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A quantitative method for simultaneous assay of four flavones with one marker in Radix Scutellariae

一测多评法同时测定黄芩药材中4种黄酮类成分的含量



全 文 :一测多评法同时测定黄芩药材中4种
黄酮类成分的含量
朱晶晶,王智民,张启伟,牛继伟,李凤
(中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:建立黄芩药材一个对照品同步测定 4个成分的分析方法,并建立其方法学的考察模式。方法:采用
HPLCDAD以药材中典型成分黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素为指标,在一定的线性范围内,建立黄芩苷与后3种成分间
的相对校正因子(分别为07467,05638,04351),并测定黄芩苷的含量,用所建立的校正因子计算其他3个成分的含量;同
时采用外标法测定27批药材中以上4种成分的含量;以验证一测多评法的准确性和科学性。结果:建立的校正因子重现性
良好,黄芩药材中采用校正因子计算的含量值与外标法实测值之间没有明显差异。结论:在对照品缺乏的情况下,该方法可
以作为一个新模式用于药材的多成分定量。
[关键词] 一测多评法;校正因子;黄芩;质量控制
[收稿日期] 20090523
[基金项目] 2007年中医药行业科技专项(200707009);第四十三
批博士后科学基金项目(20080430540)
[通信作者] 王智民,男,研究员,博士生导师,Tel/Fax:(010)
84014128,Email:zhmw123@263net
  黄芩为黄芩属植物黄芩 Scutelariabaicalensis
Georgi的干燥根[1],又名空心草,条芩,子芩等,是临
床常用大宗中药材之一;目前黄芩市场上野生品、不
同年限的栽培品及习用品混杂,质量参差不齐,严重
影响其相关产品的临床疗效,而2005年版《中国药
典》黄芩的定量指标仅有黄芩苷一项,难以真正体现
和保障黄芩的内在品质及其相关制剂的质量[2]。为
了更好地保证黄芩的有效性、安全性和专属性,以黄
芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等多个有效成分
为指标评价黄芩质量将更全面和合理[3]。目前已有
以多个黄酮类成分的同步测定来用于控制黄芩质量
的相关报道[35],但这种多指标质量控制方法在实际
的生产和市场监督将很难得到应用;其重要原因就是
成本高,必须有足够量、高纯度的化学对照品作为坚
实的后盾,而黄芩中这些对照品常供不应求,限制了
该质控方法的应用。因此,多成分的质量控制模式适
宜于中药的质量评价,但是化学对照品的紧缺局面,
又限制了该质控模式的实际应用。
为解决这一矛盾,作者提出了一测多评[6]的解
决方案,本文重点探讨一测多评法在黄芩药材质量
评价中应用的技术适用性和可行性;即:分别计算黄
芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素与黄芩苷间的相对校正
因子(therelativecorectionfactors,RCF),建立黄芩
“一测多评”新质控方法,该法在实施时,仅需用 1
个黄芩苷对照品(供应量大),通过其 RCF的计算,
可同步实现多成分(黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉
黄芩素)的含量测定。
1 仪器与试药
Waters26952996高效液相色谱系统,Empower
工作站(Waters公司);Agilent1100高效液相色谱系
统,色谱柱 AgilentSBC18(46mm×250mm,5
μm),AgilentextendC18(46mm×250mm,5μm),
DikmaKromasilC18(46mm×250mm,5μm),YMC
J’SphereODSH80(46mm×150mm,4μm)等。
黄芩为2005-2007年间从河北、山东、甘肃、内
蒙古、陕西、山西、兰州、新疆、四川、湖北、河南等地
采收与购买的27批野生及栽培品。样品经本所王
智民研究员鉴定为黄芩属植物黄芩Sbaicalensis的
干燥根。
对照品黄芩苷(baicalin,批号07159909)购自中
国药品生物制品检定所,汉黄芩苷(wogonoside)、黄
芩素(baicalein)、汉黄芩素(wogonin)均为自制,以
上4个对照品 HPLC(面积归一化法)纯度 >98%,
其结构式如图 1所示。实验所用试剂甲醇为色谱
纯(TediaCompany),水为娃哈哈高纯水,其余试剂
均为分析纯。
2 结果与分析
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21 原理
在线性范围内成分的量(质量或浓度)与检测
器响应成正比,即W=fA。在多指标质量评价时,以
药材中某一典型组分(有对照品供应者)为内标,建
立该组分与其他组分之间的相对校正因子,然后通
过校正因子计算其他组分的含量。
fks=
fk
fs

fk×As
Ws×Ak
  As为对照物峰面积,Ws为对照物浓度,Ak为某待
测成分k峰面积;Wk为某待测成分k浓度。
22 一测多评方法学考察
221 色谱条件 AgilentSBC18色谱柱(46mm×
250mm,5μm);流动相甲醇(A)02%磷酸水(B),
梯度洗脱0~10min,45% A;10~55min,45%~70%
A;流速10mL·min-1;柱温25℃,检测波长274
nm。对照品及样品色谱图见图1。
图1 黄芩对照品(A)和样品(B)HPLC图
222 对照品溶液的制备 取黄芩苷、汉黄芩苷、
黄芩素、汉黄芩素对照品适量,精密称定,用甲醇溶
解,分别配置成0241,0047,0032,0027g·L-1
的混合溶液,同时配制一份黄芩苷对照品0361g·
L-1,并保存于4℃冰箱中,备用。
223 供试品溶液的制备 取黄芩药材粉末
(过40目筛)02g,精密称定,置于100mL锥形
瓶,精密量取50mL70%丙酮加入,称重,60℃水
浴超声60min,补重,过滤,精密量取续滤液5mL
于圆底烧瓶,回收溶剂,残渣用甲醇溶解到10mL
量瓶,定容至刻度。经022μm滤膜过滤,10μL
进样。
224 线性范围 精密吸取上述混合对照品溶液
05,1,2,5,10,12,15,18和20μL,进样分析,每个
浓度进样3次,取平均值。以进样量对峰面积积分
值进行回归处理,得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄
芩素的标准曲线见表1所示,各标准曲线在线性范
围内线性良好。
表1 黄芩药材中4种黄酮类成分的标准曲线
化合物 回归方程 r LOD/mg·L-1 LOQ/mg·L-1 线性范围/μg
黄芩苷  Y=913.0X+106.4 0.9996 0.0081 0.0242 0.1210~4.82
汉黄芩苷 Y=239.9X+36.73 0.9998 0.0047 0.0237 0.0237~0.95
黄芩素  Y=213.3X+11.71 0.9996 0.0032 0.0158 0.0158~0.63
汉黄芩素 Y=230.4X+13.20 0.9990 0.0027 0.0133 0.0133~0.53
225 校正因子计算 以黄芩苷为内标,按21项
下公式,分别计算汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对黄
芩苷的校正因子,结果见表2。
226 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10
μL连续进样6次,记录峰面积,黄芩苷、汉黄芩苷、黄
芩素、汉黄芩素的日内精密度在分别为 098%,
26%,10%,41%;精密吸取同一供试品溶液10μL
连续进样2d,每天3次,记录峰面积,以上4个黄酮类
成分的日间精密度分别为26%,37%,27%,40%。
227 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液
  表2 黄芩中4个黄酮类成分相对校正因子(n=3)
进样体积/μL f汉黄芩苷/黄芩苷1) f黄芩素/黄芩苷 f汉黄芩素/黄芩苷
2 0.728 0.553 0.445
5 0.739 0.581 0.457
10 0.752 0.578 0.463
12 0.753 0.571 0.452
15 0.752 0.579 0.464
18 0.747 0.552 0.445
20 0.759 0.565 0.463
Mean 0.747 0.568 0.456
RSD% 1.4 2.2 1.9
  注:1)f汉黄芩苷/黄芩苷 =f汉黄芩苷/f黄芩苷。
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10μL分别于配制后的0,2,4,8,12,24,48h进样分
析测定峰面积积分值,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉
黄芩素稳定性的 RSD分别为28%,22%,17%,
20%。表明处理后的样品在2d内稳定。
228 重复性试验 称取黄芩药材粉末(产地,40
目)约02g共6份,精密称定,按供试品溶液处理方
法制备样品,测定,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩
素的平均含量分别为16908,2855,1329,274mg
·g-1,RSD分别为38%,31%,18%,30%。
229 加样回收率 称取黄芩药材粉末(产地兰
州1)约02g6份,精密称定,分别按各成分在原药
材中的含量,精密加入含1565mg黄芩苷和333
mg汉黄芩苷、187mg黄芩素、049mg汉黄芩素的
对照品溶液 1mL,按供试品溶液处理方法制备样
品,测定,计算加样回收率,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩
素、汉黄芩素的平均回收率见表3。
表3 黄芩中4个黄酮类成分的加样回收率(n=6)
对照品
药材中量
/mg
加入量
/mg
平均回收率
/%
RSD
/%
黄芩苷  16.85 15.65 96.7 1.7
汉黄芩苷 3.42 3.33 103.2 2.8
黄芩素  1.71 1.87 95.4 1.8
汉黄芩素 0.37 0.49 102.4 2.6
23 校正因子重现性考察
231 不同仪器及不同色谱柱考察 精密吸取
22项下混合对照品溶液,2,5,10,12,15,18和20
μL,进样分析,每个浓度进样 3次,取平均值。按
252项下方法计算汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对
黄芩苷的校正因子。试验分别考察了 Waters2695
2996,Agilent11002种高效液相色谱系统和 Agilent
SBC18(46mm×250mm,5μm),AgilentextendC18
(46mm×250mm,5μm),DikmaKromasilC183种
色谱柱,所得的相对校正因子及其相对标准差见表
4,结果显示,不同的仪器及不同的色谱柱所得的相
对校正因子差异并不显著。
232 不同实验室考察建立的一测多评试验方法
在经两个实验室进行试验AgilentSBC18(46mm×
250mm,5μm),不同实验室测得相对校正因子如
表5所示。结果显示,说明不同实验室所得的相对
校正因子差异较小,RSD值范围在12%~32%。
24 待测组分色谱峰的定位
在只使用一个对照品时,如何正确指认药材中
其他3个待测成分是一个必须解决的问题。分别引
入各待测成分间的保留时间差和相对保留值两种参
数作为定位标准,并考察了以上2个参数在不同品
  
表4 不同仪器和色谱柱测得相对校正因子(n=3)
仪器 色谱柱
相对校正因子
f汉黄芩苷/黄芩苷 f黄芩素/黄芩苷 f汉黄芩素/黄芩苷
Waters AgilentSBC18 0747 0568 0456
26952996 AgilentextendC18 0745 0563 0436
AgilentSBC18 0755 0578 0428
Agilent1100 AgilentextendC18 0742 0554 0424
DikmaKromasilC18 0744 0578 0433
Mean 0747 0568 0435
RSD/% 066 18 28
牌仪器和不同规格色谱柱中的重复性,结果表明,不
同仪器和色谱柱下,保留时间差波动较小 RSD在
098%~24%(表6),各成分的相对保留值波动较
大,RSD在736%~133%(表7)因此认为选用保
留时间差这一参数作为黄芩中上述目标色谱峰的定
位指标比较合理。另外由于在本色谱条件下,各批
黄芩样品的色谱峰相对简单,因此在没有待测成分
对照品的情况下,通过保留时间差结合各色谱峰的
紫外吸收特征,可以准确指认黄芩药材中的目标色
谱峰。
25 一测多评法与外标法结果比较研究
为了验证一测多评法的准确性,作者收集了27
批药材,采用常规的有对照品作为外标的方法进行
验证。将制备好的供试品溶液逐批进样分析,分别
采用一测多评法和传统外标法测定黄芩药材中黄芩
素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素的含量,两种方法所
得的各批次药材的含量情况见表8。结果显示,两
种方法所得药材含量不存在显著性差异。由此说
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   表5 不同实验室测得相对校正因子(n=3)
进样体积
/μL
相对校正因子
f汉黄芩苷/黄芩苷 f黄芩素/黄芩苷 f汉黄芩素/黄芩苷
Lab1 Lab2 Lab1 Lab2 Lab1 Lab2
2 0.752 0.747 0.565 0.562 0.441 0.427
5 0.743 0.750 0.569 0.558 0.433 0.429
10 0.741 0.746 0.573 0.549 0.440 0.423
12 0.747 0.745 0.567 0.547 0.438 0.419
15 0.743 0.738 0.557 0.552 0.431 0.423
18 0.750 0.731 0.561 0.551 0.435 0.421
20 0.741 0.739 0.552 0.557 0.431 0.424
Mean 0.745 0.742 0.563 0.554 0.436 0.424
RSD/% 0.59 0.91 1.3 1.0 0.97 0.81
表6 不同色谱柱下目标成分间保留时间差
仪器 色谱柱
保留时间差
ΔtR汉黄芩苷/黄芩苷1) ΔRt黄芩素/黄芩苷 ΔtR汉黄芩素/黄芩苷
Waters AgilentSBC182) 9381 717 2723
26952996 AgilentextendC182) 951 1761 2700
AgilentSBC182) 944 1716 2753
Agilent1100 AgilentextendC182) 955 1772 2730
DikmaKromasilC182) 9752)18322)2747
YMCJ’SphereODSH803) 921 1756 2778
Mean 937 1758 2754
RSD/% 19 24 098
  注:1)ΔRt汉黄芩苷/黄芩苷 =Rt汉黄芩苷Rt黄芩苷;2)色谱柱型号(46mm×250mm,5μm);3)色谱柱型号(46mm×150mm,4μm)。
表7 不同规格色谱柱下目标成分的相对保留值
仪器 色谱柱
相对保留值
RRt汉黄芩苷/黄芩苷1) RRt黄芩素/黄芩苷 RRt汉黄芩素/黄芩苷
Waters26952996 AgilentSBC182) 152 196 252
AgilentextendC182) 174 237 310
AgilentSBC182) 160 210 276
Agilent1100 AgilentextendC182) 178 245 324
DikmaKromasilC182) 156 206 258
YMCJ’SphereODSH803) 164 219 284
Mean 167 225 294
RSD/% 74 109 133
  注:1)RRt汉黄芩苷/黄芩苷 =Rt汉黄芩苷/Rt黄芩苷;2)色谱柱型号为:(46mm×250mm,5μm);3)色谱柱型号为 (46mm×150mm,4μm)。
明一测多评法可用于黄芩药材的多成分质量评价
研究。
3 讨论
在查阅文献、借鉴前人研究结果的基础上[35],
本试验分别考察了甲醇、丙酮、乙醇等 3种提取溶
剂,超声、回流等不同提取方法,发现采用 50mL
70%丙酮60℃水浴超声60min提取,能够兼顾上
述黄芩苷及黄芩苷元类成分,得到满意的提取率,杂
质干扰峰少,且方法简单,故选用70%丙酮60℃水
浴超声60min作为本实验的提取条件。
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表8 不同方法所得黄芩药材中黄酮类成分的含量比较(n=3) mg·g-1
样品来源
黄芩苷 汉黄芩苷 黄芩素 汉黄芩素
b a b a b a b
黄芩(甘肃陇西栽培) 94.73 21.72 21.68 17.16 17.07 5.24 5.26
黄芩(甘肃天水1) 72.51 14.50 14.42 19.73 19.73 5.71 5.76
黄芩(新疆乌鲁木齐) 43.03 8.68 8.60 26.62 27.00 6.33 6.48
黄芩(陕西宝鸡) 176.26 35.10 35.02 26.94 26.67 5.08 5.05
黄芩(甘肃野生) 88.14 17.90 17.82 25.43 25.37 7.07 7.13
黄芩(内蒙赤峰栽培) 103.37 19.06 18.97 5.51 5.42 1.68 1.64
黄芩(甘肃兰州1) 77.03 15.69 15.62 7.89 7.82 1.74 1.70
黄芩(湖北武汉) 101.18 21.80 21.74 18.83 18.72 3.89 3.87
黄芩(湖北恩施2) 85.31 15.94 15.84 15.18 15.11 4.32 4.33
黄芩(内蒙呼和浩特2) 90.48 17.79 17.70 18.42 18.35 4.18 4.18
黄芩(内蒙赤峰3) 62.24 12.64 12.56 27.30 27.41 7.05 7.16
黄芩(内蒙赤峰4) 126.45 25.36 25.28 14.39 14.24 3.40 3.37
黄芩(山西太原) 152.37 26.86 26.74 3.71 3.60 1.29 1.23
黄芩(四川南充) 149.81 22.01 21.86 15.93 15.75 5.45 5.44
黄芩(四川绵阳) 142.83 29.57 29.50 9.53 9.39 1.82 1.77
黄芩(山西长治) 134.58 22.60 22.47 6.05 5.94 1.49 1.44
黄芩(四川成都) 160.72 22.25 22.08 15.73 15.54 4.18 4.15
黄芩(陕西宝鸡栽培) 188.45 30.76 30.63 4.79 4.67 0.84 0.78
黄芩(陕西宝鸡野生) 148.55 25.33 25.21 7.79 7.66 1.61 1.55
黄芩(河北承德) 130.43 26.57 26.50 4.57 4.47 2.23 2.18
黄芩(山东烟台) 121.20 25.32 25.25 14.75 14.61 3.24 3.21
黄芩(内蒙赤峰5) 126.40 24.07 23.97 7.29 7.18 1.99 1.94
黄芩(河南南阳) 169.08 28.13 28.55 13.60 13.29 2.76 2.74
黄芩(甘肃兰州) 153.89 34.52 34.47 27.09 26.85 4.63 4.61
黄芩(河南灵宝) 176.42 29.76 29.63 13.74 13.56 2.82 2.77
黄芩(甘肃陇西野生) 82.20 16.27 16.19 13.98 13.92 3.72 3.71
黄芩(北京同仁堂) 32.26 8.36 8.36 7.65 7.78 1.85 1.86
  注:a一测多评法所得含量;b外标法实测含量。
  黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素是黄芩中
的主要特征性成分,在药材中含量高,药理活性显著
且与黄芩的功效具有相关性,是评价黄芩药材质量
的适宜指标。因此本文选取它们作为质控指标,并
建立它们之间的相对校正因子。本试验选用黄芩苷
为对照,建立该成分与其他3种成分间的相对校正
因子,是因为黄芩苷是黄芩药材中的典型成分,价廉
易得。本文首次将一测多评法应用于黄芩的质量评
价中,一测多评所得成分含量的计算值与传统的外
标法所得实测值间没有显著性差异,不同实验条件
下各成分间的校正因子重现性良好(RSD<28%)。
说明一测多评法———在对照品缺乏的前提下,可以
作为一种方便、快捷、准确的好方法应用于药材多成
分的含量测定。
针对在只使用单个对照品时,如何正确定位黄
芩药材中其余3个目标色谱峰的问题。本文分别引
入成分间的保留时间差和成分间的相对保留值两种
参数作为定位标准,并考察了5根不同规格或不同
品牌的色谱柱,比较结果显示,采用成分间的保留时
间差更能够准确定位上述目标色谱峰。
理论上在特定的色谱条件下,同一化合物的相
对校正因子(RCF)可以在不同仪器上重现,在相同
色谱条件下,可用其RCF值进行定量分析。目前相
对校正因子在气相色谱分析中实际应用普遍,但是
在液相色谱定量分析尤其是中药质量评价中应用较
少。曾有报道采用紫外法测定药物的紫外百分吸收
系数(ε),然后将其应用于药物分析,其精确度和准
确度完全可以满足药物分析的要求[79]。但是由于
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紫外分析中所用的溶剂往往不同于高效液相色谱分
析所用的溶剂系统,一般紫外分析中所给出的紫外
百分吸收系数不能直接应用于高效液相色谱。因
此,有必要针对对照品供应缺乏的中药开展系统的
研究,建立基于HPLC的紫外相对校正因子库,分析
人员在报告研究结果时,给出各成分的 RCF值,将
其作为HPLC定量分析的一个辅助参数备用,并逐
步地将其应用到中药多成分同步质量控制当中。
[参考文献]
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Aquantitativemethodforsimultaneousassayoffourflavoneswithone
markerinRadixScutelariae
ZHUJingjing,WANGZhimin,ZHANGQiwei,NIUJiwei,LIFeng
(InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)
[Abstract] Objective:TodevelopaquantitativemethodforsimultaneouslydeterminingfourflavonesinRadixScutelariae,by
usingonechemicalstandardsubstanceMethod:Therelativecorectionfactors(RCF)offourflavonesweredeterminedbyHPLC
DADWithinthelinearranges,thevaluesofRCFat274nmofwogonoside,baicalein,andwogonintobaicalin,were07467,0563
8,04351,respectivelyAndthecontentsofbaicalinin27samplesofScutelariabaicalensiswereauthenticalydeterminedbytheex
ternalstandardmethod,andthecontentsofthethreeotherflavoneswerecalculatedaccordingtotheirRCFThecontentsofthesefour
flavonesinthealsamplesweredeterminedwithexternalstandardmethodResult:TheRCFhadagoodreproducibility(RSD066%
283%)NosignificantdiferencesbetweenthequantitativeresultsbytheabovetwomethodswereobservedConclusion:Itisafast,
convenient,andaccuratemethodtodeterminemulticomponentsespecialywhensomeauthenticstandardsubstanceswereunavailable
ItcanbeusedasamethodtocontrolthequalityofRadixScutelariae
[Keywords]quantitativeanalysisofmulticomponentsbysinglemarker(QAMS);relativecorectionfactor;RadixScutelariae;
qualitycontrol
[责任编辑 王亚君]
·12·
第34卷第24期
2009年12月
                           
Vol.34,Issue 24
 December,2009