全 文 ：+ 种海藻溴酚化合物的抗肿瘤作用及其机制研究
孙雪! 徐年军!! 郭俊明+! 严小军
f宁波大学 生命科学与生物工程学院 海洋生物工程重点实验室! 浙江 宁波 )+%
+f宁波大学 医学院! 浙江 宁波 )+#
$摘要%!目的&探讨 + 种海藻溴酚化合物对 ) 株肿瘤细胞JQVB$9L<$ML<5(+) 的体外抗肿瘤作用及其作用机制( 方法#
采用9NN比色法检测不同浓度溴酚化合物对肿瘤细胞的抑制作用)用流式细胞术分析 + 种化合物对 ) 种肿瘤细胞的细胞周
期和非整倍体的诱导作用( 结果#+ 种海藻溴酚化合物对肿瘤细胞均有较强的抑制作用$其中对JQVB细胞的抑制活性最强( +
种海藻溴酚化合物均不能引起细胞凋亡$但能使肿瘤细胞的倍性改变$产生非整倍体$并使细胞周期受到影响( 对 JQVB细胞
和9L<细胞$低浓度能引起亚倍性的产生$较高浓度则引起 L

期抑制( 对 ML<5(+) 细胞$不同浓度处理均能引起 L

期抑
制$其抑制程度具有剂量效应( 结论#海藻溴酚化合物对肿瘤细胞具有不同的生长抑制活性$其作用机制与诱导产生非整倍
体和细胞周期抑制有关(
$关键词%!海藻溴酚)抗肿瘤)流式细胞术)细胞周期
$稿件编号%!+$$*$*$$*
$基金项目%!国家自然科学基金项目!&$(%#$%))浙江省自然科学
基金项目!9&$)$*)浙江省钱江人才计划项目!+$$%>$$)(
$通信作者%!!徐年军$博士$研究员$主要从事海藻生物活性物质
及海洋药物相关研究$NQV# !$%& (%#$$&($H50BRV# 7W2RB21W23
2]WfQUWf.2
!!海藻溴酚类化合物是一类海藻自身合成%海洋
生物特有的卤代化合物$近年来逐步引起了海洋药
物研究者的注意$海藻溴酚化合物具有各种生物活
性$如抗肿瘤活性%抗菌活性%蛋白酪氨酸磷脂酶 M
抑制活性和降血糖活性等*5)+ ( 自从第一个海洋抗
肿瘤药物阿糖胞苷发现以来$海洋抗肿瘤药物的研
究逐渐成为热点$国内外对其作用机制的研究主要
侧重于细胞凋亡%周期调控%微管活性的干扰%免疫
力的提高等$其中细胞周期调控是抗癌药物潜在的
靶部位之一( 目前认为$肿瘤的发生可能与细胞周
期调控关卡的失控有关$使本来应停止增殖或发生
凋亡的细胞中的 I;4出现异常$造成细胞恶性增
生*&+ ( 本文以从松节藻中分离的 + 个溴酚化合物为
材料$初步研究了它们对 ) 种肿瘤细胞的细胞抑制
作用及其作用机制(
!材料
松节藻 M?松节藻科海藻$样品采于山东青岛太平角海湾$由中
国科学院海洋研究所丁兰平研究员鉴定$作者对其
进行了抗肿瘤天然产物的研究$从中首次分离得到
$ 多个海藻溴酚类化合物*+ ( 本实验样品为抗肿
瘤活性较强%样品量较大的 + 个化合物( 实验用肿
瘤细胞包括宫颈癌JQVB细胞%人胃癌9L<细胞%胃
癌 ML<5(+) 细胞均购自中国科学院上海生化与细
胞生物学研究所(
!方法
]!化合物样品制备!松节藻样品经粉碎后用
*g乙醇提取 ) 次$合并提取液后浓缩$醋酸乙酯萃
得到棕黑色浸膏$进行硅胶柱色谱$从其中的氯仿5
甲醇!r$)r部分得到 + 个有明显显色组分$分
别运用反复凝胶柱色谱%重结晶及制备高效液相色
谱分离得到化合物 4和化合物 M( 其中化合物 4
经各种波谱鉴定为 +$+p$)$)p5四溴5&$&p$$p5四羟
基双苯基甲烷$为淡黄色晶体$熔点 +% h)化合物
M为 +$+p$)5三溴5)p$&$&p$5甲羟基5#p5甲氧甲基双
苯基甲烷$为白色粉末$熔点 +++ j++)f h( + 个
样品目前保存在宁波大学海洋生物工程重点实
验室(
]!细胞培养!本实验室内 ) 种肿瘤细胞常规培
养于含 $g的小牛血清的>G9:5#&$ 培养液中$置
于 g+
培养箱内 )% h贴壁培养$取对数生长期
的细胞进行试验(
]&!细胞生长抑制率的测定!肿瘤细胞经胰酶消
化后$用>G9:5#&$ 培养基稀释成 i$个=0F$接
种于 *# 孔板上$培养 +& ?后$分别加入终浓度为 $
$$+$$ 0D-F
d的药品$继续培养 &( ? 后倒掉培
-)%-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! !
\/Vf)$ :SSWQ!*
9B6$ +$$
养液$每孔加入 +$

F磷酸缓冲液 !GM8溶解的
9NN!+ D-F
d
$继续培养 & ? 倒出$每孔加入 $

F的I98O$室温下在微孔板震荡器上震荡 # 0R2$
待成色产物溶解后$用酶标仪测定各孔的吸光度
#
&*$
( 按公式!#对照 d#样品=#对照 i$$g计算药物
对肿瘤细胞的生长抑制率( 实验设 ) 个平行样(
]Y!流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期!样
品处理方法参照文献*#+ $在 +& 孔板上接种对数
生长期的细胞$培养 +& ? 后细胞完全贴壁$除去
培养基$加入新鲜培养液和不同浓度的待测化合
物$培养 +& ? 后$用 $f+g的胰酶消化并收集细
胞! i$#个=0F $用 %$g冷乙醇 & h固定过
夜$用 GM8 把乙醇洗净$加入 I;45GCQA >QBDQ2@
bR@!0F$染色 )$ 0R2 后上机检测!波长 &(( 20$功率
0Z ( 用鸡红细胞作为标准并调至通道数为
!!
$$ k+$记数 i$&个细胞$测出的直方图用
G?/Q2R7公司的 9WV@R.6.VQ软件处理$算出细胞各
周期的 I;4相对含量和百分数 *%+ ( 实验设 ) 个
平行样$结果取平均值(
&!结果
&]!+ 种化合物对肿瘤细胞生长的抑制作用!从
表 可看出$这 + 种海藻溴酚化合物对 ) 种肿瘤细
胞的生长抑制作用不同$它们均随浓度升高抑制作
用增强$对JQVB细胞最敏感$对另外 + 种胃癌细胞
的抗肿瘤活性较低( + 种化合物对这 ) 种肿瘤细胞
的抑制作用均呈现良好的量效关系$其中化合物 4
对JQVB细胞的:<
$
为 (f% 0D-Fd$对 9L<细胞
为 )f* 0D-Fd$对 ML<5(+) 细胞为 )*f$% 0D-
F
d
( 化合物 M对 JQVB细胞的 :<
$
为 *f# 0D-
F
d
$对9L<细胞为 &$f( 0D-Fd$对ML<5(+) 细
胞为 )*f#) 0D-Fd(
表 !海藻溴酚化合物对 ) 种肿瘤细胞的生长抑制作用!
$
8k$$-e) g
质量浓度
=0D-F
d
化合物4 化合物M
JQVB 9L< ML<5(+) JQVB 9L< ML<5(+)
&+-*# k)-)( &-*& k$-#+ %-++ k-(+ ))-* k&-$ %-$) k$-* -)# k$-*#
$ &-&* k&-+) +- k-%( ++-(% k)-(# )-) k&-% +-(% k)-% -*( k-(
+ #(-)$ k#-+& +&-# k&-% )#-++ k-&# %$-% k%-#) )#-* k)-)( ))-)# k&-$
$ (*-+ k&-(% &#-) k&-(* *-+ k#-)% (%-% k&- %-( k&-+ #-# k&-+#
&]!+ 种化合物对肿瘤细胞倍性的影响!非整倍
性在临床肿瘤细胞中是比较常见的 ! #$g j
%$g
*(+
$但对于稳定的测试株JQVB细胞和9L<细
胞$一般不存在亚倍性的自然出现$而本实验中在
JQVB和9L<细胞中都检测到了非整倍体的出现$
表明其是在海藻溴酚化合物诱导作用下产生的(
化合物4处理 &( ?和正常JQVB细胞的流式细
胞仪检测图谱显示$低浓度! 0D-Fd处理后JQ5
VB细胞有非整倍体的产生$其中整倍体的 L

为
&f%g$ 8 mL
+
为 &f)g$非整倍体的L

为 fg$
8 mL
+
为 *(f*g( 而对照组JQVB细胞的I;4在各
周期的分布为 L

为 %)fg$8 mL
+
为 +#fg(
0D-F
d的化合物M处理 +& ? 后的 9L<细胞即有
非整倍体的产生$其中整倍体的 L

为 &*f#g$ 8 m
L
+
为 $f&g$非整倍体的 L

为 )(f*g$ 8 mL
+
为
#fg( 而对照组 9L<细胞的细胞周期中 L

为
#&f%g$8 mL
+
为 )f)g(
&]&!+ 种化合物对肿瘤细胞的细胞周期影响!对
JQVB细胞的影响#表 + 可以看出$与正常对照组比
较$+ 种化合物在较低浓度下! 0D-Fd对肿瘤细
胞的分裂有一定的促进作用( 而在较高浓度!$
& 0D-F
d
时能抑制肿瘤细胞的分裂$起到抗肿
瘤的作用$并且具有一定的剂量效应( 这一点和 +
种溴酚化合物对 JQVB细胞的生长抑制实验是基本
相符的( 化合物4在较低浓度! 0D-Fd处理 &(
?可引起JQVB细胞的非整倍体产生$在高浓度!$
& 0D-F
d
较长时间作用下$可使细胞出现明显
的L

期抑制$表明其抗肿瘤机制主要可能在 L

期
诱导肿瘤细胞分化$不能有效合成 I;4( 化合物 M
对JQVB细胞的抑制活性与化合物4类似$但未检测
到非整倍体产生( 只有在高浓度下!$& 0D-
F
d
才能检测到明显的L

期抑制(
对9L<细胞的影响#从表 ) 可以看出$+ 种化
合物在较低浓度下!$ 0D-Fd$8 mL+ 期细胞
数量比对照略高$表明较低浓度对肿瘤细胞具有较
弱的促进作用$只有在细胞浓度为 & 0D-Fd时$
-&%-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! !
\/Vf)$ :SSWQ!*
9B6$ +$$
!!
表 +!海藻溴酚化合物作用下JQVB细胞的细胞周期I;4含量!
$
8k$$-e) g
化合物
质量浓度
=0D-F
d
+& ? &( ?
L

8
L
+
8 mL
+
L

8
L
+
8 mL
+
4 -% k+-+) +)- k-+% +-+ k$-*# &&-) &-% k+-# )-( k-&% (- k- &-)
!- k$- !-) k-&$ !(%-# k-+ !*(-*
%-$ k+-$) *-& k-)+ *-# k$-% +*-$ (#-# k+-$% -$ k-) (-& k$-(* )-&
& %%-) k- (-% k-($ &-$ k$-)# ++-% *&- k$-*# - k$-*# $ -
M #)-+ k+-+* +-# k-& -+ k-+ )#-( *-( k+-&) +)-& k+-) #-( k$-*$ &$-+
%-( k+-# &-+ k- &-$ k-&& +(-+ ($-) k+-%+ -# k+-# (- k$-($ *-%
& %#-# k+-+ #-( k-%) #-# k- +)-& *- k$-* (-* k$-* $ (-*
!!注#括号中的数字表示非整倍体各细胞间期含量!表 ) 同(
才能有效抑制细胞的分裂( 这一结果显示 + 种化合
物对9L<细胞的抗肿瘤作用不强$与其:<
$
分别为
)f*$&$f( 0D-F
d是基本相符的( 化合物 4在
低浓度下没有抑制作用$高浓度!& 0D-Fd产生
L

期抑制$8期和L
+
期的细胞都大量减少$L

期的
细胞比例增加( 化合物 M处理 +& ? 后低浓度组观
察到非整倍体$而 &( ? 后没有观察到非整倍体$较
高浓度也能使9L<细胞产生L

期抑制(
表 )!海澡溴酚化合物作用下9L<细胞的细胞周期I;4含量!
$
8k$$-e) g
化合物
质量浓度
=0D-F
d
+& ? &( ?
L

8
L
+
8 mL
+
L

8
L
+
8 mL
+
4 )-$ k+-# &$-$ k+-$% %-$ k$-%( &%-$ &*-( k+-&# &$-% k+-+ *- k$-%$ $-+
#-$ k+-+ ))-* k+-+# - k$-*+ )*-$ &(- k)- &%- k+-% &-$ k$-(+ -
& %-( k-++ +#-+ k-+ +-$ k$-)# +#-+ (%-+ k+-)( -% k+-&+ - k$- +-(
M &*-# k+-% &)-+ k-( %-+ k$-# $-& #-+ k+-$ )$-* k-% %-* k$-&& )(-(
!)(-* k+-) !&%-+ k-# !)-* k$-% !#-
&*- k-*+ &-+ k-)* -% k$-) $-* *- k+-$ )+-% k+-% (-+ k$-) &$-*
& ($-& k+- (-# k+-+ -$ k$-% *-# *$-% k+-+# (-$ k+-)) -) k$-$ *-)
!!对 ML<5(+) 细胞的影响# 从表 & 可以看
出$+ 种海藻溴酚化合物在不同浓度下均对
ML<5(+) 细胞有一定的 L

期抑制作用$其抑制
作用具有一定的剂量效应( 随着浓度的增加$8
期和 L
+
期细胞减少$在 +& ? 时 L
+
期细胞甚至
未检测到( 实验表明海藻溴酚化合物对 ML<5
(+) 的抑制作用主要与其细胞周期的 L

期抑制
有关(
表 &!海藻溴酚化合物作用下ML<5(+) 的细胞周期I;4含量!
$
8k$$-e) g
化合物
质量浓度
=0D-F
d
+& ? &( ?
L

8
L
+
8 mL
+
L

8
L
+
8 mL
+
4 (%-+ k-** %-% k-%( - k$-&& +-( (+-# k-*+ -) k-&* #- k$-&& %-&
*)- k-) #- k-) $ #- ()-% k-)# )-) k-& )-$ k$-## #-)
& *- k-% &- k-% $ &- (%- k+-) $- k-** +-$ k$-% +-
M %#-& k+-+ %- k-% #- k$-(+ +)-# (&-# k+-$+ +-# k+-+ +-( k$-#$ -&
(-$ k-** -$ k-** $ -$ (#- k+-&# +-% k+-% $-( k$-% )-
& (+-% k+-+) %-) k+-+) $ %-) *$- k+-(( *-) k+-%* $-# k$-$ *-*
Y!讨论
许多海洋抗肿瘤药物也是细胞周期特异性药
物$其主要发生在细胞周期的 L

期和 L
+
期( 典型
的 L
+
期阻滞药物如来自海鞘的 Q.@QR2BS.RUR25%&)
!HN5%&)$ j$

D-F
d的 HN5%&) 能抑制肿瘤细
胞的增殖$导致 8 期和 L
+
期的抑制和细胞凋亡**+ (
来源于海绵的临床多肽类药物 AQV/CWSRUQ4不仅能
阻止微管蛋白的形成$还能在肿瘤细胞的 L
+
=9期
阻断其 )+I5CBS细胞$导致细胞凋亡*$+ ( 海洋硅藻
S&$(+& <$%+&%;&水提物对 ) 种肿瘤细胞;8-%-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! !
\/Vf)$ :SSWQ!*
9B6$ +$$
H)* 和9*# 具有较强的抑制活性$对非小细胞型肺
癌;8
=8 期阻滞*+ ( 值得
一提的是许多 L
+
=9期抑制药物都能引起细胞凋
亡$而L

期抑制药物导致产生非整倍体的几率高
些$这也可能是本实验中未检测出细胞凋亡的原因(
许多药物都能诱导产生非整倍体$如有丝分裂
抑制剂秋水仙素和对苯二酚等都是常见的非整倍体
诱导剂( 药物诱导产生非整倍体也是抗肿瘤机制之
一$如紫杉醇和 URS./UQC0/VRUQ在细胞和动物水平上
都有药物协同作用$具有较好的应用前景$其在小鼠
卵巢癌细胞中主要作用机制不是阻止细胞有丝分
裂$而是药物诱导引起非整倍体的产生*++ (
本实验中 + 种海藻溴酚化合物对肿瘤细胞都有
较强的抑制活性$但在整个实验过程中$+ 种化合物
作用后JQVB$9L<和ML<5(+) 细胞都没有检测到凋
亡小体$表明没有细胞凋亡产生$其主要抗肿瘤机制
可能与细胞L

期抑制$以及产生非整倍体有关(
$参考文献%
* +!PW ;X$EB2 P$KB2 PX$Q@BVf42@R]B.@QCRBV]C/0/A?Q2/VSTC/0
@?Q0BCR2QCQU BVDBM?+$$)$ #+!(# ++f
* + +!史大永$许凤$李敬$等f海藻中溴酚化合物的蛋白酪氨酸磷
脂酶 M抑制活性研究*X+ f中国中药杂志$+$$($ ))!*#
++)(f
* ) +!史大永$许凤$贺娟$等f溴酚化合物GNGM抑制活性与松节
藻提取物在糖尿病大鼠体内降血糖活性*X+f科学通报$
+$$($ )!$# *#f
* & +!8?BARC/L:$ JBCABCXZf42@R.B2.QCUCWD@BCDQ@# .?Q.[A/R2@./2@C/V*X+fX* +!徐年军f海藻抗肿瘤抗细菌生物活性物质的研究*I+f北
京# 中国科学院$+$$+f
* # +!陈竹$李小峰$杨兆文$等f丹参酮
2
4
对 JQVB细胞增殖和细
胞周期的影响*X+f中国药物与临床$+$$($ (!%# )*f
* % +!汪谦f现代医学实验方法*9+f北京#人民卫生出版社$
**%#((%f
* ( +!OS@QC?QVU 9<$ cB2.QU DBS@CR..BC.R2/0BRSVQSS?Q@QC/DQ2Q/WS@?B2 R2 QBCV6DBS5
@CR..B2.QC*X+f* * +!BA/A@/@R.QTQ.@S/TQ.@QR2BS.RUR25%&) R2 .B2.QC.QVS*X+fXMR/V
*$+!J//U b4$ ZQS@F9$ >/W,QM$ Q@BVfGQV/CWSRUQ4$ B2/cQV
B2@R0R@/@R.BDQ2@,R@? AB.VR@B7QV5VR[Q0R.C/@W]WVQ5S@B]RVRYR2DB.@Rc5
R@6*X+fQS$ +$$+$ !#+# ))#f
*+!B2@RAC/VRTQCB@RcQQTQ.@S/TB2 B`WQ/WSQ7@CB.@TC/0@?Q0BCR2QURB5
@/0S&$(+& <$%+&%;& BDBR2S@S/VRU @W0/CS# FW2D.BC.R2/0B$ [RU5
2Q6.BC.R2/0B$ 0QVB2/0B.QVVR2QS*X+f42@R@W0/C>QS$ ***$
*!# #+f
*++!JWB2DL8$ F/AQY5MBC./2SF$ ECQQYQM8$ Q@BVfG/@Q2@RB@R/2 /T
@B7/VQTR.B.6B2U ]6URS./UQC0/VRUQR2 /cBCRB2 .BC.R2/0B7Q2/5
DCBT@5]QBCR2D0R.Q*X+fQS$ +$$#$ +!# +*(f
3@A-AF+?D>I>QAH,@EAB>+>QB,@-H+?IAS? T-@EH?IKD?+?JB>@?.H
ID?++,D-@>,.R,>
8_;PWQ

$ P_;RB21W2

!
$ L_OXW20R2D
+
$ K4;PRB/1W2

!fN&.)(B<=F;=+7.;+-.+$&-A C;<+.?-<(?;-&)
+fN&.)(B<=@+A;.;-+$ H;-,?;-&
!!*3KHAD,QA+!5KX>QA-O># N/R2cQS@RDB@Q@?QB2@R@W0/CQTQ.@S/T@,/[R2US/T]C/0/A?Q2/VSRS/VB@QU TC/00BCR2QBVDBQM?.<-=+%J<;A+$/2 @?CQQ@W0/C.QVS/TJQVB$ 9LAB?E# 9NN0Q@?/U ,BSQ05
AV/6QU @/BSSB6@?QR2?R]R@/C6QTQ.@S/T0BCR2Q]C/0A?Q2/VS,R@? cBCR/WS./2.Q2@CB@R/2SfEV/,.6@/0Q@C6!E<9 ,BSWSQU @/S@WU6@?Q
.QV.6.VQB2U B2QWAV/RU R2UW.@R/2f7>HF.A# M/@? /T@,/]C/0/A?Q2/VSS?/,QU .6@/@/7R.B.@RcR@RQS/2 @?Q@QS@QU @W0/C.QVS-JQVB.QVS
,QCQAC/cQU @/]Q@?Q0/S@SQ2SR@RcQ@/@?Q0BCR2Q]C/0/A?Q2/VSf4V@?/WD? @?Q6./WVU2p@.BWSQBA/A@/SRS/T@?Q@W0/C.QVS$ @?QB2QW5
AV/RU B2U .QV.6.VQR2?R]R@R/2 ,QCQUQ@Q.@QUfE/CJQVBB2U 9L<.QVS$ ?6A/AV/RU ,BS/]SQCcQU W2UQCV/,UCWD./2.Q2@CB@R/2S$ ,?RVQ
L

A?BSQ]V/.[ ,BS.BWSQU ]6?RD?QCUCWD./2.Q2@CB@R/2SfE/CML<5(+) .QVS$ L

A?BSQR2?R]R@R/2 ,BS/]SQCcQU T/CURTQCQ2@UCWD./25
.Q2@CB@R/2S$ B2U @?QR2?R]R@R/C6QTQ.@S?/,QU U/SQ5UQAQ2UQ2@f/?@Q.FH-?@# 9BCR2Q]C/0/A?Q2/V.B2 R2?R]R@@?QAC/VRTQCB@R/2 /T@?CQQ
@W0/C.QVS$ B2U @?Q0Q.?B2RS0,BSAC/]B]V6B2QWAV/RU R2UW.@R/2 B2U .QV.6.VQR2?R]R@R/2f
* >^C S?DEH+!0BCR2Q]C/0/A?Q2/V) B2@R@W0/C) E<9) .QV.6.VQ
E?-# (_Y[\NQXQ++(((#(
$责任编辑!张宁宁%
-#%-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! !
\/Vf)$ :SSWQ!*
9B6$ +$$