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Tissue culture and plant regeneration of Ixeridium sonchifolium

抱茎苦荬菜的组织培养及植株再生



全 文 :DeterminationofrubrofusaringentiobiosideinCassiaobtusifoliabyHPLC
TANGLiying1,WANGZhuju1,WUQiuping2,HEYan3,HUANGLuqi1
(1.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
2.JiangXiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;
3.InstituteofBasicClinicalMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)
[Abstract] Objective:ToestablishamethodfordeterminingthecontentofrubrofusaringentiobiosideinCasiaobtusifolia.
Method:TheHPLCwithDiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm)columnwasused,acetonitrileTHF1% aceticacid(18∶3∶79)
wasusedasamobilephase,withflowrateof1mL·min-1,columntemperatureat40℃ anddetectionwavelengthat278nm.Result:
Agoodlinearitywasobtainedfrom0.10.5μgwithr=0.9999forrubrofusaringentiobioside.Theaveragerecoverywas101.1%,
andRSDwas2.23% (n=5).Conclusion:Themethodwasprovedtobesimple,rapid,sensitive,precise,reliableandrepeatable.
ItcanbeappliedtothequalitycontrolofSemenCassia.
[Keywords] Casiaobtusifolia;rubrofusaringentiobioside;HPLC
[责任编辑 张宁宁]
[收稿日期] 20061209
[基金项目] 吉林省科技厅项目(200509031)
[通讯作者] 杨世海,Tel:(0431)4533304,Email:jlyangs@
yahoo.com.cn
抱茎苦荬菜的组织培养及植株再生
陶 静1,杨世海1,张梦萍2,田义新1
(1.吉林农业大学 中药材学院,吉林 长春 130118;
2.江都中医院,江苏 江都 225200)
[摘要] 目的:探讨苦荬菜组织培养和植株再生条件。方法:以苦荬菜叶片为外植体,应用正交设计方法,对
愈伤组织的诱导和分化培养基进行优化筛选。结果:最佳的愈伤组织诱导培养基为MS+2,4D15mg·L-1+6
BA15mg·L-1+NAA10mg·L-1+IBA15mg·L-1+KT15mg·L-1,最佳的不定芽诱导培养基为 MS+2,
4D02mg·L-1+6BA05mg·L-1+NAA05mg·L-1+IBA05mg·L-1+KT05mg·L-1,不定芽经附加
IBA01mg·L-1的1/4MS培养基生根后移栽成活,获得再生植株。结论:建立了一套有效的苦荬菜组织培养再生
体系。
[关键词] 苦荬菜;组织培养;植株再生;正交试验
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)04036804
  抱茎苦荬菜 IxeridiumsonchifoliumHance为菊
科苦荬菜属植物,又名苦碟子、盘尔草、秋苦荬菜、
鸭子食等[1]。苦荬菜味苦、性微寒。具有清热祛
火、消炎解毒、凉血消肿、祛瘀止痛、补虚止咳的作
用。现代科学研究表明[2],苦荬菜含有三萜、甾
醇、倍半萜、黄酮、香豆素等,对循环系统,具有增
加冠脉流量、增加心肌营养性血流量,改善心脏微
循环等方面的作用,可开发成为治疗心脑血管系
统疾病的药物。
目前国内外有关苦荬菜的研究主要集中在生
药学及其所含的化学成分、生物活性物质、临床应
用等方面[35],但在组织培养、遗传改良方面却鲜
有报道,仅有唐万侠报道了以苦荬菜地上部分的
培养细胞为原料,生物制备具有特殊药用价值的
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齐墩果酸[6]。抱茎苦荬菜目前均为野生。近年
来,由于市场需求量大,过度采挖,造成野生资源
锐减和生态破坏。因此,应用组织培养方法繁殖
和保存野生药用植物种质已成为必需。笔者首次
采用苦荬菜的叶片建立了组织培养及再生体系,
以期为苦荬菜的快繁、开发利用、种质改良及利用
细胞工程生产有效成分方面的研究提供参考资
料。
1 材料与方法
1.1 外植体的消毒 新鲜苦荬菜叶片采自野生,用
流水冲洗2h,用70%乙醇漂洗30s,无菌水洗2~3
次,再用01%升汞消毒后,用无菌水洗6~8次,然
后将叶片切成05cm2大小,备用。
1.2 愈伤组织和不定芽的诱导 上述外植体接种
于含不同浓度2,4D,BA,NAA,IBA和KT的MS培
养基中。试验采用5因素4水平正交设计法,正交
表选用L16(4
5)。各种培养基均加入蔗糖3%,琼脂
08%,pH58。培养条件:温度(25±1)℃,光照每
天12h,光强为2000lx。
1.3 根的诱导 将诱导出的不定芽接种于生根培
养基中。各种培养基均加入蔗糖3%,琼脂08%,
pH58。培养条件:温度(25±1)℃,光照每天12
h,光强为2000lx。试验采用3因素3水平正交设
计法,正交表选用L9(3
4)。
1.4 移栽 当组培苗长出3条以上不定根时,打开
瓶盖,在室内炼苗2d后移栽至细颗粒、松软的土壤
中,适当遮光,温度保持在20℃左右,相对湿度在
75%~85%。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导 外植体接种20d后,叶表
面切口处产生淡黄色愈伤组织,质地致密。50d后
统计,实验结果表明(表1,2):在叶片诱导愈伤组织
的16种组合中,以8,14号的植物生长物质配方的
愈伤组织诱导率最高,达到100%,1号培养基不能
诱导出愈伤组织。即诱导叶片愈伤组织的最佳激素
组合为MS+2,4D05mg·L-1+6BA15mg·
L-1+NAA10mg·L-1+IBA05mg·L-1+KT
02mg·L-1,MS+2,4D15mg·L-1+6BA05
mg·L-1+NAA10mg·L-1+IBA02mg·L-1+
KT15mg·L-1。5种植物生长物质对愈伤组织的
诱导均有一定的作用,直观分析表明,2,4D对愈伤
组织的诱导率影响最大;其次是 NAA,IBA;6BA,
KT对愈伤组织的诱导率影响最小。方差分析结果
表明,不同质量浓度的2,4D对愈伤组织诱导率的
作用有显著性差异,其他4种植物生长物质各水平
间的差异未达到显著水平。统计分析的结果可得最
优水平组为MS+2,4D15mg·L-1+6BA15mg
·L-1+NAA10mg·L-1+IBA15mg·L-1+KT
15mg·L-1。
2.2 不定芽的诱导 培养出的愈伤组织,随后分化
出丛生芽(2~5,7号)(表1,3,图1),少数培养基处
理不经愈伤直接出芽(1号)或只长愈伤不分化出芽
(6,8~16号)。50d后统计直接产生的不定芽数,
实验结果表明:①在叶片诱导愈伤组织的16种组合
中,以3号的植物生长物质配方的不定芽诱导率最
高,达到302%,以8~16号的不定芽诱导率为最
低,为0。②5种植物生长物质对不定芽的诱导均有
一定的作用,直观分析表明,2,4D对不定芽的诱导
率影响最大;其次是 NAA,KT,IBA;6BA对不定芽
的诱导率影响最小。方差分析结果表明,不同浓度
的2,4D对不定芽诱导率的作用有显著性差异,其
他4种植物生长物质各水平间的差异未达到显著水
平。统计分析的结果可得最优水平组为MS+2,4D
02mg·L-1+6BA05mg·L-1+NAA05mg·
L-1+IBA05mg·L-1+KT05mg·L-1。
2.3 生根 不定芽转接入生根培养基后,分别于第
21天统计生根(表4,5,图2)。结果表明:各种培养
基所诱导的根在形态上无差别,均为白色、细长的大
量侧根。在9种组合中,生根率均较高,以6,8号的
生根率最高,达到100%,诱导不定芽生根的最佳激
素组合为1/2MS+IBA04mg·L-1,1/4MS+IBA
02mg·L-1。培养基、IBA和 ZT3种因素对不定
芽的生根均有一定的作用,直观分析表明,ZT对生
根率影响最大;其次是IBA,基本培养基质量浓度的
高低对生根率影响最小。方差分析结果表明,3种
因素的不同水平对生根率的作用无显著性差异。统
计分析的结果可得最优水平组为1/4MS+IBA01
mg·L-1。
2.4 试管苗移栽 移栽成活是试管苗的难关之一,
成功与否取决于根系是否发达,粗壮根多的幼苗成
活率高,而根少细弱的苗则难成活。待根较繁茂,试
管苗长至5~6cm高时,打开瓶口,炼苗2d,取出,
洗去根部残余的培养基,移栽到花钵中,浇足水,每
周用稀释10倍的MS浇1次,待其正常生长。
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表1 苦荬菜愈伤组织及芽诱导正交试验结果
No. 2,4D/mg·L-1 6BA/mg·L-1 NAA/mg·L-1 IBA/mg·L-1 KT/mg·L-1 愈伤组织诱导率/% 不定芽诱导率/%
1 02 02 02 02 02 00 73
2 02 05 05 05 05 75 500
3 02 10 10 10 10 489 302
4 02 15 15 15 15 675 225
5 05 02 05 10 15 450 100
6 05 05 02 15 10 769 00
7 05 10 15 02 05 279 23
8 05 15 10 05 02 1000 00
9 10 02 10 15 05 721 00
10 10 05 15 10 02 368 00
11 10 10 02 05 15 758 00
12 10 15 05 02 10 353 00
13 15 02 15 05 10 905 00
14 15 05 10 02 15 1000 00
15 15 10 05 15 02 727 00
16 15 15 02 10 05 957 00
表2 苦荬菜愈伤组织诱导率方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F P
2,4D 0702 3 5949 <005
6BA 0126 3 1068  
NAA 0331 3 2805  
IBA 0241 3 2042  
KT 0118 3 1000  
误差 0120 3    
表3 苦荬菜不定芽诱导率方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F P
2,4D 0213 3 13313 <005
6BA 0016 3 1000  
NAA 0036 3 2250  
IBA 0024 3 1500  
KT 0025 3 1563  
误差 0020 3    
图1 愈伤组织再生出芽
3 结论与讨论
利用苦荬菜叶片诱导不定芽进行苦荬菜的快速
繁殖是一条快捷的途径。
表4 苦荬菜生根率直观分析
因素 培养基 IBA ZT 生根率/%
1 MS 01 000 875
2 MS 02 005 625
3 MS 04 010 857
4 1/2MS 01 005 875
5 1/2MS 02 010 667
6 1/2MS 04 000 1000
7 1/4MS 01 010 889
8 1/4MS 02 000 1000
9 1/4MS 04 005 750
表5 苦荬菜生根率方差分析
因素 偏差平方和 自由度 FP
培养基 0014 2 0438
IBA 0025 2 0781
ZT 0070 2 2188
误差 0030 2
图2 不定芽诱导生根
激素对植物组织和细胞的增殖、分化;芽和根的诱导
以及形成等起着关键的作用[7]。苦荬菜的愈伤组
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织和不定芽较易于诱导,2,4D在诱导中起着最重
要的作用,另外,组培苗的生根较容易。本试验采用
正交实验分别选取不同的影响因子进行试验,筛选
出苦荬菜愈伤组织、不定芽和生根的最佳培养基。
本研究表明,正交实验设计与数据分析方法对于反
映植物生长物质与丛生芽诱导和生根研究的关系,
选择最佳培养基,都是十分有效的方法,其优越性在
于能大量减少实验次数,从而节省了大量的人力、物
力和财力。可以预计,若能广泛应用正交实验设计
和分析,其工作效率及实验结果的正确性和可靠性
均能得到较大程度的提高。实验中还发现,在MS+
2,4D02mg·L-1+6BA02mg·L-1+NAA02
mg·L-1+IBA02mg·L-1+KT02mg·L-1试验
条件下,少数外植体直接分化不定芽,分化率很低,
若能进一步优化试验条件,提高直接分化不定芽的
分化率,将为苦荬菜快繁和遗传转化体系的建立开
辟一条快捷有效的植株再生途径。
[参考文献]
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社,l977:1300.
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TissuecultureandplantregenerationofIxeridiumsonchifolium
TAOJing1,YANGShihai1,ZHANGMengping2,TIANYixin1
(1.ColegeofChineseMedicinalMaterial,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;
2.JiangduHospitalofTraditionalChineseMedicine,Jiangdu225200,China)
[Abstract] Objective:TostudythecalusinductionandplantregenerationofIxeridiumsonchifoliumMethod:Byusingthe
orthogonalexperimentdesign,themediumforcalusinductionandplantregenerationwasoptimizedResult:Theoptimalmediumfor
calusinductionwasMS+2,4D15mg·L-1+6BA15mg·L-1+NAA10mg·L-1+IBA15mg·L-1+KT15mg·L-1,
theoptimalmediumforinducingadventitiousbudwasMS+2,4D02mg·L-1+6BA05mg·L-1+NAA05mg·L-1+IBA
05mg·L-1+KT05mg·L-1Plantletswererootedon1/4MSmediumsupplementedwithdiferentconcentrationsofIBA,and
highrootingandsurvivalwasachievedwhentheIBAconcentrationwas01mg·L-1Conclusion:Aneficientsystemforplantre
generationofIsonchifoliumwasestablished
[Keywords] Ixeridiumsonchifolium;tissueculture;plantregeneration;orthogonaltest [责任编辑 张宁宁]
《中国中药杂志》近况简介
《中国中药杂志》为中国中文核心期刊,中国科技核心期刊;为“中国科学引文数据库”、“中国学术期刊综合评价数据库”
和“中国科技论文统计源”核心期刊,并且被《中国学术期刊文摘》中、英文版收录。在国际上,被美国医学索引 Medline及《化
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次为3260;影响因子为0.634;基金论文比例0.48。另据中国学术期刊综合引证年度报告(2006):《中国中药杂志》总被引频
次为4676,影响因子为0938,5年影响因子1224,基金论文比047。
《中国中药杂志》荣获第三届国家期刊奖百种重点期刊,国家中医药管理局“以岭杯”第三届全国中医药优秀期刊评选一等
奖,第五届中国百种杰出学术期刊,中国科协精品科技期刊工程项目资助。
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