全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月 ·1326·
牛黄解毒片中黄芩苷的 HPLC 法测定结果的不确定度评定研究
王惠娟 1，王 力 2*，刘艳新 2
1. 佳木斯大学附属第一医院 药剂科，黑龙江 佳木斯 154002
2. 佳木斯市药品检验所，黑龙江 佳木斯 154007
摘 要：目的 对牛黄解毒片中黄芩苷的 HPLC 法测定结果的不确定度进行评定。方法 按照《中国药典》2010 年版一部
牛黄解毒片的测定方法，通过建立数学模型，对测定结果的不确定度进行评定。结果 分析和量化了各不确定度分量，并合
成了标准不确定度和扩展不确定度。结论 对照品的质量不确定度是牛黄解毒片中黄芩苷的 HPLC 法测定主要的不确定度
来源。
关键词：牛黄解毒片；黄芩苷；高效液相色谱；不确定度；数学模型
中图分类号：R286.02 文献标志码：B 文章编号：0253 - 2670(2011)07 - 1326 - 04
Uncertainty evaluation on baicalin content determination of Niuhuang Jiedu
Tablets by HPLC
WANG Hui-juan1, WANG Li2, LIU Yan-xin2
1. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154002, China
2. Jiamusi Institute for Drug Control, Jiamusi 154007, China
Key words: Niuhuang Jiedu Tablets; baicalin; HPLC; uncertainty; mathematical model

测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的
分散性，与测量结果相联系的参数，它是对测量结
果质量的定量表征[1-2]。中国合格评定认可委员会
（CNAL）在对实验室认可时，都要求开展测量不确
定度的评定。本实验依据国家质量技术监督局发布
的计量技术规范《测量不确定度评定与表示》[3]，并
参考其他文献报道[4-5]，对 HPLC 法测定牛黄解毒片
中黄芩苷的测量不确定度进行了分析并考察了不确
定度的主要来源[6-7]，为该实验过程的控制和检验报
告的评估提供了科学的依据。
1 仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱仪（Agilent 公司）
经黑龙江省计量检定测试院检定为合格计量器具；
色谱柱为 Agilent TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；
赛多利斯 BS110S 电子天平（d＝0.1 mg）和瑞士
Mettler AE240 电子天平（d＝0.1 mg/0.01 mg）经佳
木斯市计量检定测试所检定为 1 级工作天平；实验
所用玻璃器皿均为天玻牌 A 级。
黄芩苷对照品（批号 110715-200514）购自中
国药品生物制品检定所；牛黄解毒片（批号 070428、
070446、070304，小片）由贵州百灵企业集团制药
有限公司生产；所用水为超纯水；甲醇为色谱纯；
其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 牛黄解毒片中黄芩苷的 HPLC 法测定
2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 Agilent TC C18
色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-
水-磷酸（45︰55︰0.2），检测波长 315 nm。理论板
数按黄芩苷峰计算不低于 3 000。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照
品 8.41 mg（M0），置 100 mL 单标线量瓶中，加甲
醇适量，振摇使溶解并稀释至刻度（V0），摇匀，得
对照品储备液。用单标线吸管精密量取对照品储备
液 10 mL（V1），置 25 mL 单标线量瓶中，用甲醇

收稿日期：2010-09-11
作者简介：王惠娟（1966—），女，黑龙江佳木斯人，主管药师，从事中药质量控制研究工作。
Tel: 13124545174 E-mail: wanghuijuan1962@163.com
*通讯作者 王 力 Tel: (0454)6878209 E-mail: liuyanxin1965@163.com
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稀释至刻度（V2），摇匀，用 0.25 μm 微孔滤膜滤
过，即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 取牛黄解毒片 20 片，除
去包衣，精密称定为 4.542 3 g（MT），研细，精密称
取药品粉末 0.617 2 g（Mx），置锥形瓶中，加 70%
乙醇 30 mL，超声处理（功率 250 W，频率 33 kHz）
20 min，放冷，滤过，滤液置 100 mL 单标线量瓶中，
用少量 70%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同
一量瓶中，加 70%乙醇至刻度（Vx1），摇匀；用单
标线吸管精密量取 2 mL（Vx2），置 10 mL 单标线量
瓶中，加 70%乙醇至刻度（Vx3），摇匀，用 0.25 μm
微孔滤膜滤过，即得。
2.1.4 测定和计算 精密量取对照品溶液和供试品
溶液各 2 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，
计算，测定结果见表 1。在实际操作中，对照品溶
液制备 2 份，分别进样 3 次，峰面积均折合成称量
8.41 mg（M0）对照品计算，平均峰面积（A0 平均）
为 144.30；供试品（批号 070428）溶液平行制备 2
份，分别进样 3 次，峰面积均折合成称量药品粉末
0.617 2 g（Mx）计算，平均峰面积（Ax 平均）为 97.58，
按照建立的数学模型计算，牛黄解毒片每片含黄芩
以黄芩苷计为 4.2 mg。

表 1 牛黄解毒片中黄芩苷的测定结果 (n＝3)
Table 1 Determination of baicalin of Niuhuang
Jiedu Tablets (n = 3)
批 号 黄芩苷/(mg·片−1) RSD/%
070428 4.2 0.36
070304 4.1 0.38
070446 4.2 0.36

2.2 不确定度的评定
2.2.1 数学模型和不确定度计算公式
X＝Cx×Vx1×f，而 CX＝（Ax/A0）×C0×[MT/
（20×Mx）]，C0＝（M0/V0）×（V1/V2），f＝Vx3/Vx2
代入则有：X＝（Ax×M0×V1×MT×Vx3×Vx1）/
（A0×V0×V2×20×Mx×Vx2）
式中 X 为牛黄解毒片每片以黄芩苷计算的质
量，Cx 为供试品溶液的质量浓度，Vx1 为供试品第
一次定容体积，f 为供试品溶液稀释倍数，C0 为对
照品溶液的质量浓度，Ax 为供试品溶液峰面积，A0
为对照品溶液峰面积，M0 为精密称取对照品的质
量，MT为 20 片药品的质量，Mx 为精密称取供试品
的质量，V0为对照品第 1 次定容体积，V1 为稀释时
量取对照品储备液体积，V2 为对照品第 2 次定容体
积，Vx2 为稀释时量取供试品溶液的体积，Vx3 为供
试品溶液第 2 次定容体积。
假设 u[X]、u[Ax]、u[V1]、u[MT]……分别为 X、
Ax、V1、MT……的不确定度，u[X]/X、u[Ax]/Ax、
u[V1]/V1、u[MT]/MT……分别为 X、Ax、V1、MT……
的相对标准不确定度，则相对标准不确定度计算公
式为：（u[X]/X）2＝（u[Ax]/Ax）2＋（u[A0]/A0）2＋
（u[M0]/M0）2＋（u[V0]/V0）2＋（u[V1]/V1）2＋（u[V2]/
V2）2＋（u[MT]/MT）2＋（u[Mx]/Mx）2＋（u[Vx3]/
Vx3）2＋（u[Vx2]/Vx2）2＋（u[Vx1]/Vx1）2。
2.2.2 不确定度因果关系分析 根据以上数学模型
和不确定度计算公式，可以得出测定结果（X）的
不确定度分量分别来源于 Ax、M0、V1、MT、Vx3、
Vx1、A0、V0、V2、Mx、Vx2，对这 11 个不确定度来
源，按性质又可以分为体积类不确定度（V0、V1、
V2、Vx3、Vx2、Vx1）、峰面积类不确定度（Ax、A0）、
质量类不确定度（M0、MT、Mx）。体积类不确定度
主要来源 4 种：①体积校准允差；②体积重复性；
③温度影响；④人员读数。峰面积类不确定度主要
来源于峰面积重复性；质量类不确定度主要来源 2
种：①天平校准；②天平称量重复性。每一个不确
定度分量中又应考虑每一个影响因素，直至影响因
素变得足够小，对结果的影响可以忽略时为止。
2.3 不确定度分量的量化
2.3.1 对照品质量分数的不确定度 黄芩苷对照品
因未给出质量分数和限度标识，故此项不考虑。
2.3.2 体积类不确定度
（1）对照品第 1 次定容体积（V0）的不确定度：
①100 mL 单标线量瓶体积校准：单标线量瓶（100
mL）A 级品的法定允差为±0.10 mL，按三角形分
布进行计算，不确定度为 0.10 mL/60.5＝0.040 9 mL。
②100 mL 单标线量瓶体积重复性：体积重复性不确
定度来源于连续核查排出的满刻度体积液体的标准
偏差，为 A 类不确定度，通常用称量法确定。对单
标线量瓶（100 mL）A 级品的重复性进行评估，称
得液体的质量分别为 99.607、99.598、99.605、99.596、
99.598、99.598、99.609、99.606、99.595、99.608 g；
按照 Bessel 公式计算，不确定度为 0.001 8 mL。③温
度：温度引起的不确定度来源于与校准温度不同时
引起的体积差别。本空调实验室温度在（20±3）℃
波动，水溶液的体积膨胀系数约 2.1×10−4/℃，按照
矩形分布计算，不确定度为 3 ℃×2.1×10−4/℃×
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100 mL/30.5＝0.036 4 mL。④人员读数：实际使用
体积容器允许有≤1%的读数误差，假设为三角形
分布，则由人员读数引起的不确定度为1%×100 mL/
60.5＝0.408 3 mL。⑤合成以上不确定度来源，计算
对照品第 1 次定容体积（V0）的不确定度 u[V0]＝
（0.040 92＋0.001 82＋0.036 42＋0.408 32）0.5＝0.412 0
mL，则相对标准不确定度 u[V0]/V0＝0.412 0 mL/
100 mL＝4.12×10−3。
（2）对照品第 2 次定容体积（V2）的不确定度：
所用单标线量瓶为 25 mL，A 级品。①体积校准：
单标线量瓶（25 mL）A 级品的法定允差为±0.03
mL，不确定度为 0.03 mL/60.5＝0.012 3 mL。②温度：
25 mL 单标线量瓶温度引起的不确定度为 3
℃×2.1×10−4/℃×25 mL/30.5＝0.009 1 mL。③体积
重复性：对 25 mL 单标线量瓶 A 级品的重复性进行
评估，称得液体质量分别为 24.926、24.932、24.930、
24.921、24.933、24.926、24.932、24.936、24.929、
24.927 g；按照 Bessel 公式计算，不确定度为 0.001 4
mL。④人员读数：由人员读数引起的不确定度为
1%×25 mL/60.5＝0.102 1 mL。⑤合成以上不确定度
来源，计算 u[V2]＝(0.012 32＋0.009 12＋0.001 42＋
0.102 12)0.5＝0.103 3 mL，则相对标准不确定度
u[V2]/V2＝0.103 3 mL/25 mL＝4.13×10−3。
（3）稀释时量取对照品储备液体积（V1）的不
确定度：所用单标线吸管为 10 mL，A 级品。①体
积校准：单标线吸管（10 mL）A 级品的法定允差
为±0.020 mL，不确定度为 0.020 mL/60.5＝0.008 2
mL。②温度：10 mL 单标线吸管由温度引起的不确
定度为 3 ℃×2.1×10−4/℃×10 mL/30.5＝0.003 7
mL。③体积重复性：对 10 mL 单标线吸管 A 级品
的重复性进行评估，排出液体质量分别为 9.974 7、
9.973 2、9.973 2、9.976 1、9.975 9、9.974 9、9.974 9、
9.973 2、9.974 7、9.975 2 g；按照 Bessel 公式计算，
不确定度为 0.000 4 mL。④人员读数：由人员读数
引起的不确定度为 1%×10 mL/60.5＝0.040 9 mL。⑤
合成以上不确定度来源，计算 u[V1]＝（0.008 22＋
0.003 72＋0.000 42＋0.040 92）0.5＝0.041 9 mL，则相
对标准不确定度 u[V1]/V1＝0.041 9 mL/10 mL＝
4.19×10−3。
（4）供试品第 1 次定容体积（Vx1）的不确定
度：使用单标线量瓶（100 mL）A 级品定容，u[Vx1]/
Vx1＝4.12×10−3。
（5）供试品第 2 次定容体积（Vx3）的不确定度：
所用单标线容量瓶为 10 mL，A 级品。①体积校准：
单标线量瓶（10 mL）A 级品的法定允差为±0.020
mL，不确定度为 0.020 mL/60.5＝0.008 2 mL。②温
度：10 mL 单标线量瓶由温度引起的不确定度为 3
℃×2.1×10−4/℃×10 mL/30.5＝0.003 7 mL。③体积
重复性：对 10 mL 单标线量瓶 A 级品的重复性进行
评估，称得液体质量分别为 9.974、9.971、9.980、
9.983、9.976、9.991、9.982、9.970、9.975、9.979 g；
按照 Bessel 公式计算，不确定度为 0.002 0 mL。④
人员读数：由人员读数引起的不确定度为 1%×
10 mL/60.5＝0.040 9 mL。⑤合成以上不确定度来源，
计算 u[Vx3]＝（0.008 22＋0.003 72＋0.002 02＋
0.040 92）0.5＝0.042 0 mL，则相对标准不确定度
u[VX3]/VX3＝0.042 0 mL/10 mL＝4.20×10−3。
（6）稀释时量取供试品溶液体积（Vx2）的不确
定度：所用单标线吸管为 2 mL，A 级品。①体积校
准：单标线吸管（2 mL）A 级品的法定允差为±0.010
mL，不确定度为 0.010 mL/60.5＝0.004 1 mL。②温
度：2 mL 单标线吸管由温度引起的不确定度为 3
℃×2.1×10−4/℃×2 mL/30.5＝0.000 8 mL。③体积
重复性：对一单标线吸管（2 mL）A 级品的重复性
进行评估，排出液体质量分别为 2.001 5、2.000 6、
2.002 4、2.002 1、2.002 5、2.002 1、2.001 0、2.002 5、
2.001 9、2.002 0 g；按照 Bessel 公式计算，不确定度
为 0.000 3 mL。④人员读数：由人员读数引起的不确
定度为 1%×2 mL/60.5＝0.008 2 mL。⑤合成以上不
确定度来源，计算 u[Vx2]＝（0.004 12＋0.000 82＋
0.000 32＋0.008 22）0.5＝0.009 2 mL，则相对标准不
确定度 u[Vx2]/Vx2＝0.009 2 mL/2 mL＝4.60×10−3。
2.3.3 质量类不确定度
（1）20 片药品质量（MT）的不确定度：①天
平校准：天平校准不确定度来源于天平校准时有限
的准确度。使用的赛多利斯（BS110S）电子天平
（d＝0.1 mg）为 1 级工作天平，检定证书给出最大
允差为±1.0 mg，按照矩形分布计算，不确定度为
1.0 mg/30.5＝0.577 mg。②天平称量重复性：参考《化
学分析中不确定度的评估指南》有关数据为 0.5×最
后一位有效数字，由于赛多利斯（BS110S）电子天
平的最后一位有效数字为 0.1 mg，所以不确定度为
0.5×0.1 mg＝0.05 mg。③合成以上不确定度来源，
计算单次称量不确定度为（0.5772＋0.0502）0.5＝
0.579 mg，因称量使用减重法，因而 u[MT]＝
（2×0.5792）0.5＝0.819 mg，则相对标准不确定度
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u[MT]/MT＝0.819 mg/4.542 3 g＝1.81×10−4。
（2）供试品质量（Mx）的不确定度：①天平校
准：不确定度为 1.0 mg/30.5＝0.577 mg。②天平称量
重复性：不确定度为 0.5×0.1 mg＝0.05 mg。③合
成以上不确定度来源，u[Mx]＝0.819 mg，u[Mx]/Mx＝
0.819 mg/0.617 2 g＝1.33×10−3。
（3）对照品质量（M0）的不确定度：①天平
校准：由于电子天平（d＝0.01 mg）为 1 级工作天
平，检定证书给出最大允差为±0.10 mg，按照矩形
分布计算，不确定度为 0.10 mg/30.5＝0.058 mg。②
天平称量重复性：由于电子天平最后一位有效数字
为 0.01 mg，所以不确定度为 0.5×0.01 mg＝0.005
mg。③合成以上不确定度来源，u[M0]＝0.082 mg，
u[M0]/M0＝0.082 mg/8.41 mg＝9.75×10−3。
2.3.4 峰面积类不确定度
（1）对照品溶液峰面积（A0）重复性不确定
度：来源主要是对照品重复进样时峰面积的标准
偏差，按照 Bessel 公式 u[A0]＝（∑（A0－ 0A ）2/
（n（n－1）））0.5 计算。对照品溶液平行制备 2 份（对
照品取样量分别为 8.41、8.50 mg），分别进样 3 次，
按照对照品取样量 8.41 mg 计算，黄芩苷色谱峰的
校正峰面积（A0）分别为 144.05、144.15、144.10、
144.50、144.52、144.49，平均值为 144.30，u[A0]＝
9.12×10−2 ，则相对标准不确定度 u[A0]/A0 ＝
9.12×10−2/144.30＝6.32×10−4。
（2）供试品溶液峰面积（Ax）重复性不确定度：
供试品溶液平行制备 2 份（供试品取样量分别为
0.617 2、0.617 9 g），分别进样 3 次，按照供试品取
样量 0.617 2 g 计算，黄芩苷色谱峰的校正峰面积
（Ax）分别为 97.73、96.92、97.52、97.79、97.80、
97.70，平均值为 97.58，按照 Bessel 公式计算
u[Ax]＝0.137 7，u[Ax]/Ax＝0.137 7/97.58＝1.41×10−3。
2.4 不确定度的合成
根据计算公式合成各不确定度分量后，得到牛
黄解毒片每片以黄芩苷计算的量（X）的相对标准不
确定度 u[X]/X＝（（4.12×10−3）2＋（4.19×10−3）2＋
（4.13×10−3）2＋（4.12×10−3）2＋（4.60×10−3）2＋
（4.20×10−3）2＋（1.81×10−4）2＋（1.33×10−3）2＋
（9.75×10−3）2＋（6.32×10−4）2＋（1.41×10−3）2）0.5＝
14.37×10−3 ，则质量分数的不确定度 u[X] ＝
14.37×10−3×4.2 mg＝0.1 mg。
2.5 扩展不确定度的评定
扩展不确定度 U＝K×u[X]，取包含因子 K＝2，
则有 U＝2×0.1 mg＝0.2 mg。
2.6 结果的表示
根据评定结果，最后牛黄解毒片每片含黄芩苷
计算的量可表示为 X＝（4.2±0.2）mg（K＝2）。
3 讨论
从各不确定度分量可看出，本实验中对照品质
量不确定度是主要的不确定度来源，其次是体积类
不确定度，再次是供试品质量不确定度和供试品溶
液峰面积重复性不确定度。因此，对照品的称量是
影响本实验测定结果的主要因素，应重点加以控制。
一般影响质量类不确定度的因素有：称量物品的质
量和天平的精度。称量物品的质量越大，天平的精
度越高，由天平不确定度导致的对测定结果的影响
就越小，因此增大对照品的取样量和使用高精度天
平有利于降低不确定度，提高检测结果的可靠性。
体积类和峰面积类不确定度主要和使用的玻璃
容器及 HPLC 色谱仪的级别有关。一般使用刚刚经
过校准的A级玻璃容器并且尽量减小读数误差及使
用检定参数稳定的 HPLC 色谱仪，均有利于降低体
积和峰面积类不确定度对实验结果的影响；此外，
控制好实验室的温、湿度，使之与仪器校正时的环
境参数相近，也有利于改善体积类和峰面积类不确
定度对检测结果的影响。
参考文献
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