全 文 ：蜜环菌菌种的复壮研究
王淑芳，杨金玲，朱 平，朱慧新，何惠霞
（中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所 卫生部天然药物生物合成重点实验室，北京 １０００５０）
［摘要］ 目的：研究蜜环菌菌种的复壮问题。方法：应用摇瓶扩繁无性后代的方法，观察几种培养基和不同培
养方法对蜜环菌菌索形成的影响，并挑取新鲜粗壮菌索的先端部分进行斜面培养。结果：在富含有机氮的半固体
培养基上蜜环菌最易形成粗壮的菌索。结论：选择适当的培养基及培养方法摇瓶扩繁蜜环菌后代，再进行选择培
养是复壮蜜环菌菌种最简易的方法。
［关键词］ 蜜环菌；菌索；复壮
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０２０１２１０３
［收稿日期］ ２００７０２２８
［通讯作者］ 朱平，Ｔｅｌ：（０１０）６３１６５１９７，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｕｐｉｎｇ＠ｉｍｍ．
ａｃ．ｃｎ
蜜环菌是名贵中药天麻块茎生长发育必不可少
的共生菌。栽培天麻时如无蜜环菌菌材伴栽，天麻
块茎就会因得不到营养而无法长大并逐渐消亡。现
代医学证明，蜜环菌本身就是一种具有天麻药效的
药用真菌，蜜环菌可作为传统中药天麻的代用
品［１］。但无论伴栽天麻还是发酵生产天麻蜜环菌
片、蜜环片［２］，所用蜜环菌菌种经长期多次传代后
都会逐渐发生退化，明显表现为在琼脂斜面上萌发
菌丝慢，菌丝不易形成菌索或仅形成少量纤细少分
支并很快变为褐色的菌索，有时只形成一片片褐色
皮壳状硬块，其上面菌丝丛不多，培养基表面白色菌
丝也很少，所以其特有的在黑暗中能发出荧光的特
性很弱，甚至没有。已发生退化的菌种不仅会影响
伴栽天麻的产量［３］，也会影响其发酵生产蜜环片的
产量和质量。菌索粗壮、分支旺盛的菌株发酵得到
的每克干菌丝中的多糖含量一般较高［４］，其中的２
种多糖均能抑制四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖升高［５］。
菌索是蜜环菌生活史中存在较长的一个阶段，子实
体在菌索上产生。不形成菌索的蜜环菌较难通过培
养子实体来复壮，但根据蜜环菌好气性的生物学特
性，选用摇瓶深层培养得到较多碎小的新生菌丝段，
通过半固体摇瓶培养与静置，可将一株保存 ２０多
年、经多次传代、不易形成菌索的退化菌株，恢复为
生长旺盛、菌索发达且荧光强的菌株。
１ 仪器与材料
高压灭菌锅、无菌操作超净台、摇床。亮竹蜜环
菌 Ａｒｍｉｌａｒｉａｍｅｌｅａ为本实验室 １９８６年保存菌
种［６］。
２ 方法
２．１ 菌种无性后代的扩繁
２．１．１ 培养基 菌种斜面：５％麦麸煮３０ｍｉｎ滤液
１０００ｍＬ，加入１０ｇ葡萄糖，１０ｇ蔗糖，１ｇＫＨ２ＰＯ４，
０５ｇＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，１８ｇ琼脂。
种子摇瓶：１％ 豆饼粉，２％ 葡萄糖，０１％
ＫＨ２ＰＯ４，００５％ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，自来水配制，ｐＨ自
然。培养瓶：① ５％麦麸煮汁滤液（液体）；② 麦麸
滤渣（固体）；③ ５％麦麸煮汁不滤渣（半固体）；④
同斜面琼脂培养基（固体）。以上各培养基除菌种
斜面用试管外，其余均用三角瓶。液体、半固体培养
基用５００ｍＬ瓶，装量２００ｍＬ，固体培养基用１００ｍＬ
三角瓶，装量为瓶体积的１／３～１／２，压成斜面即可，
每处理４瓶，常规高压灭菌３０ｍｉｎ。
２．１．２ 扩繁方法 从４℃冷库取出保存２０多年经
多次传代的蜜环菌母种试管，由于菌种退化，无菌
索，只是在褐色菌皮上有一些驼色的菌丝丛，并且培
养基表面的白色菌丝较少，所以接种种子摇瓶时，每
瓶１支，截为２～３段，接种后摇床暗培养，转速１５０
ｒ·ｍｉｎ－１，温度２３℃。因菌种衰老，在摇瓶中调整
适应期较长，扩繁时间为３周以上，瓶内充满较多米
粒大小的菌丝球后备用。
将种子菌液接入４种培养基后，①和③先放摇
床上摇培４ｄ，生长旺盛后静置，②和④接种后即静
置，２５℃避光培养１个月。
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第３３卷第２期
２００８年１月
中 国 中 药 杂 志
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２．２ 不同培养基与浓度比较
２．２．１ 培养基 用含２％葡萄糖，０２％ ＫＨ２ＰＯ４和
０１％ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ的水溶液配制含４种不同氮源
的培养基：①５％麦麸滤汁；②１％豆饼粉汁；③
０２５％ ＮＨ４ＮＯ３液；④麸豆滤渣。
２．２．２ 配制与培养 按 ５００ｍＬ三角瓶装量 ２００
ｍＬ，用琼脂将①，②，③ ３种营养液分别配制成不同
体积分数的半固体，依次为 ０％，０２％，０４％，
０６％，每处理３瓶，④为①和②的混合滤渣（含水
２３０％）按重量比均分于各三角瓶中，依次形成４个
浓度即０％，９％，１８％，２７％，培养基常规高压灭菌
３０ｍｉｎ。菌源为麦麸滤渣培养的菌种，每瓶接入 １
ｃｍ３菌块，接种时将菌块放在瓶口尽量压碎，先摇培
９０ｈ，然后２５℃避光静置培养１个月。
２．３ 培养基添加有机氮固形物及培养方法
基于添加琼脂配制的综合 ＮＨ４ＮＯ３半固体培养
基缺少有机氮营养，将琼脂改为含少量有机氮的硬
木屑及稻壳粉，按２．２．１方法中③将 ＮＨ４ＮＯ３基本
液配分别制成含固形物１％，３％，５％，７％，３重复，
灭菌、接种和培养方法均同上。
３ 结果
３．１ 扩繁菌种生长状况
由于蜜环菌在自然界中菌索多贴附在树木皮层
缝隙中，所以在４种不同物态的培养基上，同样的种
子菌液出现了不同的生长状况。①麦麸煮汁滤液
（液体）：上液面飘浮多块圆形褐色绒状菌丝丛，下
有淡棕色冻状菌丝团，未形成明显菌索；②麦麸滤渣
（固体）：上表面为生有驼色菌丝丛的菌皮，瓶壁及
底部可见白色线状菌索；③５％麦麸煮汁不滤渣（半
固体）：上表面有驼色菌丝丛，培养基内充满白色粗
壮多分支的贴瓶壁的菌索；④麸汁综合琼脂（固
体）：上表面及周边有褐色菌线与白色菌丝形成大
小不等分隔区，底部可见白色菌索。
在人工培养条件下，蜜环菌在固体培养基上均
可形成菌索，但从其长势及生长量上来看半固体培
养基培养效果较好，便于从直观上分辨菌索的形成
以尽快筛选到复壮的菌株。
３．２ 菌索形成状况
各处理的菌索形成状况见表１。综合麦麸滤汁
和综合豆饼粉汁所有培养瓶中都能形成菌索，不添
加琼脂也能形成菌索，但菌索较细且呈浅红褐色。
加０２％及０４％琼脂后菌索形成较多且较粗壮，主
菌索直径可达３ｍｍ。而ＮＨ４ＮＯ３处理的１２瓶，均未
形成菌索，但摇瓶期菌丝发出荧光最早，亮度最强，
可能是因为其可溶性速效营养被菌利用得快，菌丝
生长旺盛，而摇培３ｄ后其荧光亮度下降至不及其
他３种培养基；静置后 ＮＨ４ＮＯ３处理缺长效有机氮，
所以营养不足以使菌形成菌索。在麸豆滤渣处理
中，无论滤渣多少，每瓶均可形成菌索。只有未添加
滤渣的处理，因仅仅是葡萄糖和无机盐溶液，缺乏氮
源，营养不足，所以未形成菌索。
表１ 各处理的菌索形成状况
形成菌索瓶数／培养瓶数
琼脂
／％
综合麦麸
滤汁
综合豆饼
粉汁
综合０２５％
ＮＨ４ＮＯ３液
００ ３／３ ３／３ ０／３
０２ ３／３ ３／３ ０／３
０４ ３／３ ３／３ ０／３
０６ ３／３ ３／３ ０／３
未添加琼脂的含９％，１８％，２７％湿麸豆滤渣的
３个处理均能形成菌索，未添加滤渣的处理则不能
形成菌索。
３．３ 硬木屑及稻壳粉对菌索形成的影响
硬木屑及稻壳粉对菌索形成的影响结果见表
２。无论硬木屑还是稻壳粉，由于有机氮含量较低，
远不及麦麸及豆饼粉，所以其含量为１％的培养瓶
中只形成一团团菌丝，上表面有较多驼色及白色菌
丝丛，下边菌丝连成一片片浅褐色的膜，未形成菌
索。含硬木屑或稻壳粉３％及更高浓度的各培养瓶
中则都形成了菌索，但菌索均较细长，直径大多在１
ｍｍ左右，没有综合麦麸及综合豆饼粉的培养基中
长出的菌索粗壮、量多，但长期静置又比添加琼脂有
利于菌索洁白颜色的保持。
表２ 硬木屑及稻壳粉对菌索形成的影响
形成菌索瓶数／培养瓶数
含固形物／％ 硬木屑 稻壳粉
１ ０／３ ０／３
３ ３／３ ３／３
５ ３／３ ３／３
７ ３／３ ３／３
综上所述，已退化的不能形成菌索的蜜环菌菌
种，通过摇瓶扩繁形成大量米粒大小菌丝球、菌丝片
后，可通过含有机氮和葡萄糖的半固体摇瓶进一步
培养后静置，生活力强的菌丝球或片段即脱颖而出
并快速生长，形成粗壮旺盛的菌索，挑取新鲜菌索的
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先端部分移植于试管斜面上即可得到复壮的菌株。
［参考文献］
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［６］ 王淑芳，徐贵祥，杨永春．室温条件下药用真菌菌种的保藏
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ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎｏｆＡｒｍｉｌａｒｉａｍｅｌｅａ
ＷＡＮＧＳｈｕｆａｎｇ，ＹＡＮＧＪｉｎｌｉｎｇ，ＺＨＵＰｉｎｇ，ＺＨＵＨｕｉｘｉｎ，ＨＥＨｕｉｘｉａ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＨｅａｌｔｈ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，
ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００５０，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎｏｆＡｒｍｉｌａｒｉａｍｅｌｅａｓｔｒａｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｓｅｖｅｒａｌｉｎｇｒｅ
ｄｉｅｎｔｓａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒａｌｍｅｔｈｏｄｓｏｎｔｈｅｓｈｏｅｓｔｒｉｎｇｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｌｏｎａｌｏｆｓｐｒｉｎｇｓｉｎｆｌａｓｋ，ａｎｄｓｅｌｅｃｔｔｈｅｔｉｐｐａｒｔｏｆｔｈｅｓｈｏｅｓｔｒｉｎｇ
ｆｏｒｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｓｔｒｏｎｇｓｈｏｅｓｔｒｉｎｇｓｗｅｒｅｅａｓｉｌｙｒｅｓｔｏｒｅｄｉｎｔｈｅｓｅｍｉｓｏｌｉｄｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｒｉｃｈｏｒｇａｎｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅ．Ｃｏｎ
ｃｌｕｓｉｏｎ：ＩｔｗａｓｔｈｅｅａｓｉｅｓｔｗａｙｔｏｒｅｊｕｖｅｎａｔｅＡ．ｍｅｌｅａｓｔｒａｉｎｂｙｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇｔｈｅｃｌｏｎａｌｏｆｓｐｒｉｎｇｓｉｎａｐｒｏｐｅｒｍｅｄｉｕｍ，ｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｔｈｅ
ｐｒｏｐｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ａｒｍｉｌａｒｉａｍｅｌｅａ；ｓｈｏｅｓｔｒｉｎｇ；ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ
［责任编辑 张宁宁］
［收稿日期］ ２００７０６１８
［基金项目］ 国家科技攻关计划项目（２００４ＢＡ７２１Ａ２０）；国家“十一五”科技支撑计划项目（２００６ＢＡＩ０６Ａ１２１１）
［通讯作者］ 郭巧生，Ｔｅｌ：（０２５）８４３９６５９１，Ｅｍａｉｌ：ｇｑｓ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
土壤因子对怀菊质量影响研究
郭巧生１，梁迎暖１，张重义２，王桃银１，汪 涛１
（１．南京农业大学 中药材研究所，江苏 南京 ２１００９５；
２．河南农业大学 中药材研究所，河南 郑州 ４５０００２）
［摘要］ 目的：研究土壤因子对怀菊内在质量的影响。方法：分别测定河南温县、江苏南京和浙江桐乡三地怀
菊样品中绿原酸、总黄酮和微量元素的含量，并分析相应土壤的理化性质，测定矿质元素含量，通过相关分析和通
径分析研究土壤环境对怀菊内在质量的影响。结果与结论：结果表明三地怀菊内在质量差异显著，土壤因子对怀
菊内化学成分含量有很大的影响，其中直接作用较大的依次是脲酶活性、速效钾、ＣＥＣ和速效磷的含量，而且其微
量元素与土壤矿质元素有很好的相关性，其中怀菊对土壤中镁、砷的富集能力较强。
［关键词］ 怀菊；内在质量；土壤
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０２０１２３０６
药用菊花 ＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍＲａｍａｔ．为 菊科植物，其干燥头状花序为常用中药，有散风清
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第３３卷第２期
２００８年１月
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ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
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Ｊａｎｕａｒｙ，２００８