全 文 :DeterminationofrubrofusaringentiobiosideinCassiaobtusifoliabyHPLC
TANGLiying1,WANGZhuju1,WUQiuping2,HEYan3,HUANGLuqi1
(1.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
2.JiangXiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;
3.InstituteofBasicClinicalMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)
[Abstract] Objective:ToestablishamethodfordeterminingthecontentofrubrofusaringentiobiosideinCasiaobtusifolia.
Method:TheHPLCwithDiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm)columnwasused,acetonitrileTHF1% aceticacid(18∶3∶79)
wasusedasamobilephase,withflowrateof1mL·min-1,columntemperatureat40℃ anddetectionwavelengthat278nm.Result:
Agoodlinearitywasobtainedfrom0.10.5μgwithr=0.9999forrubrofusaringentiobioside.Theaveragerecoverywas101.1%,
andRSDwas2.23% (n=5).Conclusion:Themethodwasprovedtobesimple,rapid,sensitive,precise,reliableandrepeatable.
ItcanbeappliedtothequalitycontrolofSemenCassia.
[Keywords] Casiaobtusifolia;rubrofusaringentiobioside;HPLC
[责任编辑 张宁宁]
[收稿日期] 20061209
[基金项目] 吉林省科技厅项目(200509031)
[通讯作者] 杨世海,Tel:(0431)4533304,Email:jlyangs@
yahoo.com.cn
抱茎苦荬菜的组织培养及植株再生
陶 静1,杨世海1,张梦萍2,田义新1
(1.吉林农业大学 中药材学院,吉林 长春 130118;
2.江都中医院,江苏 江都 225200)
[摘要] 目的:探讨苦荬菜组织培养和植株再生条件。方法:以苦荬菜叶片为外植体,应用正交设计方法,对
愈伤组织的诱导和分化培养基进行优化筛选。结果:最佳的愈伤组织诱导培养基为MS+2,4D15mg·L-1+6
BA15mg·L-1+NAA10mg·L-1+IBA15mg·L-1+KT15mg·L-1,最佳的不定芽诱导培养基为 MS+2,
4D02mg·L-1+6BA05mg·L-1+NAA05mg·L-1+IBA05mg·L-1+KT05mg·L-1,不定芽经附加
IBA01mg·L-1的1/4MS培养基生根后移栽成活,获得再生植株。结论:建立了一套有效的苦荬菜组织培养再生
体系。
[关键词] 苦荬菜;组织培养;植株再生;正交试验
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)04036804
抱茎苦荬菜 IxeridiumsonchifoliumHance为菊
科苦荬菜属植物,又名苦碟子、盘尔草、秋苦荬菜、
鸭子食等[1]。苦荬菜味苦、性微寒。具有清热祛
火、消炎解毒、凉血消肿、祛瘀止痛、补虚止咳的作
用。现代科学研究表明[2],苦荬菜含有三萜、甾
醇、倍半萜、黄酮、香豆素等,对循环系统,具有增
加冠脉流量、增加心肌营养性血流量,改善心脏微
循环等方面的作用,可开发成为治疗心脑血管系
统疾病的药物。
目前国内外有关苦荬菜的研究主要集中在生
药学及其所含的化学成分、生物活性物质、临床应
用等方面[35],但在组织培养、遗传改良方面却鲜
有报道,仅有唐万侠报道了以苦荬菜地上部分的
培养细胞为原料,生物制备具有特殊药用价值的
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齐墩果酸[6]。抱茎苦荬菜目前均为野生。近年
来,由于市场需求量大,过度采挖,造成野生资源
锐减和生态破坏。因此,应用组织培养方法繁殖
和保存野生药用植物种质已成为必需。笔者首次
采用苦荬菜的叶片建立了组织培养及再生体系,
以期为苦荬菜的快繁、开发利用、种质改良及利用
细胞工程生产有效成分方面的研究提供参考资
料。
1 材料与方法
1.1 外植体的消毒 新鲜苦荬菜叶片采自野生,用
流水冲洗2h,用70%乙醇漂洗30s,无菌水洗2~3
次,再用01%升汞消毒后,用无菌水洗6~8次,然
后将叶片切成05cm2大小,备用。
1.2 愈伤组织和不定芽的诱导 上述外植体接种
于含不同浓度2,4D,BA,NAA,IBA和KT的MS培
养基中。试验采用5因素4水平正交设计法,正交
表选用L16(4
5)。各种培养基均加入蔗糖3%,琼脂
08%,pH58。培养条件:温度(25±1)℃,光照每
天12h,光强为2000lx。
1.3 根的诱导 将诱导出的不定芽接种于生根培
养基中。各种培养基均加入蔗糖3%,琼脂08%,
pH58。培养条件:温度(25±1)℃,光照每天12
h,光强为2000lx。试验采用3因素3水平正交设
计法,正交表选用L9(3
4)。
1.4 移栽 当组培苗长出3条以上不定根时,打开
瓶盖,在室内炼苗2d后移栽至细颗粒、松软的土壤
中,适当遮光,温度保持在20℃左右,相对湿度在
75%~85%。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导 外植体接种20d后,叶表
面切口处产生淡黄色愈伤组织,质地致密。50d后
统计,实验结果表明(表1,2):在叶片诱导愈伤组织
的16种组合中,以8,14号的植物生长物质配方的
愈伤组织诱导率最高,达到100%,1号培养基不能
诱导出愈伤组织。即诱导叶片愈伤组织的最佳激素
组合为MS+2,4D05mg·L-1+6BA15mg·
L-1+NAA10mg·L-1+IBA05mg·L-1+KT
02mg·L-1,MS+2,4D15mg·L-1+6BA05
mg·L-1+NAA10mg·L-1+IBA02mg·L-1+
KT15mg·L-1。5种植物生长物质对愈伤组织的
诱导均有一定的作用,直观分析表明,2,4D对愈伤
组织的诱导率影响最大;其次是 NAA,IBA;6BA,
KT对愈伤组织的诱导率影响最小。方差分析结果
表明,不同质量浓度的2,4D对愈伤组织诱导率的
作用有显著性差异,其他4种植物生长物质各水平
间的差异未达到显著水平。统计分析的结果可得最
优水平组为MS+2,4D15mg·L-1+6BA15mg
·L-1+NAA10mg·L-1+IBA15mg·L-1+KT
15mg·L-1。
2.2 不定芽的诱导 培养出的愈伤组织,随后分化
出丛生芽(2~5,7号)(表1,3,图1),少数培养基处
理不经愈伤直接出芽(1号)或只长愈伤不分化出芽
(6,8~16号)。50d后统计直接产生的不定芽数,
实验结果表明:①在叶片诱导愈伤组织的16种组合
中,以3号的植物生长物质配方的不定芽诱导率最
高,达到302%,以8~16号的不定芽诱导率为最
低,为0。②5种植物生长物质对不定芽的诱导均有
一定的作用,直观分析表明,2,4D对不定芽的诱导
率影响最大;其次是 NAA,KT,IBA;6BA对不定芽
的诱导率影响最小。方差分析结果表明,不同浓度
的2,4D对不定芽诱导率的作用有显著性差异,其
他4种植物生长物质各水平间的差异未达到显著水
平。统计分析的结果可得最优水平组为MS+2,4D
02mg·L-1+6BA05mg·L-1+NAA05mg·
L-1+IBA05mg·L-1+KT05mg·L-1。
2.3 生根 不定芽转接入生根培养基后,分别于第
21天统计生根(表4,5,图2)。结果表明:各种培养
基所诱导的根在形态上无差别,均为白色、细长的大
量侧根。在9种组合中,生根率均较高,以6,8号的
生根率最高,达到100%,诱导不定芽生根的最佳激
素组合为1/2MS+IBA04mg·L-1,1/4MS+IBA
02mg·L-1。培养基、IBA和 ZT3种因素对不定
芽的生根均有一定的作用,直观分析表明,ZT对生
根率影响最大;其次是IBA,基本培养基质量浓度的
高低对生根率影响最小。方差分析结果表明,3种
因素的不同水平对生根率的作用无显著性差异。统
计分析的结果可得最优水平组为1/4MS+IBA01
mg·L-1。
2.4 试管苗移栽 移栽成活是试管苗的难关之一,
成功与否取决于根系是否发达,粗壮根多的幼苗成
活率高,而根少细弱的苗则难成活。待根较繁茂,试
管苗长至5~6cm高时,打开瓶口,炼苗2d,取出,
洗去根部残余的培养基,移栽到花钵中,浇足水,每
周用稀释10倍的MS浇1次,待其正常生长。
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表1 苦荬菜愈伤组织及芽诱导正交试验结果
No. 2,4D/mg·L-1 6BA/mg·L-1 NAA/mg·L-1 IBA/mg·L-1 KT/mg·L-1 愈伤组织诱导率/% 不定芽诱导率/%
1 02 02 02 02 02 00 73
2 02 05 05 05 05 75 500
3 02 10 10 10 10 489 302
4 02 15 15 15 15 675 225
5 05 02 05 10 15 450 100
6 05 05 02 15 10 769 00
7 05 10 15 02 05 279 23
8 05 15 10 05 02 1000 00
9 10 02 10 15 05 721 00
10 10 05 15 10 02 368 00
11 10 10 02 05 15 758 00
12 10 15 05 02 10 353 00
13 15 02 15 05 10 905 00
14 15 05 10 02 15 1000 00
15 15 10 05 15 02 727 00
16 15 15 02 10 05 957 00
表2 苦荬菜愈伤组织诱导率方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F P
2,4D 0702 3 5949 <005
6BA 0126 3 1068
NAA 0331 3 2805
IBA 0241 3 2042
KT 0118 3 1000
误差 0120 3
表3 苦荬菜不定芽诱导率方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F P
2,4D 0213 3 13313 <005
6BA 0016 3 1000
NAA 0036 3 2250
IBA 0024 3 1500
KT 0025 3 1563
误差 0020 3
图1 愈伤组织再生出芽
3 结论与讨论
利用苦荬菜叶片诱导不定芽进行苦荬菜的快速
繁殖是一条快捷的途径。
表4 苦荬菜生根率直观分析
因素 培养基 IBA ZT 生根率/%
1 MS 01 000 875
2 MS 02 005 625
3 MS 04 010 857
4 1/2MS 01 005 875
5 1/2MS 02 010 667
6 1/2MS 04 000 1000
7 1/4MS 01 010 889
8 1/4MS 02 000 1000
9 1/4MS 04 005 750
表5 苦荬菜生根率方差分析
因素 偏差平方和 自由度 FP
培养基 0014 2 0438
IBA 0025 2 0781
ZT 0070 2 2188
误差 0030 2
图2 不定芽诱导生根
激素对植物组织和细胞的增殖、分化;芽和根的诱导
以及形成等起着关键的作用[7]。苦荬菜的愈伤组
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织和不定芽较易于诱导,2,4D在诱导中起着最重
要的作用,另外,组培苗的生根较容易。本试验采用
正交实验分别选取不同的影响因子进行试验,筛选
出苦荬菜愈伤组织、不定芽和生根的最佳培养基。
本研究表明,正交实验设计与数据分析方法对于反
映植物生长物质与丛生芽诱导和生根研究的关系,
选择最佳培养基,都是十分有效的方法,其优越性在
于能大量减少实验次数,从而节省了大量的人力、物
力和财力。可以预计,若能广泛应用正交实验设计
和分析,其工作效率及实验结果的正确性和可靠性
均能得到较大程度的提高。实验中还发现,在MS+
2,4D02mg·L-1+6BA02mg·L-1+NAA02
mg·L-1+IBA02mg·L-1+KT02mg·L-1试验
条件下,少数外植体直接分化不定芽,分化率很低,
若能进一步优化试验条件,提高直接分化不定芽的
分化率,将为苦荬菜快繁和遗传转化体系的建立开
辟一条快捷有效的植株再生途径。
[参考文献]
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TissuecultureandplantregenerationofIxeridiumsonchifolium
TAOJing1,YANGShihai1,ZHANGMengping2,TIANYixin1
(1.ColegeofChineseMedicinalMaterial,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;
2.JiangduHospitalofTraditionalChineseMedicine,Jiangdu225200,China)
[Abstract] Objective:TostudythecalusinductionandplantregenerationofIxeridiumsonchifoliumMethod:Byusingthe
orthogonalexperimentdesign,themediumforcalusinductionandplantregenerationwasoptimizedResult:Theoptimalmediumfor
calusinductionwasMS+2,4D15mg·L-1+6BA15mg·L-1+NAA10mg·L-1+IBA15mg·L-1+KT15mg·L-1,
theoptimalmediumforinducingadventitiousbudwasMS+2,4D02mg·L-1+6BA05mg·L-1+NAA05mg·L-1+IBA
05mg·L-1+KT05mg·L-1Plantletswererootedon1/4MSmediumsupplementedwithdiferentconcentrationsofIBA,and
highrootingandsurvivalwasachievedwhentheIBAconcentrationwas01mg·L-1Conclusion:Aneficientsystemforplantre
generationofIsonchifoliumwasestablished
[Keywords] Ixeridiumsonchifolium;tissueculture;plantregeneration;orthogonaltest [责任编辑 张宁宁]
《中国中药杂志》近况简介
《中国中药杂志》为中国中文核心期刊,中国科技核心期刊;为“中国科学引文数据库”、“中国学术期刊综合评价数据库”
和“中国科技论文统计源”核心期刊,并且被《中国学术期刊文摘》中、英文版收录。在国际上,被美国医学索引 Medline及《化
学文摘》(CA)、《生物学文摘》(BA)、《国际药学文摘》(IPA)、《分析文摘》(AA),俄罗斯《文摘杂志》(AJ),荷兰《医学文摘》
(EM),波兰《哥白尼索引》(IC)等权威性专业文摘收录。
据2005年中国科技论文统计与分析年度研究报告结果:《中国中药杂志》在 Medline收录中国论文的期刊中名列第4位,
为524篇。据中国科学技术信息研究所信息分析研究中心发布2006年版中国科技期刊引证报告:《中国中药杂志》总被引频
次为3260;影响因子为0.634;基金论文比例0.48。另据中国学术期刊综合引证年度报告(2006):《中国中药杂志》总被引频
次为4676,影响因子为0938,5年影响因子1224,基金论文比047。
《中国中药杂志》荣获第三届国家期刊奖百种重点期刊,国家中医药管理局“以岭杯”第三届全国中医药优秀期刊评选一等
奖,第五届中国百种杰出学术期刊,中国科协精品科技期刊工程项目资助。
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