机制, 而表现出机体对镉离子的高耐
受性。
总之, 上述实验结果为进一步研究参环毛蚓重
金属富集机制提供了必要的依据,同时,对于今后解
除参环毛蚓重金属富集作用的策略制定以及提高广
地龙药材品质优良度也具有重要意义。
参考文献:
[ 1] 冯耀南, 刘 明, 刘 俭, 等 中药材商品规格质量鉴别
[ M ] 广州:暨南大学出版社, 1995
[ 2] 喻良文, 裘建社, 李 薇, 等 参环毛蚓对土壤含水量及 pH
值因子的选择研究 [ J] 时珍国医国药, 2009, 20( 6) : 1310
1311
[ 3] Sturzrzenbaum S R, Kille P, M organ A J T he ident ifi ca
ti on , cloning and ch aracterizat ion of earthw orm metalloth io
nein [ J] FEBS L et t , 1998, 431( 3) : 437442
(上接第 1352页)
cells and it s poss ible m echan ism [ J ] J Ethnophar macol ,
2006, 106: 179186
[ 2] 徐丽君,魏世超,陆付耳,等 马钱子若干组分治疗实验性关
节炎的比较研究[ J] 同济医科大学学报, 2001, 30( 6) : 564
565
[ 3] Yin W, Wang T S, Yin F Z, et al Analges ic and ant i inflm
matory pr op ert ies of b rucine and brucine Noxide ext racted
f rom seeds of S t rychnos nuxv omica [ J ] J Ethnophar macol ,
2003, 88: 205214
[ 4] 林明侠,张 浩,徐 涛 马钱子的毒理学研究 [ J ] 中医药
信息, 2002, 19( 1) : 2526
[ 5] 张 路,简江波,盛 燕,等 马钱子碱脂质体的大鼠离体透
皮性能和兔皮肤刺激性研究[ J ] 中国医药工业, 2006, 37
( 3) : 172174
[ 6] 宋金春,王玉广 马钱子碱微乳的制备及其体外透皮吸收的
研究[ J] 中国药学杂志, 2006, 41( 12) : 928931
[ 7] 陈 军,胡 巍,蔡宝昌,等 马钱子碱体外经皮吸收性质考
察[ J] 中药材, 2008, 31( 3) : 445447
[ 8] 胡 巍,陈 军,蔡宝昌 马钱子碱与士的宁体外经皮渗透性
质的考察[ J] 中国新药杂志, 2008, 17( 12) : 10531056
[ 9] 胡 巍,陈 军,蔡宝昌,等 马钱子碱经皮给药的镇痛作用
[ J] 中华中医药学刊, 2008, 26( 2) : 385386
[ 10] Malone M H , St J A, Katherine M , et al Brucin e lethal it y
in mice [ J ] J Ethnoph ar macol , 1992, 35(3) : 295297
1379 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月