全 文 ：杜仲愈伤组织与悬浮细胞中黄酮和绿原酸积累研究
张志斌１，颜日明１，邱晓芳１，曾庆桂１，游海１，朱笃１，２
（１江西师范大学 生命科学学院 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室，江西 南昌 ３３００２２；
２江西省天然药物活性成分研究重点实验室，江西 宜昌 ３３６０００）
［摘要］ 目的：比较杜仲愈伤组织和悬浮细胞生长及其次生代谢产物黄酮和绿原酸的积累。方法：将杜仲无菌苗真叶诱
导的愈伤组织进行悬浮培养，研究了悬浮培养物生长的动态和总黄酮类及绿原酸产量积累的动态。结果：杜仲愈伤组织中黄
酮和绿原酸最高分别达到１３４６，１７１２ｍｇ·ｇ－１，而悬浮细胞中黄酮和绿原酸最高分别达到１６６３，３９３ｍｇ·ｇ－１。结论：与愈
伤组织相比，悬浮细胞具有生长周期短、速率快、黄酮和绿原酸积累量高的优势。
［关键词］ 杜仲；愈伤组织；悬浮细胞；黄酮；绿原酸
［收稿日期］ ２００８０８２２
［基金项目］ 教育部重点科技项目（地方２０４０７８）
［通信作者］ 朱笃，教授，博士，Ｔｅｌ：（０７９５）３２００６１６，Ｅｍａｉｌ：
ｚｈｕｄｕ１２＠１６３．ｃｏｍ
杜仲ＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓＯｌｉｖ．为杜仲科杜仲属
植物，目前从其皮和叶中分离并鉴定的活性药用成
分包括绿原酸、黄酮类、桃叶珊瑚苷等３０余种。其
中绿原酸具有降压、抗菌、抗病毒等作用，而黄酮类
化合物具有预防骨质疏松，降血脂血糖等药用功
效［１］。
近几年来，通过剥皮、采叶来提取药用成分是目
前生产杜仲产品的主要手段。由于剥皮和采摘叶片
对杜仲的生长具有很大影响，加之自然环境的破坏，
使杜仲野生植物资源日趋贫乏。因此，为了更有效
的保护杜仲种质资源，研究利用细胞培养方法进行
杜仲次生代谢产物的工业化生产势在必行。迄今，
杜仲组织快繁以及培养条件对其次生代谢产物合成
影响的研究在国内外已有较多的文献报道［２６］。但
有关杜仲悬浮培养生产次生代谢产物的研究不多，如
ＷａｎｇＪＬ等［７］进行杜仲悬浮培养产绿原酸的研究，但
培养悬浮细胞最终质量浓度仅达１ｇ·Ｌ－１。王亚琴
等［８］不同理化因子对悬浮细胞生长及桃叶珊瑚苷的
产生进行了研究。本实验研究了愈伤组织和悬浮细
胞在培养过程中生长和次生代谢产物积累特征，比较
了愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸和黄酮的积累规律，
以期为大规模细胞培养生产杜仲次生代谢产物提供
理论和方法依据。
１ 材料与方法
１．１ 杜仲种子
杜仲种子２００６年１１月采于庐山，由南昌大学
生命科学学院黄兆祥教授鉴定。
１．２ 愈伤组织的诱导［９］
杜仲愈伤组织系由杜仲种子萌发的无菌苗真叶
诱导，诱导的培养基为１０ｍｇ·Ｌ－１２，４Ｄ＋１０ｍｇ
·Ｌ－１ＮＡＡ＋１０ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ＋０７％琼脂的 ＭＳ
培养基。诱导的愈伤组织接种于 Ｂ５＋０５ｍｇ·Ｌ
－１
ＮＡＡ＋１０ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ＋３％蔗糖 ＋０７％琼脂的
固体培养基培养。愈伤组织８～１０ｄ继代１次，经
过４～５代的驯化培养得到无性细胞系。
１．３ 细胞悬浮培养体系的建立
将生长旺盛、结构疏松、易于分散的愈伤组织转
移到液体培养基（Ｂ５＋０５ｍｇ·Ｌ
－１ＮＡＡ＋０６ｍｇ·
Ｌ－１６ＢＡ＋３％蔗糖）中，置于摇床中进行悬浮培养。
培养１周后，培养液中即有悬浮单细胞或小细胞团出
现。继代培养时，加入等量的新鲜培养液，摇匀，稍静
置，待大细胞团沉降后分瓶，不需过滤，即可得到不含
大细胞团块的培养物。这样通过３～４次继代培养，
即可得到只含单细胞或小细胞团的培养物。
１．４ 细胞生长的测定
愈伤组织：每隔２ｄ随机抽取３瓶愈伤组织培
养物测其质量。从培养容器中取出培养所得愈伤组
织，用滤纸吸净其表面水分，称其鲜重，真空冷冻干
燥至恒重，称组织干重。实验重复３次，结果取其平
均值。
悬浮细胞：每隔２ｄ随机抽取３瓶悬浮培养物
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测其质量。悬浮培养细胞经尼龙网过滤，蒸馏水洗
涤３次，称重即得其鲜重，真空冷冻干燥至恒重，称
重即为细胞干重。实验重复３次，结果取其平均值。
１．５ 黄酮、绿原酸的提取与测定
１．５．１ 提取方法 将干燥至恒重的愈伤组织和悬
浮细胞分别准确称取０２ｇ，用１０ｍＬ８０％甲醇９０
℃恒温水浴热提５ｈ［１０］，所得提取液为供测液备用。
１．５．２ 黄酮的测定方法 将上述提取液用滤纸初
过滤，吸取滤液０５ｍＬ，加２ｍＬ甲醇，０２５ｍＬ５％
ＮａＮＯ２，摇匀，放置 ６ｍｉｎ，再加 ０２５ｍＬ１０％
Ａｌ（ＮＯ３）３摇匀放置６ｍｉｎ后，加２ｍＬ４％ ＮａＯＨ摇
匀，放置 １５ｍｉｎ后在 ５１０ｎｍ波长下测定其吸光
度［１１］。回归方程为 Ｙ＝０８３４４３Ｘ，Ｒ２＝０９９９２（Ｙ
为质量浓度ｇ·Ｌ－１，Ｘ为吸光度）。
１．５．３ 绿原酸的测定方法［１２］ 将提取物用０４５
μｍ微孔滤膜再次过滤，以２０μＬ的进样量进样检
测。仪器Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱仪；色谱柱 Ｈｙ
ｐｅｒｓｉｌＣ１８ＯＤＳ（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相乙
腈水磷酸（１２∶８７９∶０１）；流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测
器ＵＶ３２７ｎｍ。回归方程为 Ｙ＝００１４２６Ｘ，Ｒ２＝
０９９９１（Ｙ为质量浓度ｍｇ·Ｌ－１，Ｘ为峰面积）。
２ 结果与分析
２．１ 杜仲愈伤组织的生长和次生代谢产物的积累
将继代４代以上生长旺盛、质地疏松的愈伤组
织接种到固体培养基上。每隔２ｄ测定培养愈伤组
织的干重、黄酮及绿原酸的含量（图１）。
图１ 杜仲愈伤组织生长及其次生代谢产物积累
杜仲愈伤组织生长大致呈“Ｓ”型曲线，０～４ｄ
为其延迟期，是细胞生长的适应期，细胞的生物量增
长缓慢。第４天以后，逐渐进入对数生长期，对数生
长期持续在４～１６ｄ，此期间细胞处于旺盛的分裂状
态，是生物量积累的主要阶段。到第１６天时细胞干
重达到０２４３６ｇ／瓶，黄酮从３５７ｍｇ·ｇ－１增加到
１３４６ｍｇ·ｇ－１，增加３７８倍，而绿原酸从０４３６ｍｇ
·ｇ－１增加１７１２ｍｇ·ｇ－１，增加了将近４倍。培养
的第１６～２０天细胞进入减速生长期，随着培养时间
的延长愈伤组织干重增加缓慢，黄酮和绿原酸含量
呈逐渐降低趋势。在培养的１８ｄ生物量干重达到
最大为 ２４９２ｍｇ·ｇ－１，而黄酮和绿原酸分别为
１０８３，１６０４ｍｇ·ｇ－１。李琰［４］和唐建军［５］等在研
究不同理化因子对杜仲愈伤组织中次生代谢产物积
累的影响时，也发现在培养的后期次生代谢产物的
含量呈下降趋势。
２．２ 杜仲悬浮细胞的生长和次生代谢产物的积累
取经过３次继代获得的形态均匀，生长旺盛的
杜仲细胞作为种子细胞系接入到悬浮培养基中进行
培养，每２ｄ随机抽取３瓶培养物，测定细胞干重及
黄酮、绿原酸的产量（图２）。
图２ 杜仲悬浮培养细胞生长及其次生代谢产物积累
悬浮培养生长曲线和愈伤组织生长曲线类似，
细胞生长曲线基本为“Ｓ”型，但其滞后期非常短，仅
有２ｄ，很快进入了对数生长期。在４～８ｄ时细胞
增殖最快，而此时细胞增长速度也最快，达到０６ｇ
·Ｌ－１·ｄ－１。到第８天以后，细胞生长速率迅速下
降，同时细胞进入生长平稳期，生物量不再增加。在
培养前期，黄酮和绿原酸的积累随着细胞生物量的
增长而逐渐增加，但２种代谢物的积累状况各不相
同，绿原酸产量于培养第 １０天达到最高值 ２６５７
ｍｇ·Ｌ－１，随后随着培养时间的延长而逐渐减少；而
黄酮的积累随着细胞生长而增加，当细胞生长进入
停滞期时黄酮的产量仍在增加，呈现典型的部分生
长耦联型产物合成特征，这和新疆雪莲细胞悬浮系
中黄酮的积累特点相似［１３１４］。
２．３ 杜仲愈伤组织和悬浮细胞的生长和次生代谢
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产物积累的比较
杜仲愈伤组织和悬浮细胞的生长曲线相似，但
愈伤组织的生长周期更长，生物量增殖速度更小。
与愈伤组织的生长过程相比，悬浮细胞培养具有生
长快、周期短、产率高的明显优势。
同时作者比较了杜仲愈伤组织和悬浮细胞中黄
酮和绿原酸的过程积累量。在相同的培养时间下，
悬浮细胞黄酮和绿原酸的含量都要比愈伤组织高
（图３，４）。悬浮细胞在生长周期内黄酮和绿原酸积
累的最高质量分数分别为１６６３，３９３ｍｇ·ｇ－１，而
愈伤组织最高分别达到１３４６，１７１２ｍｇ·ｇ－１。由
此可以看出，和愈伤组织培养相比，悬浮细胞培养对
于次生代谢产物的积累具有明显的优势。因此，在
野生资源面临枯竭，人工种植无法满足市场对杜仲
药源的需求情况下，工业上利用杜仲悬浮细胞培养
技术生产次生代谢产物就更具有实际意义。
图３ 杜仲愈伤组织和悬浮细胞中黄酮含量的比较
图４ 杜仲愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸含量的比较
３ 讨论
由于细胞与培养环境的相互作用，植物细胞固有
的代谢途径和代谢产物与细胞生长的关系就变得更
为复杂。一般认为悬浮细胞次生代谢产物的含量要
高于愈伤组织，原因可能包括以下２方面：①在液体
培养基中细胞的液质接触面大，营养成分可较快渗入
细胞内；②在液体培养中抑制细胞生长的代谢产物可
较快释放而作为合成次级代谢产物的前体；王俊
丽［７，１５］等在研究杜仲愈伤组织和悬浮细胞的绿原酸
的含量时也发现悬浮细胞绿原酸的含量要高于愈伤
组织的含量，当培养条件合适时，悬浮细胞绿原酸的
含量可接近杜仲叶的含量。本实验研究发现，杜仲培
养过程中悬浮细胞黄酮和绿原酸的积累量也均高于
愈伤组织，说明建立悬浮细胞培养系研究细胞生长和
次生代谢产物积累规律对于植物细胞培养放大和提
高次生代谢产物的得率具有重要意义，也是未来植物
细胞培养生产次生代谢产物发展的主要方向。
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Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｉｎｃａｌｕｓａｎｄ
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（１ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＰｌａｎｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆＪｉａｎｇｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，
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２ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＪｉａｎｇｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＡｃｔｉｖｅＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｉｎＮａｔｕｒａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｙｉｃｈｕｎ３３６０００，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏａｎａｌｙｚｅａｎｄｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｃｅｌｇｒｏｗｔｈａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｉｎｔｈｅｃａｌ
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ｔｅｎｔｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｉｎｔｈｅｃａｌｕｓｗｅｒｅ１３．４６，１．７１２ｍｇ·ｇ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔｈｅｓｅｔｗｏｓｅｃ
ｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｗｅｒｅ１６．６３，３．９３ｍｇ·ｇ－１ｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌｃｕｌｔｕｒｅｃｏｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｃｏｍｐａｒｉｎｇｗｉｔｈｃａｌｕｓ，ｔｈｅ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌｓｈｏｗｅｄａｓｈｏｒｔｇｒｏｗｔｈｐｅｒｉｏｄａｎｄｈｉｇｈｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｗｉｔｈａｒｅｍａｒｋａｂｌｅｈｉｇｈｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄ．
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