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Determination of content of saikoside in Bupleurum Chinense from different sources

柱前衍生化法评价不同品种和产地柴胡药材和饮片的质量



全 文 :·研究论文·
柱前衍生化法评价不同品种和产地
柴胡药材和饮片的质量
李媛媛1,秦雪梅1,王玉庆2,岳建英3,郝建平4
(1.山西大学 化学化工学院 药学系,山西 太原 030006;
2.山西农业大学 农学院,山西 太谷 030801;
3.山西省生物研究所,山西 太原 030006;4.山西大学 生命科学与技术学院,山西 太原 030006)
[摘要] 目的:通过对大量柴胡药材和柴胡饮片样品中柴胡总皂苷和柴胡皂苷a,d的含量进行测定评价不同
产地、不同品种柴胡样品的质量优劣。方法:分光光度法测定柴胡总皂苷的含量;柱前衍生化 HPLCUV测定柴胡
皂苷a,d的含量。结果:红柴胡、黑柴胡的皂苷类成分较北柴胡低,竹叶柴胡几乎检不出柴胡皂苷;北柴胡的柴胡
皂苷a的质量分数主要在0100%~0330%,柴胡皂苷d0200%~0400%,柴胡总皂苷100%~200%;粗根无
分支柴胡皂苷成分明显低于细根或粗根多分支柴胡药材。结论:建议北柴胡的柴胡皂苷 a的含量不得低于
0100%,柴胡皂苷d不得低于0200%,柴胡总皂苷不得低于100%;北柴胡的适宜产区为山西中部的太谷,山西
南部的芮城,平陆,万荣,山西东南部的长治,甘肃的陇西,礼县等地;选育北柴胡品种时优先选取根粗且多分支的
品种。
[关键词] 柴胡;柴胡皂苷;分光光度法;高效液相色谱法;含量测定
[中图分类号]R2841 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)03023704
[收稿日期] 20061130
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30570174);山西省自然
科学基金项目(20051085);山西省科技攻关项目(0510772)
[通讯作者] 秦雪梅,Tel:(0351)7011202,Email:qinxm@
sxu.edu.cn
  《中国药典》2005年版一部规定柴胡为伞形科
柴胡属植物北柴胡BupleurumchinenseDC.和狭叶柴
胡B.scozonerifoliumWild.的干燥根,具有解表和
里、疏肝解郁、升举阳气之功效[1]。目前,野生柴胡
药材资源已近枯竭,商品以栽培为主,其中北柴胡种
植面积明显大于红柴胡,以甘肃和山西两省为主要
种植区[2]。
由于各地栽培北柴胡的种源十分混杂,有效成
分含量差异悬殊,商品柴胡饮片多以次充好,因此需
要对各产地柴胡及各地药店购置的商品柴胡的品质
进行评价,为制订柴胡有效成分的含量标准,品种优
选及适宜种植地区的选择提供了科学数据。作者采
用酸化柱前衍生化法,建立了稳定的柴胡皂苷 a,d
含量测定方法,避免了已有的柴胡皂苷 a,d的
HPLCUV以210nm作为检测波长的紫外检测的末
端吸收区中杂质峰干扰和测定方法不稳定的缺点,
并结合已有的比色法测定柴胡总皂苷,对所收集的
大量柴胡药材和柴胡饮片样品进行测定,从单一有
效成分和总成分两方面对柴胡品质进行评价。
1 仪器与试药
1.1 仪器与试剂
紫外可见分光光度计;分析天平;恒温水浴锅;
Waters1525高效液相色谱仪;Waters2487双波长紫
外检测器;Breeze色谱工作站。柴胡皂苷 a对照品
(批号110777200405,中国药品生物制品检定所),
柴胡皂苷 d对照品(批号110778200402,中国药品
生物制品检定所),乙腈(迪马公司),其余试剂均为
分析纯。
1.2 样品
不同产地、来源的柴胡药材和饮片共计57个样
品,由秦雪梅教授购于当地并鉴定,见表1,2。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 供试品溶液的制备 称取各样品粗粉05
g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入 25mL的 2%
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    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 3
February,2008
KOHCH3OH超声30min,放冷,滤过,以2%KOH
CH3OH溶液定容至25mL量瓶中,摇匀,即得。
2.1.2 柴胡皂苷 a对照品溶液的配制 精密称取
柴胡皂苷a174mg,置于10mL棕色量瓶中,用甲
醇稀释至刻度,摇匀。
2.1.3 柴胡皂苷d对照品溶液的配制 精密称取
柴胡皂苷d194mg,置于10mL棕色量瓶中,用甲
醇稀释至刻度,摇匀。
2.2 分光光度法测定柴胡总皂苷
2.2.1 标准曲线的绘制 精密量取 194mg·
mL-1柴胡皂苷 d对照品溶液 25,30,50,75,100,
125,150μL,蒸去溶媒后加1%对二甲氨基苯甲醛
乙醇溶液01mL,蒸干,加85%磷酸4mL,70℃下
加热30min,冷却至室温,以水为空白,以545nm为
检测波长,测定吸光度[3]。以吸光度值为纵坐标,
柴胡皂苷d的质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,得
回归方程Y=0003651X-0039001,r=09996。
2.2.2 样品的测定 精密量取2.1.1项下的供试
品溶液10mL,置蒸发皿中,水浴上蒸干,残渣加正
丁醇饱和的水10mL溶解,置分液漏斗中,用水饱和
的正丁醇提取3次,每次用量分别为20,10,10mL,
合并正丁醇层,置水浴上蒸干,残渣加甲醇溶解,定
容至10mL量瓶中,摇匀。再移取此甲醇溶液05
mL,蒸去溶媒后加1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液
01mL,蒸干,加 85%磷酸 4mL,70℃下加热 30
min,冷却至室温,以水为空白,在545nm处测定吸
光度[3],测定结果见表1,2。
2.3 HPLCUV测定柴胡中柴胡皂苷a,d的含量[4]
2.3.1 色谱条件 色谱柱:HypersilODSC18柱
(46mm×200mm,5μm);柱温为室温;UV检测波
长240,250nm;流动相乙腈水(40∶60);流速 10
mL·min-1。
2.3.2 标准曲线的绘制 精密量取 194mg·
mL-1柴胡皂苷 d对照品溶液10,20,30,40,50,60,
70,80μL,置于5mL量瓶中,加入4%HClCH3OH
溶液1mL,摇匀后静置于室温下反应4h,再加2%
KOHCH3OH溶液 15mL,用甲醇稀释至刻度,摇
匀。分别取20μL上述溶液注入色谱仪,按2.3.1
项下的色谱条件测定峰面积。以峰面积值为纵坐
标,柴胡皂苷 d的质量浓度为横坐标,绘制标准曲
线,得回归程 Y=13705X+35496,R2=09993。
取174mg·mL-1柴胡皂苷a对照品溶液重复上述
   表1 柴胡药材样品中各成分质量分数
No. 采集地(种源)
生长
年限
采集
时间
柴胡
皂苷a
/%
柴胡
皂苷d
/%
柴胡
总皂苷
/%
1 山西平陆(-)a 2 2005 0227 0350 192
2 山西平陆(-)b 2 2005 0347 0443 219
3 山西长治(亳州) 2 2005 0270 0304 156
4 山西长治(万荣) 2 2005 0250 0269 145
5 山西长治(安国) 2 2005 0476 0521 282
6 山西长治(亳州) 2 2005 0202 0284 133
7 山西长治(陵川) 2 2005 0277 0259 125
8 山西陵川(陵川) 2 2005 0204 0336 106
9 山西陵川(-) 3 2003 0197 0271 130
10山西陵川(万荣) 3 2003 0216 0283 134
11山西陵川(万荣) 2 2004 0231 0299 129
12山西方山北武当山(野生) - 2004 0120 0198 111
13山西方山(野生) - 2005 0118 0172 096
14山西方山(野生) - 2004 0135 0200 102
15山西太谷(左权) 2 2004 0202 0162 132
16山西太谷(左权) 2 2005 0360 0489 254
17山西安泽(野生) - 2004 0126 0130 093
18山西灵丘(灵丘) 2 2005 0205 0318 116
19山西浑源(野生) - 2005 0249 0197 156
20山西左权(野生) - 2003 0272 0255 156
21山西左权(左权) 2 2003 0188 0225 126
22山西介休绵山(野生) - 2004 0163 0237 101
23山西新绛(新绛) 2 2005 0083 0183 122
24山西芮城(-) 2 2004 0323 0468 216
25山西万荣(万荣) 3 2003 0155 0369 130
26山西万荣(万荣) 2 2003 0272 0355 158
27山西万荣(野生) - 2003 0268 0301 190
28山西万荣(万荣) 2 2004 0110 0243 117
29山西万荣(万荣) 2 2005 0225 0206 165
30山西万荣(左权) 2 2005 0285 0205 155
31山西万荣(中柴1号) 2 2005 0319 0271 167
32黑龙江明水(-) 2 2004 0208 0230 164
33甘肃陇西首阳(-)a 2 2005 0229 0506 189
34甘肃陇西首阳(-)b 2 2005 0280 0444 146
35甘肃陇西首阳(-)c 2 2005 0303 0318 194
36甘肃陇西马河(-) 2 2003 0325 0361 210
37甘肃礼县 2 2003 0321 0500 168
38甘肃陇西首阳试验园(-) 2 2003 0390 0529 178
39甘肃陇西马河(-)花期采 1 2003 0388 0550 204
40山西方山(野生红柴胡) - 2005 0224 0306 161
41黑龙江明水(明水红柴胡) 2 2004 0042 0042 063
42黑龙江明水(明水红柴胡) 3 2004 0016 0017 062
43山西方山(野生黑柴胡) - 2005 0098 0103 082
44甘肃陇西马河(茎) 2 2003 0013 0026 025
45山西芮城(粗,根多分支) 2 2004 0219 0281 153
46山西芮城(粗,根不分支) 2 2004 0171 0263 124
47山西芮城(细,根多分支) 2 2004 0310 0371 156
48山西芮城(细,根不分支) 2 2004 0322 0444 199
  注:1~39北柴胡;40~42红柴胡;43黑柴胡;44柴胡样品
的地上茎部分;45~48山西芮城柴胡按照根的粗细,分支多少的形
态学分类(参考文献[5]分类)
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表2 柴胡饮片样品中各成分质量分数
No. 购置地点
柴胡
皂苷a
/%
柴胡
皂苷d
/%
柴胡
总皂苷
/%
推测柴胡
类型
49 河北安国药材市场 0037 0088 100 红柴胡
50 陕西西安朱雀药店 0124 0149 088 北柴胡
51 陕西西安莲湖区中医 0148 0175 097 北柴胡
52 陕西商洛致和堂药店 0100 0115 078 北柴胡
53 陕西商洛民生大药房 0286 0287 206 北柴胡
54 山西太原晋济堂药店 0172 0174 121 北柴胡
55 山西太原黄河大药房 0166 0168 110 北柴胡
56 山西太原一心堂大药房 0070 0186 133 黑柴胡
57 四川成都得元堂沙湾店 0008 0016 026 竹叶柴胡
  注:57提供商注明为竹叶柴胡
步骤,回归方程 Y=64364X+16408,R2 =
09995。
2.3.3 精密度试验 分别量取194mg·mL-1柴
胡皂苷d对照品溶液和174mg·mL-1柴胡皂苷 a
对照品溶液各30μL,置于5mL量瓶中,混匀,加入
4%HClCH3OH溶液1mL,摇匀后静置于室温下反
应4h,再加2%KOHCH3OH溶液15mL,用甲醇
稀释至刻度,摇匀。取20μL反应后柴胡皂苷混和
标准溶液按照同样的色谱条件进行 HPLC分析,连
续5次,得到柴胡皂苷 a,d的 RSD分别为099%,
151%,结果表明精密度良好。
2.3.4 稳定性试验 取1号样品05g,制备样品
溶液,于0,2,4,6,8,12h测定峰面积。结果柴胡皂
苷a,d峰面积的 RSD分别为195%和057%。结
果表明样品在12h内测定是稳定的。
2.3.5 重复性试验 精密称取1号样品6份,制备
样品溶液,测定峰面积,计算柴胡皂苷a,d峰面积的
RSD分别为122%,086%。结果表明样品测定符
合技术要求,重复性良好。
2.3.6 回收率试验 精密称取已知含量的样品6
份,分别加入柴胡皂苷a,d对照品溶液,按样品的测
定项下操作,计算回收率,见表3。结果表明样品测
定的回收率良好,符合要求。
2.3.7 样品的测定 精密量取2.1.1项下供试品
溶液1mL,置于5mL量瓶中,加入4%HClCH3OH
溶液1mL,摇匀后静置于室温下反应4h,再加2%
KOHCH3OH溶液 15mL,用甲醇稀释至刻度,摇
匀,即得。临用前过045μm滤膜,作为样品溶液。
取20μL样品溶液注入色谱仪,按照2.3.1项下色
谱条件测定峰面积,计算其含量。结果见表1和表
   表3 柴胡皂苷a,d的加样回收率
成分
取样量
/g
样品中
的量/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
RSD
/%
柴胡皂苷a05012005810046401035 9780 163
0507000588004640105210004  
0503400584005800117710238
0499900580005800116610101  
0500500580006960136610193  
0502300583006960128210050  
0501200652005200118110175 133
0507000659005200117910077  
0503400655006500132110246
0499900650006500132410375  
05005006510078001430 9994  
0502300653007800144410145  
2,对照品、样品HPLC图谱见图1。
图1 对照品柴胡皂苷a,d和不同种类
柴胡药材的HPLC图
A.柴胡皂苷a对照品;B.柴胡皂苷d对照品;C.北柴胡样品;
D.黑柴胡样品;E.红柴胡样品;1柴胡皂苷a;2柴胡皂苷d
  由图 1可见,在北柴胡、红柴胡和黑柴胡的
HPLC图谱上看出三者主要成分的峰数目和保留时
间均不相同,即成分组成有很大区别,因此可以从样
品测定的HPLC图谱上初步判断柴胡的种类。从柴
胡皂苷类成分的含量比较上可以看出,北柴胡的柴
胡总皂苷和柴胡皂苷 a,d的含量一般高于红柴胡、
黑柴胡和竹叶柴胡(2005年采山西方山野生红柴胡
除外),因此,以柴胡皂苷类提取物作为药用时应考
虑使用北柴胡。
另外,由表1中的39个北柴胡样品的测定结果
进行比较可以看出,测定样品中柴胡皂苷 a主要集
中在 0100% ~0330%,柴胡皂苷 d0200% ~
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0400%,柴胡总皂苷100% ~200%,此测定值与
相关文献报道结果一致[68]。
文献报道北柴胡根主要药用成分为柴胡皂苷,
分布于韧皮部及射线,根的韧皮部越发达,相对含量
就越高;而且柴胡皂苷在细根中含量高于主根[5]。
现将山西芮城收集的北柴胡进行分类,构成45~48
号样品,测定结果表明根粗无分支的柴胡的皂苷类
成分含量明显低于根粗且分支多的柴胡,而根细无
分支、根细多分支柴胡与根粗多分支柴胡无明显差
异。
3 结论与讨论
建议北柴胡的柴胡皂苷a的质量分数不得低于
0100%,柴胡皂苷 d不得低于 0200%,柴胡总皂
苷不得低于100%。
由于 40号山西方山柴胡样品经形态学和
HPLC图谱鉴定确为红柴胡,但其皂苷类成分含量
较高,优于当地所产北柴胡,且满足237项下关于
北柴胡皂苷类成分的限量要求,建议推广当地野生
红柴胡驯化种植,取代其余品种。
综合比较北柴胡的柴胡皂苷a,d和柴胡总皂苷
的含量确定其适宜产区为山西中部的太谷,山西南
部的平陆,芮城,万荣,山西东南部的长治;甘肃的陇
西,礼县。柴胡在花期采集的样品虽然有效成分的
含量与正常采收期的样品一致,但此时的产量很低,
从经济效益方面考虑,应该在入冬前的正常采收期
采收最佳。
[参考文献]
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[2] 秦雪梅,王玉庆,岳建英,等.栽培柴胡资源状况分析[J].中药
研究与信息,2005,7(8):30.
[3] 王兰霞,杨玲霞.甘肃省庆阳地区栽培柴胡质量考察[J].中
国中药杂志,1994,19(10):596.
[4] 潘瑞乐,陈迪华,陈建民,等.RPHPLC法测定中柴1号及其他产
地柴胡中柴胡皂苷a,d的含量[J].中南药学,2004,2(4):198.
[5] 岳建英,秦雪梅,王玉庆.北柴胡不同农家栽培类型研究初报
[J].中药材,2005,28(8):650.
[6] 张 岱.不同产地北柴胡中柴胡总皂甙含量比较[J].天津药
学,2001,13(5):60.
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成分相关性研究[J].山西中医学院学报,2007,8(2):44.
DeterminationofcontentofsaikosideinBupleurumChinense
fromdiferentsources
LIYuanyuan1,QINXuemei1,WANGYuqing2,YUEJianying3,HAOJianping4
(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;
2.ColegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China;
3.ShanxiInstituteofbiology,Taiyuan030006,China;
4.SchoolofLifeScienceandTechnology,ShanxiUniversity,Taiyuan03006,China)
[Abstract] Objective:Todeterminethecontentsofsaikosaponina,dandsaikosaponinsinRadixBupleurifromdiferentand
assesstheirquality.Method:SaikosaponinaanddwereusedasthechemicalreferencesubstancetoestablishRPHPLCandvisible
spectrophotometrymethodsfordeterminationofcontentsofsaikosaponina,dandsaikosaponins.Result:ThequalityofB.chinense
wasbeterthanthatofB.scozonerifoliumandBsmishi;Thecontentsofa,saikosaponindandtotalsaikosaponininB.chinensewere
0.100%0.330%,0.200%0.400% and1.00%2.00%,respectively.Conclusion:Itistosuggestthattheminimalcontentsre
quirementsofsaikosaponina,dandsaikosaponinsinB.chinenseshouldbesetat0.100%,0.200% and1.00%,respectively;the
bestsuitableplantingareasareTaiguinthemiddleofShanxiprovince,Ruicheng,PingluandWanronginthesouthofShanxiprov
ince,andLongxi,LixianinGansuprovince.
[Keywords] Bupleurumchinense;saikosaponin;visiblspectrophotometrymethods;HPLC
[责任编辑 张宁宁]
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ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 3
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