全 文 ：知母组织培养的初步研究
洪森荣, 尹明华*
(上饶师范学院 生命科学学院,江西 上饶 334001)
摘 要:目的 以知母种子为试验材料, 对知母的组织培养进行了初步研究, 以期建立知母的再生体系。方法 采
用植物组织培养和单因子试验的方法对知母无菌体系的建立、分蘖芽的增殖、分蘖愈伤组织的诱导和再分化以及
再生苗的移栽进行研究。结果 知母种子最佳的消毒方式是 75%酒精处理 30 s 后用 0 1%H gCl2 处理 15 min; 知
母分蘖芽增殖的最佳培养基是 MS+ KT 1 mg / L+ NAA 0 5 mg / L ;知母分蘖愈伤组织诱导的最佳培养基是 M S+
KT 2 mg/ L+ NAA 0 5 mg/ L; 知母愈伤组织再分化的最佳培养基是 MS+ KT 2 mg/ L+ NAA 0 1 mg/ L; 知母愈
伤组织再生芽最佳的生根培养基是 1/ 2MS+ NAA 0 5 mg / L ; 知母试管苗最佳的移栽基质是腐殖土。结论 本实
验建立了知母的再生体系,为知母试管苗的工厂化生产奠定了技术基础。
关键词:知母; 组织培养;分蘖; 愈伤组织;再生
中图分类号: R282 6 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11188604
Preliminary study on Anemarrhena asphodeloides tissue culture
HONG Senrong, YIN M inghua
( Co lleg e of L ife Sciences, Shang rao No rmal U niversit y, Shangr ao 334001, China)
Abstract: Objective T he t issue culture of A nemarr hena asphodeloides was preliminarily studied to
establish A asp hodeloides reg eneration system Methods The establishment o f A asphodeloied s sterile
system , t iller bud pro liferat ion, t iller cal lus induct ion and its redifferent iat ion as w ell as t ransplanting of
regenerated plant lets w ere studied by plant t issue cultur e and sing le facto r test method Results T he best
disinfection w ay of A asphodeloid es seeds w as f ir st ly dealt w ith 75% ethanol for 30 s and then dealt w ith
0 1% HgCl2 for 15 min; T he best medium of bud proliferat ion for A asp hodeloides tillers w as M S+ KT
1 mg/ L+ NAA 0 5 mg/ L; T he best medium of A asphodeloid es t iller callus induction w as M S + KT
2 mg/ L+ NAA 0 5 mg/ L; T he best medium of A asp hodeloides t illers callus redif ferentiat ion w as MS+
KT 2 mg/ L+ NAA 0 1 mg/ L ; T he best roo ting medium of A asphodeloides callus regenerat ion buds w as
1/ 2 M S+ NAA 0 5 mg / L ; T he best t ransplant ing subst rate of A asphodeloides plantlets w as humus so il
Conclusion T he regener at ion sy stem of A asphodeloides is established, w hich pro vides a technolog ical
basis for facto ry product ion of A asp hodeloides plant lets
Key words: A nemar rhena asphodeloides Bunge; t issue cultur e; t iller s; callus; regenerat ion
知母 A nemar r hena asphodeloides Bunge 为百
合科知母属(单种属)多年生宿根植物, 广布温带地
区,多为野生[ 1] 。知母为常用中药, 以干燥根茎入
药。知母性味苦、甘、寒, 归肺、胃、肾经 [ 2]。主要功
能为清热泻火, 生津润燥,用于外感热病、高热烦渴、
肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘 [ 3]。知母
的化学成分主要为甾体皂苷、双苯吡酮类、木脂素
类、多糖类等, 活性成分主要是甾体皂苷和芒果
苷[ 4]。知母皂苷能抑制血小板聚集, 改善大鼠脑缺
血再灌注损伤 [ 4]。芒果苷是知母清热作用的主要有
效成分,同时具有抗炎、抗病毒、抗氧化、利尿、预防
肥胖等作用[ 5] 。目前关于知母的研究,主要集中于
知母的化学成分[ 4] 、药理作用 [ 67]、生殖生物学[ 8] 、资
源调查[ 9] 和栽培管理[ 1011] 等方面, 而关于知母组织
培养的研究,国内研究极少,郭晋华等[ 12] 对知母胚
轴试管苗的诱导进行了研究; 李宝平等[ 13] 利用知母
叶片诱导出了愈伤组织,并分化出大量再生植株;梁
玉玲等[ 14] 研究了知母悬浮培养条件下的体细胞胚
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收稿日期: 20100218 基金项目:上饶师范学院 20102011年度院级科技项目作者简介:洪森荣,男,硕士,讲师,研究方向为植物生物技术。Email: h ong sen ron g@ 163 com
* 通讯作者 尹明华,女,硕士,研究方向为生物技术。Email: yinm inghua@ 163 com
胎发生,并对体胚发育过程进行了观察。但有关知
母再生体系的研究缺乏系统报道。本研究在建立知
母种子萌发无菌苗的基础上, 探讨植物生长调节剂
等因素对知母植株分蘖增殖及其愈伤组织诱导和再
生的影响,为其试管苗的工厂化生产提供理论依据
和技术基础。
1 材料与方法
1 1 材料:知母种子由浙江省景宁县梧桐乡药材专
业合作社提供, 由上饶农业科学研究所何长水研究
员鉴定。
1 2 知母种子的预处理: 挑选无病虫害、健壮饱满
的知母种子用饱和洗衣粉浸泡 20 m in左右,取出后
再用自来水反复冲洗数次,备用。
1 3 知母种子的消毒:将预处理过的外植体用 4种
不同的消毒方式进行灭菌。第 !方式: 75%酒精消
毒 30 s; 第 ∀方式: 75% 酒精消毒 30 s 后用 0 1%
HgCl2 消毒 10 m in; 第 #方式: 75%酒精消毒 30 s
后用 0 1%HgCl2 消毒 15 m in;第∃方式: 75%酒精
消毒 30 s后用 0 1%HgCl2 消毒20 min。灭菌过程
中轻轻搅拌种子使灭菌更加彻底,每次灭菌后均用
无菌水冲洗 3~ 4次,再用灭菌滤纸片将种子的水分
吸干, 最后将种子接种到装有 1/ 2M S的固体培养基
上,每天观察并记录知母种子的污染和萌发情况。
第 30天时统计知母种子的污染率和萌发率。
污染率= (污染的种子数/接种的总种子数) % 100%
萌发率= 萌发的种子数/接种的总种子数 % 100%
1 4 知母分蘖的芽增殖:从知母无菌苗上切离带芽
分蘖( 1 5~ 2 cm )接种至增殖培养基上。增殖培养
基成分如下: M S; M S + KT 1 mg/ L + NAA 0 1
mg/ L; MS+ KT 1 mg/ L + NAA 0 5 mg / L ; MS +
KT 1 mg/ L+ NAA 1 mg/ L。所用培养基中蔗糖量
均为 30 g / L ,冷凝脂(购于北京振泰园艺设施公司)
质量浓度均为 7 5 g/ L , pH 5 8~ 6 0。光照时间:
12 h/ d;光照强度: 1 000 ~ 2 000 lx ; 温度 ( 25 & 1)
∋ 。每天观察并记录知母分蘖的芽增殖情况,第 30
天时统计试管苗的新生芽数、根数、根长和株高。
1 5 知母分蘖愈伤组织的诱导: 将知母带芽分蘖
( 0 5~ 1 5 cm)从增殖培养基上切下来,接种于愈伤
组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基成分如
下: M S; M S+ KT 2 mg/ L+ NAA 0 1 mg / L ; M S+
KT 2 mg/ L+ NAA 0 5 mg / L ; MS+ KT 2 mg / L+
NAA 1 mg/ L。所用培养基中蔗糖质量浓度均为
30 g/ L , 冷凝脂质量浓度均为 7 5 g / L , pH 5 8 ~
6 0。黑暗培养; 温度: ( 25 & 1) ∋ 。每天观察并记
录知母分蘖愈伤组织的诱导情况,第 30天时统计知
母分蘖的出愈率。
出愈率= 出愈的分蘖数/接种的总分蘖数% 100%
1 6 知母分蘖愈伤组织的再分化:将知母愈伤组织
在最佳诱导培养基上继代 2次, 然后接种于愈伤组
织分化培养基上。愈伤组织分化培养基成分如下:
M S; MS+ KT 2 mg/ L+ NAA 0 1 mg/ L; M S+ KT
2 mg/ L + NAA 0 5 mg/ L ; M S + KT 2 mg/ L +
NAA 1 mg / L。所用培养基中蔗糖质量浓度均为
30 g / L ,冷凝脂质量浓度均为 7 5 g/ L, pH 5 8~
6 0。光照时间: 12 h/ d; 光照强度: 1 000~ 2 000
lx ;温度( 25 & 1) ∋ 。每天观察并记录知母分蘖愈
伤组织的再分化情况, 第 30天时统计知母愈伤组织
的出芽率。
出芽率= 出芽的愈伤组织块数/接种的总愈伤组织块
数% 100%
1 7 知母分蘖愈伤组织再生芽的生根: 将知母愈伤
组织的再生芽从分化培养基上切离下来,接种于生根
培养基上。生根培养基成分如下: 1/ 2MS; 1/ 2MS+
NAA 0 1 mg/ L; 1/ 2M S+ NAA 0 5 mg/ L; 1/ 2MS+
NAA 10 mg/ L; 1/ 2MS+ NAA 1 5 mg/ L。所用培
养基中蔗糖质量浓度均为 30 g/ L,冷凝脂量均为 7 5
g/ L , pH 5 8~ 6 0。光照时间: 12 h/ d; 光照强度:
1 000~ 2 000 lx;温度( 25 & 1) ∋ 。每天观察并记录
知母分蘖愈伤组织再生芽的生根情况, 第 30天时统
计知母愈伤组织再生芽的生根情况。
生根率= 生根的再生芽数/接种的总再生芽数% 100%
1 8 知母再生菌的移栽:知母再生苗生根培养 30 d
后,在自然光下闭瓶炼苗 3 d,再打开瓶口锻炼 3 d
后,洗去附着的培养基, 即可移栽于培养钵的基质
中。移栽基质设 2个处理: 沙土、腐殖土。每日浇灌
MS的基本培养液,移栽 30 d后统计知母再生苗的
成活率。
成活率= 成活的再生苗数/移栽的总再生苗数% 100%
1 9 统计方法:以上实验均重复 3 次, 所有数据表
示为 x & s。实验数据用 SPSS10 0 软件 OneWay
ANOVA 分析后,再进行 LSD法或 t检验。
2 结果
2 1 知母种子消毒方式的筛选:由表 1可知,知母
种子经单一消毒剂消毒后, 污染率较高;而经复合消
毒剂处理后污染率显著降低, 且污染率随 HgCl2 处
理时间的延长而逐渐下降, 其中 H gCl2 处理 15 min
和 20 m in的污染率最低, 两者的污染率相互比较没
有显著性差异。所以建立知母种子无菌体系较好的
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消毒方式为 75%酒精处理 30 s后再用 0 1% HgCl2
处理 15~ 20 m in。但从萌发率来看, H gCl2 处理时
间延长将导致知母种子萌发率下降, 其中 HgCl2 处
理 10 m in 和 15 m in 后种子的萌发率没有显著差
异,但 H gCl2 处理 20 min 后种子的萌发率与处理
10 m in和15 min比较则显著下降。因此,综合污染
率和萌发率的实验结果, 知母种子的最佳消毒方式
为 75%酒精处理 30 s 后再用 0 1% HgCl2 处理 15
min, 用这种消毒方式处理知母种子 30 d可获得知
母的无菌苗。
2 2 知母分蘖的芽增殖:从表 2可知,直接从种子无
菌苗切取其分蘖接种到培养基上可以直接获得知母的
再生苗,而且长芽生根可以在 30 d完成,所以这可视为
知母快速繁殖的手段之一。对照组没有激素,只长芽
表 1 不同消毒方式对知母种子的消毒效果
Table 1 Disinfection of different sterilization
methods on A asphodeloides seeds
处理类别 污染率/ % 萌发率/ %
!( CK) 85 4& 5 6aA 89 6& 6 4aA
∀ 68 5 & 89bB 793 & 9 6bA
# 326 & 114cC 75 4& 10 6bA
∃ 294 & 7 9cC 63 5& 87cB
不生根,而且长芽时间很晚,大约需要 20~ 30 d。而添
加了植物激素,均可促进知母分蘖的长芽和生根。在
KT 浓度一定( 1 mg/ L)的情况下, 适当提高 NAA 浓
度,可提高新生芽数、株高以及根长和根数,但 NAA浓
度如过大,则会抑制知母分蘖的生长。因此,知母分蘖
芽增殖的最佳培养基为 MS+ KT 1 mg/ L+ NAA 0 5
mg/ L。在该培养基上,知母分蘖可在 3~ 5 d长芽, 7~
8 d生根, 30 d时可长成一个健壮的小植株。
2 3 知母分蘖愈伤组织的诱导:从表 3可知,直接
从种子无菌苗取其分蘖接种到培养基上可以获得知
母分蘖的愈伤组织。对照组没有激素, 知母分蘖无
法诱导出愈伤组织。而添加了植物激素, 则可促进
知母分蘖愈伤组织的诱导。在 KT 浓度一定 ( 2
mg/ L )的情况下,适当提高 NAA 浓度,可提高出愈
率,但 NAA 浓度如过大,则会抑制知母分蘖愈伤组
织的诱导。因此, 知母分蘖愈伤组织诱导的最佳培
养基为 MS+ KT 2 mg/ L+ NAA 0 5 mg / L。在该
培养基上,知母分蘖可在 7~ 8 d诱导出愈伤组织,
10~ 12 d绿色愈伤组织开始增殖, 颜色也由浅绿色
变成黄白色, 30 d 时如不进行继代, 则可长满整个
三角瓶。
表 2 植物生长调节剂对知母分蘖芽增殖的影响
Table 2 Effect of plant growth regulators on bud proliferation of A asp hodeloides tillers
培养基 新生芽数/个 株高/ cm 根数/个 根长/ cm
MS( CK) 0 8 & 0 3cC 16 & 0 9cC 0dC 0cC
MS+ KT 1 mg L- 1 + NAA 01 mg L- 1 2 3 & 0 6bB 5 6 & 1 2bB 3 4 & 1 3bB 6 2 & 23bB
MS+ KT 1 mg L- 1 + NAA 05 mg L- 1 4 5 & 05aA 11 4 & 2 4aA 5 2 & 2 1aA 10 2 & 1 9aA
MS+ KT 1 mg L- 1 + NAA 1 mg L- 1 2 8 & 0 4bB 6 2 & 2 2bB 25 & 1 6cB 7 2 & 16bB
表 3 植物生长调节剂对知母分蘖愈伤组织诱导的影响
Table 3 Ef fect of plant growth regulators on callus
induction of A asp hodeloides tillers
培养基 出愈率/ %
MS( CK) 0 & 0dD
MS+ KT 2 mg L- 1 + NAA 0 1 mg L- 1 72 1 & 13 6bB
MS+ KT 2 mg L- 1 + NAA 0 5 mg L- 1 100 & 0aA
MS+ KT 2 mg L- 1 + NAA 1 mg L- 1 53 2 & 17 8cC
2 4 知母分蘖愈伤组织的再分化: 从表 4 可知, 把
知母分蘖诱导的愈伤组织接种到培养基上可以获得
知母的再生芽。对照组没有激素,知母分蘖诱导的
愈伤组织无法再生新的芽。而添加了植物激素, 则
可促进知母分蘖愈伤组织的再分化。在 KT 浓度一
定( 2 mg / L )的情况下, NAA 浓度增大, 则出芽率显
著下降。因此, 知母分蘖愈伤组织脱分化的最佳培
养基为 MS+ KT 2 mg/ L+ NAA 0 1 mg/ L。在该
培养基上,知母分蘖诱导的愈伤组织可在 5~ 6 d诱
导出浅绿色的芽, 随后再生芽增多, 8~ 9 d 绿色的
芽开始生根, 30 d 时如不把芽切离, 则再生的芽和
根可长满整个三角瓶, 再生的完整植株如转移到新
的培养基( M S+ KT 2 mg/ L + NAA 0 1 mg/ L+
PP3330 5 mg/ L )进行壮苗,也可移栽成活, 所以这也
可视为知母快速繁殖的手段之一。
表 4 植物生长调节剂对知母分蘖愈伤组织再分化的影响
Table 4 Effect of plant growth regulators on callus
redifferentiation of A asphodeloides tillers
培养基 出芽率/ %
MS ( CK) 0& 0dD
MS+ KT 2 m g L- 1+ NAA 0 1 m g L- 1 100& 0aA
MS+ KT 2 m g L- 1+ NAA 0 5 m g L- 1 84 3& 11 7bB
MS+ KT 2 m g L- 1+ NAA 1 mg L- 1 56 3& 12 3cC
2 5 知母分蘖愈伤组织再生芽的生根: 从表 5可
知,把知母分蘖愈伤组织再生的芽接种到培养基上
可以获得知母的再生苗。对照组没有激素,知母分
蘖愈伤组织再生芽无法生根。而添加了NAA, 则可
促进知母分蘖愈伤组织再生芽的生根。在培养基为
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1/ 2M S的条件下, NAA浓度增大,则可促进再生芽
生根,但 NAA 浓度过大,则又会抑制根的生长。因
此,知母分蘖愈伤组织再生芽生根的最佳培养基为
1/ 2M S+ NAA 0 5 mg/ L。在该培养基上, 知母分
蘖愈伤组织再生芽可在 3~ 4 d再生出白色的根, 随
后根逐渐增多, 新生芽也增多, 30 d 时则可长成一
个完整的植株。
表5 植物生长调节剂对知母分蘖愈伤组织再生芽生根的影响
Table 5 Effect of plant growth regulators on rooting of shoots
regenerated from A asp hodeloides tillers calli
培养基 出愈率/ %
1/ 2MS( CK) 0 & 0dD
1/ 2MS+ NAA 0 1 mg L- 1 763 & 15 2bB
1/ 2MS+ NAA 0 5 mg L- 1 100 & 0aA
1/ 2MS+ NAA 1 0 mg L- 1 843 & 11 7bB
1/ 2MS+ NAA 1 5 mg L- 1 563 & 12 3cC
2 6 知母再生苗的移栽: 当知母再生苗高达 5 cm
左右,根长为 2~ 3 cm 时 [ 13] , 便将其移栽到沙土或
腐殖土中。再生苗在腐殖土上的成活率[ ( 95 3 &
6 1) %]与沙土上的成活率[ ( 84 5 & 12 1) % ]比较
具有显著性差异。因此, 知母再生苗的最佳移栽基
质为腐殖土。
3 讨论
种子是建立植物无菌体系的良好外植体, 但如
何控制种子的污染是关系到组培实验的关键 [ 15]。
本实验表明,升汞灭菌时间延长虽可降低污染率, 但
同时也导致了知母种子的萌发率下降, 这与多花黑
麦种子灭菌[ 16] 的实验结果一致。本研究结果还表
明,培养基中添加 1 mg / L KT 和 0 5 mg / L NAA
可以显著提高知母分蘖芽和根的萌发, 过高或过低
的 NAA 浓度均会抑制知母分蘖的生长发育, 这与
前人的研究结果一致 [ 17]。之前的研究表明,知母叶
片和下胚轴在含有 2, 4D的 MS培养基上均可诱导
愈伤组织并能高频再生植株, 但较低浓度的 KT 和
NAA或 IBA组合则可促进叶片愈伤组织再生芽生
根[ 1314]。而在本实验中, 利用知母分蘖也能诱导愈
伤组织,在 2 mg/ L KT 的条件下, 适当提高 NAA
浓度, 可显著提高出愈率。愈伤组织诱导初期为浅
绿色(胚性愈伤组织)后转为黄白色(非胚性愈伤组
织) , 多为半透明疏松的圆形或卵圆形细胞。分蘖愈
伤组织在 2 mg / L KT 和 0 1 mg/ L NAA 的 MS培
养基上可高频出芽,且随着培养时间延长而逐渐生
根。在 1/ 2M S培养基中添加 0 5 mg / L NAA 也可
诱导分蘖愈伤组织再生芽转接后大量生根。分蘖再
生植株移栽于腐殖土中成活率均可达到 95%以上,
这与前人报道结果一致 [ 13]。因此, 从这方面讲, 用
分蘖诱导出的愈伤组织优于叶片和下胚轴诱导的愈
伤组织,因为分蘖诱导的愈伤组织可以脱分化直接
再生出完整的植株应用于生产达到快速繁殖的目
的。目前,国内外对于知母再生体系的建立仅见通
过叶片和下胚轴诱导愈伤组织的途径[ 1314] ,而成功
地从知母分蘖诱导愈伤组织并使其再生完整植株的
研究鲜有报道。本实验结果为知母优良品系培育、
快繁推广以及最终走向产业化生产提供了科学依据
和技术支持。
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