全 文 ：黄连解毒汤有效成分对缺氧／复氧时脑微血管内皮细胞
ＩＣＡＭ１表达的影响
袁拯忠１，朱陵群２，庞　鹤２，单泽松１，王硕仁２，高永红２，牛福玲２
（１．温州医学院 附属第一医院，浙江 温州 ３２５０００；
２．北京中医药大学 东直门医院 中医内科学教育部重点实验室，北京 １００７００）
［收稿日期］　２００８０７２２
［基金项目］　国家人事部留学回国人员科技活动基金 （２００２）；教
育部科学技术研究重点项目 （０３０３０）
［通信作者］　袁拯忠，Ｔｅｌ：（０５７７）８８６２６７９１，Ｅｍａｉｌ：ｗｚｙｚｚ２００８＠
１２６ｃｏｍ
　　中风病的临床表现与脑缺血再灌注损伤后的
炎症反应密切相关。脑血管内皮细胞表面可以表达
多种黏附分子。在缺血再灌注脑损伤级联反应中，
多种黏附分子的高表达在整个损伤过程中有重要作
用。细胞间黏附分子１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅ
ｃｕｌｅ１，ＩＣＡＭ１）属于黏附分子免疫球蛋白基因超家
族，在炎症反应中起重要作用。本实验探讨黄连解
毒汤有效成分栀子苷、黄芩苷和小檗碱对 ＩＣＡＭ１
的基因和蛋白表达的影响，研究其作用机制。
１　材料
１．１　动物、药物、仪器　具体内容见参考文献［１］。
１．２　试剂　ＩＣＡＭ１羊多克隆抗体（美国 Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ公司，北京中杉金桥有限公司代理，ＳＣ１５１１）。
２　方法［１］
２．１　设计引物　从 ＧＥＮＥＢＡＮＫ上查 ＳＤ大鼠
ＩＣＡＭ１的ｃＤＮＡ序列，以引物设计软件Ｐｒｅｍｉｅｒ５０
自动设计。引物交由北京赛百盛生物有限公司合
成。选用看家基因甘油醛３磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）
作内参照，以校正计算ＩＣＡＭ１ｍＲＮＡ含量。
ＩＣＡＭ１（３８８ｂｐ）：上游 ５′ＡＣＴＡＧＡＧＧＡＧＴ
ＧＡＧＣＡＧＧＴＴＡ３′，下游５′ＡＧＴＧＴＣＴＣＡＴＴＣＣＣＡＣＧ
ＧＡＧ３′，ＧＡＰＤＨ（５３０ｂｐ）：上游 ５′ＡＴＧＡＴＴＣＴＡＣ
ＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧ３′，下 游 ５′ＴＴＣＡＧＣＴＣＧＧＧＧＡＴ
ＧＡＣＣＴＴ３′。
２．２　用 ＲＴＰＣＲ试剂盒扩增 ＩＣＡＭ１和 ＧＡＰＤＨ　
参照 ＡｃｃｅｓｓＰＴＰＣＲｓｙｓｔｅｍ试剂盒说明书，每个
ＰＣＲ管反应体系如下：５×缓冲液 １０μＬ；ｄＮＴＰ１
μＬ；２５ｎｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＳＯ４３μＬ；ＡＭＶ反转录酶 １
μＬ；ＴｆｉＤＮＡ聚合酶１μＬ；ＲＮＡ模板１ｎｇ；５０ｎｍｏｌ·
Ｌ－１ＩＣＡＭ１上、下游引物各 １μＬ；１０ｎｍｏｌ·Ｌ－１
ＧＡＰＨ上、下游引物各 １μＬ；补水到 ５０μＬ。混匀
后，放入ＰＣＲ仪。
ＩＣＡＭ１扩增条件如下：反转录反应 ４５℃ ４５
ｍｉｎ；ＡＭＶ反转录酶灭活９４℃ ２ｍｉｎ；变性９４℃ １
ｍｉｎ；退火５７℃１ｍｉｎ；延伸７２℃１ｍｉｎ；３５循环；最
终延伸７２℃ ７ｍｉｎ；４℃保存。
２．３　统计学处理　实验数据以 珋ｘ±ｓ表示，ＳＰＳＳ
１００进行数据统计和方差分析检验。
３　结果
３．１　对脑微血管内皮细胞ＩＣＡＭ１蛋白表达的影响
　各组细胞胞浆呈现浅黄色颗粒，胞核不着色或者浅
染，模型组颜色最深，正常组着色最浅。各给药组细
胞胞浆颜色明显比模型组浅，接近正常组的颜色。
模型组的Ａ值显著高于正常组，差异有统计学
意义（Ｐ＜００１）。除０００７ｍｍｏｌ·Ｌ－１黄芩苷组外
其余各给药组的 Ａ值与模型组相比均有明显的降
低，差异有统计学意义（Ｐ＜００１）。仅０００７ｍｍｏｌ
·Ｌ－１黄芩苷组的 Ａ值显著高于正常组，差异有统
计学意义（Ｐ＜００５）；其余各给药组与正常组的差
异无统计学意义。模型组的平均面积显著高于正常
组，差异有统计学意义（Ｐ＜００１）。各给药组的平
均面积显著低于模型组，差异有统计学意义
（Ｐ＜００１）。０１２８ｍｍｏｌ·Ｌ－１栀子苷组和 ００２４
ｍｍｏｌ·Ｌ－１小檗碱组平均面积小于正常组，差异有
统计学意义（Ｐ＜００５），其余各给药组与正常组的
差异无统计学意义。见表１。
３．２　对脑微血管内皮细胞 ＩＣＡＭ１ｍＲＮＡ表达的
影响　各组 ＲＮＡ提取的量在 ０７～１３ｇ·Ｌ－１。
Ａ２６０／Ａ２８０在１８～２０。
　　模型组ｍＲＮＡ表达显著高于正常组，差异有统
计学意义（Ｐ＜００１）。除００３２ｍｍｏｌ·Ｌ－１栀子苷
·０５０１·
第３４卷第８期
２００９年４月
　　　　　　 　 　 　 　 　　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　８
　Ａｐｒｉｌ，２００９
　　 表１　栀子苷、黄芩苷和小檗碱对脑微血管内
皮细胞ＩＣＡＭ１蛋白表达的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１２）
分组
浓度
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
Ａ
平均面积
／μｍ２
模型　 － ００８５±０００５ ０７１０±０１１８
正常　 － ００７３±０００２１） ０３３８±００８１１）
栀子苷 ０１２８ ００７４±０００３１） ０２０６±００６２１，２）
　 ００６４ ００７２±０００２１） ０４０９±０１０６１）
　 ００３２ ００６９±０００４１） ０４４０±００８５１）
黄芩苷 ００２８ ００７６±０００３１） ０２２０±００７５１）
　 ００１４ ００７６±０００４１） ０２６２±００７８１）
　 ０００７ ００７９±０００５２） ０３１２±００７６１）
小檗碱 ００２４ ００７４±０００２１） ０２１２±００４９１，２）
　 ００１２ ００７１±０００４１） ０３４５±００８４１）
　 ０００６ ００７３±０００２１） ０４３５±００７２１）
　　注：与模型组比１）Ｐ＜００１；与正常组比２）Ｐ＜００５。
组和０００７ｍｍｏｌ·Ｌ－１黄芩苷组外，其余各给药组
ｍＲＮＡ表达低于模型组，差异均有统计学意义（Ｐ＜
００５）。除 ０１２８ｍｍｏｌ·Ｌ－１栀子苷组和 ００２４
ｍｍｏｌ·Ｌ－１小檗碱组外，其余各给药组 ｍＲＮＡ表达
均高于正常组，差异均有统计学意义（Ｐ＜００５）。
各给药组存在着药物浓度越高抑制作用越强的趋
势。见表２。
表２　栀子苷、黄芩苷和小檗碱对脑微血管内皮细胞
ＩＣＡＭ１ｍＲＮＡ表达的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
分组 剂量／ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＩＣＡＭ１／ＧＡＰＤＨ
模型　 － １４１０±００７０
正常　 － １１１８±００４５２）
栀子苷 ０１２８ １１９５±００４５２）
　 ００６４ １２３４±００５１２，３）
　 ００３２ １３２６±００２８４）
黄芩苷 ００２８ １２１２±００７２２，３）
　 ００１４ １３０４±００６２１，４）
　 ０００７ １３４７±００６７４）
小檗碱 ００２４ １１８０±００１９２）
　 ００１２ １２６７±００５７２，４）
　 ０００６ １２８５±００５０１，４）
　　注：与模型组比１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１；与正常组比３）Ｐ＜
００５，４）Ｐ＜００１。
４　讨论
ＩＣＡＭ１是影响白细胞穿过血脑屏障、参与脑缺
血再灌注损伤后炎症反应的一种重要的黏附分
子［２］。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法、免疫组化法、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，
ＲＴＰＣＲ和定量即时ＲＴＰＣＲ等方法都检测了缺血
再灌注大鼠脑缺血区 ＩＣＡＭ１ｍＲＮＡ的表达及
ＩＣＡＭ１蛋白质的合成增加，采用神经保护剂可以减
少ＩＣＡＭ１升高［３６］。Ｈｅｓｓ等报道，在体外培养的人
脑ＭＶＥＣ在缺氧２０ｈ复氧４ｈ后，细胞内 ＩＣＡＭ１
ｍＲＮＡ转录及 ＩＣＡＭ１的表达量均明显增加，约持
续２０ｈ后下降［７］。同样，临床研究也有类似结果。
脑梗死患者梗死区 ＩＣＡＭ１的表达增强而且早期脑
缺血组织即有 ＩＣＡＭ１表达［８９］。因此，抑制缺血再
灌注损伤后脑血管 ＩＣＡＭ１表达，可以减轻炎症反
应，从而改善临床症状，加速功能恢复。笔者通过免
疫细胞化学和 ＲＴＰＣＲ的方法分别对 ＩＣＡＭ１蛋白
和ｍＲＮＡ进行测定，结果表明缺氧／复氧损伤可以
诱导大鼠脑血管内皮细胞 ＩＣＡＭ１蛋白和 ｍＲＮＡ高
表达，而分别给与不同剂量的栀子苷、黄芩苷和小檗
碱可以有效抑制 ＩＣＡＭ１蛋白和 ｍＲＮＡ的表达，并
且在基因水平存在着药物浓度越高抑制作用越强的
趋势。所以作者认为抑制 ＩＣＡＭ１的表达是栀子、
黄芩、黄连、黄柏等清热解毒药物对缺血再灌注损伤
后脑血管的保护机制之一。
［参考文献］
［１］　 袁拯忠，朱陵群，庞　鹤，等．黄连解毒汤有效成分对缺氧／复
氧时脑微血管内皮细胞 ＶＣＡＭ１表达的影响［Ｊ］．中国中药
杂志，２００８，３３（２３）：２８１３．
［２］　 ＧｉｍｅｎｅｚＭＡ，ＳｉｍＪＥ，ＲｕｓｓｅｌＪＨ．ＴＮＦＲ１ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＩＣＡＭ
１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙａｓｔｒｏｃｙｔｅｓｅｘｐｏｓｅｓｔｈｅＣＮＳｔｏｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｉｎｆｌａｍ
ｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１５１（１／２）：１１６．
［３］　 ＺｈａｎｇＲＬ，ＺｈａｎｇＺＧ，ＣｈｏｐｐＭ，ｅｔａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓｗｉｔｈｔｉｓ
ｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒａｌｔｅｒｓａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ
ｔｈｅｉｓｃｈｅｍｉａｒａｔｂｒａｉｎ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，１９９９，３０（３）：６２４．
［４］　 ＧｅＨ，ＷｅｎＹ，ＹａｎｇＧ，ｅｔａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｃｅｌｕ
ｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ１ｉｎｍｏｕｓｅｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉｃｍｏｄｅｌ
［Ｊ］．ＣｈｉｎＭｅｄＪ（ＥｎｇＬ），２０００，１１３（１）：７５．
［５］　 ＢｅｒｔｉＲ，ＷｉｌｉａｍｓＡＪ，ＭｏｆｅｔＪＲ，ｅｔａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅ
ＲＴＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ
ｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｂｒａｉｎｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．ＪＣｅｒｅｂＢｌｏｏｄＦｌｏｗ
Ｍｅｔａｂ，２００２，２２（９）：１０６８．
［６］　 ＤｉｎｇＣ，ＨｅＱ，ＬｉＰＡ．ＤｉａｂｅｔｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＣＡＭ
ａｆｔｅｒａｂｒｉｅｆｐｅｒｉｏｄｏｆｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，
２００５，１６１（１／２）：６１．
［７］　 ＨｅｓｓＤＣ，ＺｈａｏＷ，ＣａｒｏｌＪ，ｅｔａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ＩＣＡＭ１ｄｕｒｉｎｇｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｂｒａｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ［Ｊ］．
Ｓｔｒｏｋｅ，１９９４，２５（７）：１４６３．
［８］　ＳｏｂｅｌＲＡ，ＭｉｔｃｈｅｌＭＥ，ＦｏｎｄｒｅｎＧ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｃｅｌｕｌａｒａｄｈｅ
ｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ１（ＩＣＡＭ１）ｉｎｃｅｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅ
ｈｕｍａｎｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＡｍＪＰａｔｈｏｌ，１９９０，１３６（６）：
１３０９．
［９］　ＬｉｎｄｓｂｅｒｇＪ，ＣａｒｐｅｎＯ，ＰａｅｔａｕＡ，ｅｔａｌ．ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＩＣＡＭ１ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｈｕｍａｎｉｓ
ｃｈｅｍｉｃｓｔｒｏｋｅ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９６，９４（５）：９３９．
［责任编辑　古云侠］
·１５０１·
第３４卷第８期
２００９年４月
　　　　　　 　 　 　 　 　　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　８
　Ａｐｒｉｌ，２００９