全 文 ：西洋参锈腐病菌拮抗放线菌 Ｆ０５发酵培养基的优化
张爱华，周国兴，雷锋杰，张连学
（吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 １３０１１８）
［摘要］ 目的：从老参地土壤中分离得到一株对西洋参锈腐病菌具有良好拮抗作用的菌株 Ｆ０５，对该菌株的发酵培养基
进行了初步研究，确定了其最佳培养基组成。方法：利用单因素试验和均匀设计试验优化培养基组分。结果：优化结果碳源
为玉米秆粉，氮源为磷酸氢二铵，无机盐为硫酸镁、磷酸氢二钾，质量分数分别为３７２０６％，０５３１２％，００３５５％，００４００％，
优化后活菌生物量为１５７×１０９ＣＦＵ·ｍＬ－１。
［关键词］ 发酵；优化；放线菌；均匀设计；复配
［收稿日期］ ２００９０４１４
［基金项目］ 国家“十一五”科技支撑计划子课题（２００６ＢＡ１０９８０４０２）
［通信作者］ 张连学，教授，从事药用植物学方面的研究。Ｅｍａｉｌ：
ｚｌｘｂｏｏｋｓｅａ＠１６３．ｃｏｍ
［作者简介］ 张爱华，在读博士研究生，从事药用植物生物防治研
究。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｘ＿ｘｚｈｏｕ＠１２６．ｃｏｍ
西洋参锈腐病是对西洋参栽培过程中危害较重
的一种根部病害，主要是由毁坏柱孢菌 Ｃｙｌｉｎｄｒｏ
ｃａｒｐｏｎｄｅｓｔｒｕｃｔａｎｓＳｃｈｏｌｔｏｎ所引起的土传病害。一般
年发病率在３０％左右，严重地块高达７０％以上。患
病参根变色腐烂，几乎失去药用价值和商品价值。
对西洋参病害的防治，国内外多采用化学防治，１年
需施药１０余次。大量化学农药的施用，不但污染环
境，而且带来农药残留问题，降低了品质以及经济效
益。本实验筛选了病原菌的拮抗放线菌并对其进行
了培养基的优化，同时探讨了生产上常用的农药与
放线菌复配的可行性，以期实现对西洋参锈腐病进
行综合防治。
１ 材料与方法
１．１ 培养基种类
分离与筛选培养基：高氏１号培养基；发酵种子
培养基：液体马铃薯蔗糖培养基；原始发酵培养基：
麦麸３％，豆饼粉１５％；发酵培养基：本实验筛选的
碳源为麦麸、玉米粉、玉米秸秆粉，氮源为豆饼粉、
脲、磷酸氢二铵，无机盐为硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸
亚铁、氯化钠。
１．２ 拮抗放线菌的分离与筛选
选好采集地点后，铲去表层土，四分法取样，装
入无菌牛皮纸袋中，带回实验室尽快分离。放线菌
的分离参照文献方法［１］，其筛选参照文献［２］采用稀
释平板法［３］对土样进行分离，并筛选出对西洋参锈
腐病菌的抑制率最大的菌株。
抑制率＝对照菌落半径－处理菌落半径对照菌落半径－原菌饼半径
１．３ 发酵种子液制备
将筛选出的菌株培养于试管中，４℃冰箱保存
备用。用前于３２℃培养箱活化４８ｈ，将活化好的菌
种扩繁于９０ｍｍ的培养皿中。接种时，将平板菌种
接种于盛有２００ｍＬ无菌培养基的５００ｍＬ三角瓶
中，每培养皿接种３瓶，于３２℃，１４０ｒ·ｍｉｎ－１振荡
培养４８ｈ。
１．４ 接种与培养
取５ｍＬ发酵种子液，接入盛有４５ｍＬ无菌发酵
培养基的２５０ｍＬ三角瓶中，每个处理３次重复。置
摇床中３２℃，１４０ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养１２０ｈ。培养结
束后，取样测定活菌生物量（ＣＦＵ·ｍＬ－１）。
１．５ 活菌计数方法
混皿法［３］，每个处理３个稀释梯度，每个稀释梯
度５个平行，３２℃培养４８ｈ，进行菌落计数。实验
结果使用ＳＡＳ软件进行数据差异显著性分析。
１．６ 发酵培养基配方单因素试验
１．６．１ 碳源筛选 以原始发酵培养基中碳源的含
碳量为标准，分别用玉米粉、玉米秆粉对原始培养基
中的碳源进行替换，其余组分不变，测定不同碳源对
优选菌株发酵生物量的影响。
１．６．２ 氮源筛选 分别用脲０１６ｇ、磷酸氢二铵
０３６ｇ、豆饼粉 ０７５ｇ、磷酸氢二铵 ０７５ｇ、尿素
０７５ｇ以及０２５ｇ豆饼粉 ＋００５２ｇ脲 ＋０１２ｇ磷
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第３４卷第１８期
２００９年９月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ １８
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００９
酸氢二铵的组合对原始培养基中的氮源进行替换，
其余成分不变，测定不同氮源对优选菌株发酵生物
量的影响。
１．６．３ 无机盐筛选 在原始发酵培养基中加入无
机盐，其余成分不变，测定不同无机盐对优选菌株发
酵生物量的影响［４］。
１．７ 均匀设计
在发酵培养基配方单因素试验的基础上，用均
匀设计确定培养基各组分的配比，采用４因素７水
平７组试验的方式，即 Ｕ７（７
４）的设计方案，每组试
验３个平行［５］。按１４进行发酵培养，用１５方法
测定活菌生物量，使用ＤＰＳ软件进行回归分析［６］。
１．８ 拮抗菌耐药性测定
选取目前生产上常用的５种农药，代森锰锌、
代森铵、乙膦铝、多抗霉素、阿米西达进行放线菌
的农药耐受性试验。将农药按所需稀释倍数配成溶
液，备用。取培养好的菌种用１００ｍＬ无菌水洗下，
制成孢子悬浮液，备用。向２００ｍＬ马铃薯蔗糖培
养基中加入１０ｍＬ上述孢子悬浮液，铺成平板，待
冷却凝固后，放入牛津杯，并加入上述５种农药的
不同稀释倍数的药液，２５℃培养３ｄ，用游标卡尺
测量抑菌圈直径。
２ 结果与分析
２．１ 放线菌的分离与筛选
用平板稀释法共分离到放线菌２８株，将初选中
有较好拮抗效果的５株放线菌进行复筛。结果见表
１，拮抗菌 Ｆ０５对西洋参锈腐菌的抑制效果最好，菌
落半径达到８５２ｍｍ，抑制率达到９０９０％。其次
Ｆ０６菌落半径为 ９８６ｍｍ，Ｆ１９，Ｆ２２菌落半径为
１４４８，１６５６ｍｍ，而生防菌 Ｆ１１的防效最差，菌落
半径达到１９２２ｍｍ。因此本实验选择菌株 Ｆ０５作
为发酵对象。
表１ ５株拮抗菌拮抗活性比较
菌株 菌落半径／ｍｍ 抑制率／％
Ｆ０５ ８５２ ９０９９
Ｆ０６ ９８６ ８７５６
Ｆ１１ １９２２ ６３５９
Ｆ１９ １４４８ ７５７３
Ｆ２２ １６５６ ７０４０
ＣＫ ４４０６ －
２．２ 拮抗放线菌Ｆ０５的发酵
２．２．１ 碳源 以玉米秆粉为碳源的培养基活菌生
物量最多，达到１９９×１０８ＣＦＵ·ｍＬ－１。经００１水
平显著性分析，已达到极显著水平，其次为麦麸
１１９×１０８ＣＦＵ·ｍＬ－１，玉米粉仅为４２×１０７ＣＦＵ
·ｍＬ－１。这可能是因为培养基中加入玉米粉后，培
养液会变得很黏稠，导致溶氧量降低，从而降低了活
菌生物量。因此选择玉米秆粉做碳源。
２．２．２ 氮源 以磷酸氢二铵为氮源的培养基活菌
生物量最多，已达到３０３×１０８ＣＦＵ·ｍＬ－１，经００１
水平显著性分析，已达到极显著水平。
２．２．３ 无机盐 经００１水平显著性分析可知，在
５种无机盐中，碳酸钙抑制菌体生长，与对照相比差
异显著；氯化钠和硫酸亚铁与对照相当，差异不显
著；而硫酸镁和磷酸氢二钾促进了菌体的生长，活菌
生物量分别达到 １８７×１０８，４０７×１０８ ＣＦＵ·
ｍＬ－１，差异极显著。因此，将硫酸镁、磷酸氢二钾作
为该培养基的无机盐成分。
２．３ 均匀设计
本试验选用 Ｕ７（７
４）均匀设计表，考察玉米秆
粉、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、硫酸镁４种因子不同
水平对 Ｆ０５菌体生长量的影响，见表２。用 ＤＰＳ软
件对表２数据进行多元二次逐步回归分析，得出活
菌生物量与各因素关系的方程 Ｙ＝－１８８３９９３＋
１５０８５１０Ｘ１ －２１０２６５Ｘ１２ ＋１２９３９７９Ｘ１Ｘ３ －
２４５８９６３８Ｘ２Ｘ３＋５５７４２１０７０Ｘ３Ｘ４，决定系数
Ｒ２＝０９９９１，Ｆ＝２４５５６３８，Ｐ＜００５，该回归方程
具有统计学意义。优化后的培养基配方为：Ｘ１为玉
米秆粉３７２０６％，Ｘ２为磷酸氢二铵０３００３％，Ｘ３为
硫酸镁００４００％，Ｘ４为磷酸氢二钾００４００％，理论
活菌生物量为１６０７０×１０９ＣＦＵ·ｍＬ－１。用相同
的试验方法，采用最优培养基组分做重复试验，得
到活菌生物量１５７×１０８ＣＦＵ·ｍＬ－１。因此，上述
试验数据是合理的，采用均匀设计的方法是可行
的，能减少试验次数，而且得到最优的试验参数。
表２ 均匀设计方案各组分的配比与活菌生物量
试验号
玉米秆
粉／ｇ
磷酸氢
二铵／ｇ
ＭｇＳＯ４
／ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４
／ｇ
菌量
／×１０７ＣＦＵ·ｍＬ－１
１ １５ ０４ ００２０ ００３５ １４
２ ２０ ０６ ００３５ ００３０ ４４
３ ２５ ０８ ００１５ ００２５ ５５
４ ３０ ０３ ００３０ ００２０ ９８
５ ３５ ０５ ００１０ ００１５ ８２
６ ４０ ０７ ００２５ ００１０ ６２
７ ４５ ０９ ００４０ ００４０ ８９
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第３４卷第１８期
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２．４ 拮抗菌耐药性试验
５种农药中代森铵、代森锰锌对放线菌的生长
均有较强抑制作用，乙膦铝抑制作用较弱，而多抗霉
素、阿米西达未产生抑菌圈，即这２种农药对放线菌
无抑制作用。因此，在生产中可将这２种农药与放
线菌复配使用，见表３。
表３ 不同种类及浓度的农药对拮抗菌Ｆ０５菌落
生长的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝９）
名称 稀释倍数 放线菌抑菌圈直径／ｍｍ
乙膦铝 １２００ １２７３±０６２
９００ １０２５±０１６
６００ １１８６±０４９
多抗霉素 ２００ －
１５０ －
１００ －
代森铵 １０００ ３８２５±０３５
７５０ ３７９７±０６２
５００ ３３９０±０６３
代森锰锌 １５００ ３２１６±１８４
１０００ ３４９１±０７７
７５０ ３１７２±１０３
阿米西达 ２０００ －
１５００ －
１０００ －
３ 讨论
本试验在培养基组分筛选时没有考虑精细原
料，而是以粗放原料为筛选对象，并得到以玉米秸秆
为碳源，磷酸氢二铵为氮源的发酵培养基，为实现工
业化发酵奠定基础。
据报道，我国每年可生产秸秆７亿吨。近年来，
秸秆已经由传统的燃料、饲料、肥料变为一种无用的
负担物，进而又造成秸秆就地焚烧日趋严重，烟雾弥
漫，既污染环境又严重影响了交通安全。因此，合理
利用秸秆十分必要［７］。本实验以玉米秸秆作为碳
源，发酵放线菌，在实现对西洋参进行生物防治的同
时，也为秸秆的高价值转化提供了新的思路。
关于氮源的筛选，本实验从豆饼粉、脲、磷酸氢
二铵及其组合中筛选出最佳氮源为磷酸氢二铵，即
为农业生产中广泛施用的化肥，具有来源广泛，成分
单一、稳定的优点。
选取目前生产上常用的５种农药：代森锰锌、代
森铵、乙磷铝、多抗霉素、阿米西达在建议农药使用
范围内进行了放线菌的农药耐受性试验。从中筛选
出阿米西达和多抗霉素可与拮抗放线菌复配使用，
以期在生产实践中获得更好的防治效果。
［参考文献］
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酵条件的优化［Ｊ］．微生物学杂志，２００４，２４（４）：１２．
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Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ
Ｆ０５ｏｆＡｍｅｒｉｃａｎｇｉｎｓｅｎｇｒｕｓｔｒｏｔｐａｔｈｏｇｅｎ
ＺＨＡＮＧＡｉｈｕａ，ＺＨＯＵＧｕｏｘｉｎｇ，ＬＥＩＦｅｎｇｊｉｅ，ＺＨＡＮＧＬｉａｎｘｕｅ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎａｌＭａｔｅｒｉａｌ，ＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１８，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ＯｎｅｓｔｒａｉｎＦ０５ｗｈｉｃｈｈａｄｂｅｔｅｒａｎｔａｇｏｎｉｓｍｆｏｒＡｍｅｒｉｃａｎｇｉｎｓｅｎｇｒｕｓｔｒｏｔｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇ
ｇｒｏｕｎｄ，ａｎｄｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｈａｄｂｅｅｎｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｓｔｕｄｉｅｄ，ｍｏｒｅｏｖｅｒｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｃａｎｆｕｒｔｈｅｒｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．
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３．７２０６％，（ＮＨ４）２ＨＰＯ４０．５３１２％，ＭｇＳＯ４０．０３５５％，Ｋ２ＨＰＯ４０．０４００％．Ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｎｕｍｂｅｒｗａｓ１．５７×１０
９ｐｅｒｍｉｌｉｌｉｔｅｒ
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［责任编辑 吕冬梅］
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