全 文 ：氧化苦参碱抑制 ＨｅｐＧ２细胞增殖的研究
秦学功，尹继云，张华
（黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆 １６３３１９）
［摘要］　目的：探讨氧化苦参碱对人肝癌细胞株（ＨｅｐＧ２）增殖抑制的影响及其作用机制。方法：以０１，０２，０３，０４，
０５，０８，１，２，５，８，１０，１５ｇ·Ｌ－１的氧化苦参碱处理 ＨｅｐＧ２细胞，四噻唑蓝法（ＭＴＴ）检测其对细胞增殖的影响；苏木精伊红
（ＨＥ）染色比较细胞形态差异；免疫组化染色进一步检测ＨｅｐＧ２细胞肿瘤相关蛋白表达量的变化。结果：不同浓度氧化苦参碱
处理ＨｅｐＧ２细胞，低于１ｇ·Ｌ
－１对细胞抑制不明显；１～８ｇ·Ｌ－１对细胞生长有明显的抑制作用，呈现时间和剂量依赖性；大于
８ｇ·Ｌ－１时，对细胞虽有明显的抑制作用，但未表现出明显的时间和剂量依赖性。进一步免疫组化分析结果显示，ＨｅｐＧ２细胞
肿瘤相关蛋白Ｐ５３和Ｂｃｌ２表达量明显减少，而Ｂａｘ表达量明显增加。结论：氧化苦参碱对ＨｅｐＧ２细胞增殖具有明显的抑制作
用；其作用机制可能是通过上调或者下调肿瘤相关蛋白的表达来实现的。
［关键词］　氧化苦参碱；ＨｅｐＧ２细胞；增殖抑制；肿瘤相关蛋白
［收稿日期］　２００８０９２０
［基金项目］　黑龙江省教育厅科学技术研究项目（１１５１１２４７）
［通信作者］　秦学功，Ｔｅｌ：（０４５９）６８１９２９９，Ｅｍａｉｌ：ｘｇｑｉｎ２００５＠ｙａ
ｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
　　每年全世界肝癌新发病例中约４２５％分布于
我国，严重威胁人民生命健康［１］。传统化疗和放疗
存在抗药性和毒副作用大等诸多问题，亟待开发新
的天然抗肝癌药物。现有研究证实，氧化苦参碱
（ｏｘｙｍａｔｒｉｎｅ，ＯＭＴ）可抑制胶质瘤细胞（ＢＴ３２５）［２］
人卵巢癌细胞（ＳＫＯＶ３）［３］乳腺癌细胞（ＭＣＦ７）［４］
的增殖并诱导其分化和凋亡。ＨｅｐＧ２细胞是新药体
外研究中应用最多且具有典型肝癌特征的细胞之
一，目前关于氧化苦参碱对其药理作用的研究鲜有
报道。本实验选用 ＨｅｐＧ２细胞研究氧化苦参碱的抗
肝癌作用，并初步探讨其可能的抗癌机制。
１　材料
１．１　细胞株　ＨｅｐＧ２细胞株（人肝母细胞瘤细胞
株），购自南京凯基生物科技发展有限公司。
１．２　药物　氧化苦参碱对照品购自西安鸿生生物
技术有限公司，ＨＰＬＣ检测纯度＞９８％（批号１１０７８０
２００４０５）。
１．３　试剂　ＲＰＭＩ１６４０培养基（批号３０３５６６，美国
Ｇｉｂｃｏ公司），胰酶（批号２５２０５６美国 Ｇｉｂｃｏ公司），
胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所），ＭＴＴ
（批号０７０６１２，美国Ｓｉｇｍａ公司），二甲亚砜（ＤＭＳＯ，
批号 Ｄ８４１８，美国 Ｓｉｇｍａ公司），抗 Ｐ５３（批号
ＢＭ０１０１），Ｂｃｌ２（批号ＢＭ０２００），Ｂａｘ（批号ＢＡ０３１５）
抗体，ＳＡＢＣ浓缩型免疫组化试剂盒（批号 ＳＡ２０１０）
均购自武汉博士德生物工程有限公司，ＤＡＢ显色试
剂盒（批号２００８０３１２，北京中山公司）。
１．４　仪器　２Ｋ１５型高速台式离心机（美国 Ｓｉｇｍａ
公司）；３１８ＭＣ型酶标仪（上海精科分析仪器有限公
司）；３７ＸＢ型倒置显微镜（上海光学仪器六厂）；ＤＭ
２５００型多功能显微镜（德国Ｌｅｉｃａ公司）。
２　方法
２．１　细胞悬液制备　ＨｅｐＧ２细胞株复苏后，ＲＰＭＩ
１６４０培养基（含１０％胎牛血清、１００Ｕ·ｍＬ－１双抗）
调细胞密度４×１０４个／ｍＬ，接种于２５ｃｍ２细胞培养瓶
中，每瓶４ｍＬ，于３７℃，５％ＣＯ２细胞培养箱内培养，
细胞生长汇合度达到８０％以上，０２５％胰蛋白酶３７
℃消化３ｍｉｎ，细胞皱缩变圆时弃去胰蛋白酶液，完全
培养液制备４×１０４个／ｍＬ的细胞悬液，备用。
２．２　ＭＴＴ检测抑制率　取上述制备好的 ＨｅｐＧ２细
胞悬液接种于９６孔培养板，１００μＬ／孔，加入氧化苦
参碱至终浓度分别为 ０１，０２，０３，０４，０５，０８，
１，２，５，８，１０，１５ｇ·Ｌ－１，ＲＰＭＩ１６４０培养液补足至
２００μＬ，每浓度设６个平行复孔，另设对照孔（不加
氧化苦参碱）。细胞悬液混匀后置于３７℃，５％ＣＯ２
细胞培养箱培养，分别于２４，４８，７２，９６ｈ吸弃培养
液，每孔加新鲜培养液１００μＬ和 ＭＴＴ１０μＬ，暗室
中于微量震荡器上震摇２ｍｉｎ，继续培养４ｈ，吸弃孔
内上清液，每孔加入ＤＭＳＯ１００μＬ，振摇５ｍｉｎ，酶标
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仪５７０ｎｍ测定吸光度（Ａ），计算生长抑制率：
生长抑制率（％）＝［（Ａ对照组 －Ａ实验组）／Ａ对照组］×１００％
２．３　ＨｅｐＧ２细胞形态观察　载玻片置于２４孔细胞培
养板内培养ＨｅｐＧ２细胞，每孔加细胞悬液１ｍＬ，氧化苦
参碱终浓度同为２．２，另设对照组（不加氧化苦参碱）。
７２ｈ后取出载玻片，ＰＢＳ漂洗３次，９５％乙醇固定细胞
１５ｍｉｎ，ＨＥ染色，７０％，８０％，９０％无水乙醇依次脱水，
最后二甲苯透明，树胶封片，镜下观察、拍照。
２．４　免疫组化分析　细胞培养同上，氧化苦参碱处
理浓度同２．３，７２ｈ后取出载玻片，ＰＢＳ漂洗３次，
冷丙酮固定１０ｍｉｎ，３％ Ｈ２Ｏ２室温灭活内源性酶１０
ｍｉｎ，滴加１０％正常羊血清封闭２０ｍｉｎ，分别用Ｐ５３，
Ｂｃｌ２（鼠抗人）和 Ｂａｘ（兔抗人）抗体处理盖玻片４
℃过夜后，加入相应的二抗和 ＳＡＢＣ液室温各 ２０
ｍｉｎ，ＤＡＢ显色（按试剂盒说明书操作），苏木素复染
（Ｐ５３除外，因其是细胞核着色），脱水透明封片，显
微镜下观察、拍照。
２．５　统计处理 细胞生长抑制率数据均采用 珋ｘ±ｓ
表示，采用ＳＰＳＳ１２０进行方差分析，Ｐ＜００５为有
统计学差异。
３　结果
３．１　氧化苦参碱对ＨｅｐＧ２细胞增殖的抑制作用　氧
化苦参碱浓度低于１ｇ·Ｌ－１对ＨｅｐＧ２细胞抑制率变
化不明显；氧化苦参碱浓度大于１ｇ·Ｌ－１时，抑制率
　　
与时间和剂量呈正相关。浓度为８，１５ｇ·Ｌ－１与０８
ｇ·Ｌ－１的氧化苦参碱溶液处理ＨｅｐＧ２细胞９６ｈ，前两
者与后者相比抑制率均差异显著（Ｐ＜００１）（图１）。
图１　不同浓度氧化苦参碱对 ＨｅｐＧ２细胞抑制率的影响
３．２　细胞形态变化　细胞ＨＥ染色后，倒置显微镜
下观察结果显示：随氧化苦参碱浓度增大、作用时间
的延长细胞质染色程度由深变浅。对照组细胞似上
皮样细胞，细胞间相互连接密集生长；氧化苦参碱浓
度小于１ｇ·Ｌ－１作用细胞形态无明显变化；１～８ｇ
·Ｌ－１时细胞生长逐渐趋于分散，恶性形态表型逐渐
减弱。８ｇ·Ｌ－１时细胞缩小，核浆比减小且细胞核
出现极性化，胞浆浓缩，胞浆内出现大小不等的空泡
（图２）。１５ｇ·Ｌ－１时几乎无贴壁细胞，细胞肿胀，
部分细胞出现膜破裂现象。
Ａ．对照组；ＢＦ．氧化苦参碱０５，１，２，５，８ｇ·Ｌ－１剂量组。
图２　ＨｅｐＧ２细胞爬片染色（ＨＥ，×４００）
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３．３　免疫组化法检测凋亡相关蛋白　与对照组相
比，氧化苦参碱处理组细胞 Ｂａｘ蛋白表达增强，Ｂｃｌ
２蛋白表达减弱，其阳性表现均为胞浆染色呈棕黄
色；Ｐ５３蛋白表达减弱，其阳性表现为胞核被染呈棕
黄色（图３）。
４　讨论
Ａ，Ｃ，Ｅ为Ｐ５３，Ｂｃｌ２，Ｂａｘ对照组；Ｂ，Ｄ，Ｆ．为对应的氧化苦参碱处理组。
图３　ＨｅｐＧ２细胞的免疫组化染色（ＳＡＢＣ，×４００）
　　氧化苦参碱是从苦参或苦豆子中分离提取的一
种药用活性成分，具有抗肿瘤［５］、增强肌体免疫力、
抗炎、抗心率失常［６］等药理作用。近年来，氧化苦
参碱在抗癌方面的研究倍受重视。而不同种类细胞
在不同培养条件下，氧化苦参碱的抑制作用及作用
机制均有不同报道。本研究发现不同浓度的氧化苦
参碱处理ＨｅｐＧ２细胞对其抑制作用与作用机制均不
相同：低于１ｇ·Ｌ－１时对细胞的抑制作用不明显；
１～８ｇ·Ｌ－１对细胞有明显的抑制作用，且呈时间
剂量依赖性，其作用可能是诱导了细胞的分化或者
凋亡；浓度大于８ｇ·Ｌ－１时，对细胞抑制明显，但时
间和剂量依赖性不明显，更多的是倾向于坏死。
Ｌｅｎｎｏｎ［７］报道氧化苦参碱在一定浓度范围内可
刺激肿瘤细胞引起凋亡，而较高浓度则引起坏死。
本研究对８ｇ·Ｌ－１作用下的细胞进行 ＨＥ染色，可
见胞体缩小、胞质凝缩、胞膜完整、出现空泡化等凋
亡形态学变化，这表明在此浓度氧化苦参碱对
ＨｅｐＧ２细胞的抑制作用机制很可能是通过诱导细胞
凋亡来实现的；当氧化苦参碱浓度达到１５ｇ·Ｌ－１
时，对 ＨｅｐＧ２细胞也具有显著的抑制作用（Ｐ＜
００１），但其死细胞数却随时间和剂量的增加明显
增多，细胞肿胀，部分细胞出现膜破裂现象，表明细
胞此时出现了坏死。此外，侯华新［３］等也以卵巢癌
ＳＫＯＶ３细胞为对象，得出相近的结论。氧化苦参
碱１～８ｇ·Ｌ－１处理的 ＨｅｐＧ２细胞 ＨＥ染色结果整
体观察，发现其颜色规律是随药物浓度增大、时间的
延长细胞质染色程度由深变浅。根据肿瘤细胞分化
程度的染色特征：肿瘤细胞分化越好、越成熟，细胞
质嗜碱性染色越减弱［８］，由此判断氧化苦参碱诱导
了ＨｅｐＧ２细胞的分化。
细胞凋亡是一个涉及多基因参与的过程，研究
证实 Ｐ５３，Ｂｃｌ２，Ｂａｘ等基因都参与了凋亡的发生。
Ｐ５３是目前研究最为广泛、系统的抑癌基因之一，
Ｐ５３活性的调节主要是通过调控蛋白的稳定性，正
常生长的细胞中，Ｐ５３蛋白的水平很低，但当出现如
ＤＮＡ损伤、缺氧或是癌基因作用等危险信号时，Ｐ５３
稳定性增强，蛋白水平迅速升高［９］，因此对 Ｐ５３蛋
白的表达水平进行测定，可间接的初步判断是否氧
化苦参碱诱导了细胞的凋亡。本研究对Ｐ５３蛋白进
行了免疫组化实验，结果显示８ｇ·Ｌ－１氧化苦参碱
处理的细胞与对照组相比 Ｐ５３基因蛋白表达减弱，
这进一步说明了氧化苦参碱对体外培养的 ＨｅｐＧ２细
胞的抑制作用可能是通过诱导其发生凋亡发生的。
Ｂａｘ是一种促凋亡蛋白，而 Ｂｃｌ２则是抗肿瘤细胞凋
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亡的蛋白。Ｐｏｗｅｒ［１０］等认为 Ｂｃｌ２／Ｂａｘ是决定凋亡
的一个重要因素，当 Ｂａｘ水平高于 Ｂｃｌ２水平时，则
形成同源二聚体，诱导细胞凋亡，反之，Ｂｃｌ２水平高
于Ｂａｘ水平时，Ｂｃｌ２和 Ｂａｘ形成异源二聚体，抑制
细胞凋亡。本实验研究结果显示 Ｂｃｌ２基因蛋白表
达减弱、Ｂａｘ基因蛋白表达增强，此结果与 Ｐ５３蛋白
的检测结果相符，都表明氧化苦参碱对细胞的抑制
作用是启动了细胞的凋亡。
综上所述，氧化苦参碱可显著抑制人肝癌细胞
ＨｅｐＧ２细胞的增殖，且与时间和剂量呈正相关，氧化
苦参碱浓度在一定范围内可通过诱导ＨｅｐＧ２细胞的
分化和凋亡来抑制其增殖，浓度超出一定范围时则
会导致ＨｅｐＧ２细胞的坏死。
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ＱＩＮＸｕｅｇｏｎｇ，ＹＩＮＪｉｙｕｎ，ＺＨＡＮＧＨｕａ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｅｉＬｏｎｇＪｉａｎｇＡｕｇｕｓｔＦｉｒｓｔＬａｎｄＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ１６３３１９，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｎｏｘｙｍａｔｒｉｎｅｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｓ．
Ｍｅｔｈｏｄ：ＨｅｐＧ２ｃｅｌｓｗｅｒｅｅｘｐｏｓｕｒｅｄｔｏｏｘｙｍａｔｒｉｎｅ，ｆｉｎａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｗｈｉｃｈｗｅｒｅ０１，０２，０３，０４，０５，０８，１，２，５，８，
１０，１５ｇ·Ｌ－１ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ＭＴＴｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｅｆｅｃｔｓｏｆｏｘｙｍａｔｒｉｎｅｏｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｆｏｌ
ｌｏｗｅｄｂｙＨａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄＥｏｓｉｎｓｔａｉｎｉｎｇｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｃｅｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰ５３，Ｂｃｌ２ａｎｄＢａｘｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａ
ｔｅｄｂｙＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｏｘｙｍａｔｒｉｎｅｂｅｌｏｗｄｏｓａｇｅｏｆ１ｇ·Ｌ－１ｓｈｏｗｅｄｔｈｅｌｉｔｌｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｅｃｔｏｎｔｈｅＨｅｐＧ２
ｃｅｌｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｅｘｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｅｃｔｆｒｏｍ１ｔｏ８ｇ·Ｌ－１ｉｎｂｏｔｈａｔｉｍｅａｎｄｄｏｓｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．Ｗｈｅｒｅａｓ
ｔｈｅｄｏｓａｇｅｗａｓａｂｏｖｅ８ｇ·Ｌ－１，ｏｘｙｍａｔｒｉｎｅｄｉｄｎ′ｔｓｈｏｗｅｄｔｈｅｔｉｍｅａｎｄｄｏｓｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢａｘｏｂｖｉｏｕｓｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈａｔｏｆＢｃｌ２ａｎｄＰ５３ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｏｘｙｍａｔｒｉｎｅ
ｃｏｕｌｄｎｏｔａｂｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅＨｅｐＧ２ｃｅｌｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｂａｂｌｙｖｉａｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＢａｘａｎｄｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆＢｃｌ２ａｎｄＰ５３．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ｏｘｙｍａｔｒｉｎｅ；ＨｅｐＧ２ｃｅｌ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ；ｔｕｍｏｒｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ
［责任编辑　古云侠］
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