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Identification of compounds in fruits of Psoralea corylifolia by HPLC-MS

高效液相色谱-电喷雾-质谱法分析补骨脂中化学成分



全 文 :高效液相色谱电喷雾质谱法分析补骨脂中
化学成分
刘亚男,王跃飞,韩立峰,潘桂湘,王虹
(天津中医药大学 中医药研究院 现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心,天津 300193)
[摘要] 目的:建立补骨脂药材中化学成分的高效液相色谱电喷雾质谱分析方法。方法:采用DiamonsilTMC18(46mm×
250mm,5μm)色谱柱;流动相005%甲酸水溶液乙腈,梯度洗脱;流速1mL·min-1;柱温30℃;DAD扫描范围190~400
nm;检测波长246nm。Finnigan电喷雾离子阱多级质谱仪;正离子检测模式;ESI喷雾电压4500V;鞘气(N2)流速60a.u.;辅
助气(N2)流速20a.u.;毛细管温度350℃;毛细管电压19V,扫描范围m/z90~800。结果:补骨脂中化学成分获得了较好的
分离和检测,共鉴定出2个香豆素苷,3个香豆素,8个黄酮和1个单萜酚类成分。结论:该方法灵敏度高、分离度好,适用于补
骨脂药材中化学成分的快速定性鉴定。
[关键词] 补骨脂;香豆素;黄酮;HPLCMS
[收稿日期] 20090606
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30701093);高等学校博士学
科点专项科研基金项目(20070063003)
[通信作者] 王跃飞,Tel:(022)23051114,Email:wangyuefei_
2006@hotmail.com
  补骨脂为豆科植物补骨脂 Psoraleacorylifolia
L.的干燥成熟果实,性温,味辛,具有补肾助阳、固
精缩尿、温脾止泻、纳气平喘之功效[1]。主要用于
治疗肾虚阳痿、腰膝冷痛;遗尿、尿频;脾肾阳虚,五
更泄泻;肾不纳气,虚寒咳嗽;外用治白癜风。国内
外学者对补骨脂的化学成分及药理作用进行了广泛
的研究,化学成分主要为香豆素类、黄酮类、单萜酚
类、苯并呋喃类等[29];主要药理活性有扩张血管、抗
菌、抗炎,抗氧化等[1012],近年来有文献报道香豆素
和异黄酮类具有植物雌激素样活性[1314]。本研究
利用HPLC/DADESIMS联用技术,对补骨脂中的
化学成分进行定性分析,共分析鉴定出14种主要化
学成分,包括2个香豆素苷、3个香豆素、8个黄酮、1
个单萜酚,为补骨脂药材的化学成分鉴定和质量控
制提供了有力的证据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪,包括在
线真空脱气机、高压四元梯度泵、自动进样器、柱温
箱、二极管阵列检测器(DAD)(美国 Agilent公司);
FinniganLCQDecaXPplus质谱仪(美国ThermoFinni
gan公司)。
1.2 试药 补骨脂药材于 2008年采自河南,经
天津中医药大学李天祥教授鉴定为豆科植物补骨
脂 P.corylifolia的干燥成熟果实。乙腈和甲醇为
色谱纯(美国 Merck公司);实验用水为超纯水(实
验室自制);其他试剂均为分析纯;补骨脂苷 、异
补骨脂苷、补骨脂定、异补骨脂查耳酮、补骨脂二
氢黄酮、新补骨脂异黄酮、corylifolA、补骨脂酚均
为本实验室制备(经 HPLC分析纯度大于98%);
对照品补骨脂素(批号110739200511)、异补骨脂
素(批号110738200511)购自中国药品生物制品
检定所。
2 方法
2.1 样品溶液的制备 取干燥的补骨脂药材粉末
(过100目筛)约03g,精密称定,置50mL具塞锥
形瓶中,加甲醇 25mL,密塞,称重,超声处理 30
min,补足失重,经045μm微孔滤膜过滤,为供试
品溶液。
2.2 对照品溶液的制备 分别称取补骨脂苷、异补
骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补
骨脂二氢黄酮、补骨脂定、异补骨脂查耳酮、corylifol
A、补骨脂酚对照品适量于10mL量瓶中,用甲醇溶
解,定容,进行HPLC和MS分析。
2.3 液相色谱实验条件[15] DiamonsilTM C18色谱
柱(46mm×250mm,5μm);流动相乙腈(A)
005%甲酸水溶液(B),梯度洗脱程序,0~25min
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17%~25% A,25~55min25% ~45% A,55~85
min45%~80% A,85~95min,80% A保持不变;
进样量10μL;流速10mL·min-1;柱后1∶3分流;
DVD扫描范围190~400nm;检测波长246nm。
2.4 质谱实验条件 正离子检测模式;ESI喷雾电
压4500V;鞘气(N2)流速60a.u.;辅助气(N2)流
速20a.u.;毛细管温度350℃;毛细管电压19V;
扫描范围m/z90~800。
3 结果与讨论
按照上述色谱条件,取补骨脂样品溶液进样
分析,分别得到补骨脂样品和对照品的紫外色谱
图(图1)、补骨脂样品的质谱总离子流色谱图(图
2)、正离子检测方式所得质谱信息(表1)。由图1
可见补骨脂样品的 HPLC图主含16个色谱峰,各
色谱峰之间实现了较好的分离。在此液相色谱条
件下,对各主要色谱峰按相对保留时间排序,通过
比较补骨脂提取物和对照品的色谱保留时间
(tR),紫外吸收光谱及 ESI(+)MS数据,确定色谱
峰1~6,10,11,13和16分别为补骨脂苷、异补骨
脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补
骨脂二氢黄酮、补骨脂定、异补骨脂查耳酮、coryli
folA、补骨脂酚。
1.补骨脂苷;2.异补骨脂苷;3.补骨脂素;4.异补骨脂素;5.新补骨脂异黄酮;6.补骨脂二氢黄酮;
10.补骨脂定;11.异补骨脂查耳酮;13.corylifolA;16.补骨脂酚。
图1 补骨脂样品(A)和对照品(B)的HPLC图
图2 补骨脂样品的HPLCESI(+)MS总离子流图
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表1 补骨脂样品中各主要成分的ESI(+)MS数据
No.[M+H]+ 质谱碎片信息 化合物
11) 367  MS2[205]2):187[M+H-Glu-H2O]+(100),163[M+H-Glu-CH2=C=O]+(40);MS3[187]:159
[187-CO]+(34),143[187-CO2]+(100),131[187-CO-CO]+(9),115[187-CO2-CO]+(39)
补骨脂苷
21) 367  MS2[205]2):187[M+H-Glu-H2O]+(100),163[M+H-Glu-CH2=C=O]+(18);MS3[187]:159
[187-CO]+(88),143[187-CO2]+(100),131[187-CO-CO]+(54),115[187-CO2-CO]+(15)
异补骨脂苷
31) 187  MS2[187]:159[M+H-CO]+(31),143[M+H-CO2]+(100),131[M+H-CO-CO]+(30),115[M+
H-CO2-CO]+(42);MS3[143]:115[143-CO]+(100)
补骨脂素
41) 187  MS2[187]:159[M+H-CO]+(37),143[M+H-CO2]+(100),131[M+H-CO-CO]+(60),115[M+
H-CO2-CO]+(6);MS3[143]:115[143-CO]+(100)
异补骨脂素
51) 323  MS2[323]:267[M+H-C4H8]+(100),255[M+H-C5H8]+(13);MS3[267]:239[267-CO]+(100),
211[267-CO-CO]+(10),183[267-CO-CO-CO]+(10),137(6)
新补骨脂异
黄酮
61) 325  MS2[325]:269[M+H-C4H8]+(100),257[M+H-C5H8]+(7),227[M+H-C4H8-CH2=C=O]+
(3),205[M+H-(phyroxystyrene)]+(6),167[M+H-C4H8-H2O-CH2=C=O-CH2=C=O]+(28),
149[M+H-C4H8-(phyroxystyrene)]+(4),147[M+H-C4H8-(phyroxbenzoyl)]+(7),121[phyroxy
styrene+H]+(2);MS3[269]:251[269-H2O]+(4),227[269-CH2=C=O]+(3),167[269-H2O-
CH2=C=O-CH2=C=O]+(100),149[269-(phyroxystyrene)]+(9),121[phyroxystyrene+1]+(3)
补骨脂二氢
黄酮
7 353 MS2[353]:297(100),285(32) 未知化合物1
8 321  MS2[321]:303[M+H-H2O]+(100),293[M+H-CO]+(22),279[M+H-CH2=C=O]+(32),265
[M+H-CO-CO]+(14),211[M+H-CO-CO-CO2]+(31),137(81)
补骨脂异黄

9 323  MS2[323]:305[M+H-H2O]+(2),281[M+H-CH2=C=O]+(3),253[M+H-CH2=C=O-CO]+
(2),221[M+H-H2O-CH2=C=O-CH2=C=O]+(100),203[M+H-(phyroxystyrene)]+(24),175
[M+H-(phyroxystyrene)-CO]+(4),147[M+H-(phyroxystyrene)-CO-CO]+(20);MS3[221]:203
[221-H2O]+(19)
补骨脂色烯

101) 337  MS2[337]:309[M+H-CO]+(28),281[M+H-CO-CO]+(100),253[M+H-CO-CO-CO]+(5),
209[M+H-CO-CO-CO-CO2]+(3);MS3[281]:253[281-CO]+(28),239[281-CH2=C=O]+(5),
213[281-C5H8]+(18),209281-CO-CO2]+(100),181[281-CO2-C4H8]+(21),153[281-CO2-C4
H8-CO]+(1)
补骨脂定
111) 325  MS2[325]:269[M+H-C4H8]+(100),205[M+H-(phyroxystyrene)]+(20),167[M+H-C4H8-
H2O-CH2=C=O-CH2=C=O]+(6),149[M+H-C4H8-(phyroxystyrene)]+(6);MS3[269]:251
[269-H2O]+(2),227[269-CH2=C=O]+(3),167[269-H2O-CH2=C=O-CH2=C=O]+(79),149
[269-(phyroxystyrene)]+(100),121[phyroxystyrene+H]+(3)
异补骨脂查
尔酮
12 339  MS2[339]:283[M+H-C4H8]+(100),271[M+H-C5H8]+(92),269[M+H-C5H10]+(24),219
[M+H-(phyroxystyrene)]+(13),177[M+H-(phyroxystyrene)-CH2=C=O]+(7),147[M+H-(p
hyroxystyrene)-CH2=C=O-HCHO]+(16);MS3[283]:265[283-H2O]+(14),255[283-CO]+(7),223
[283-H2O-CH2=C=O]+(3),189[283-hydroxybenzene]+(100),181[283-H2O-CH2=C=O-CH2=
C=O]+(5),161[283-hydroxybenzene-CO]+(7)
补骨脂二氢
黄酮甲醚
131) 391  MS2[391]:321[M+H-C5H10]+(3),267[M+H-C9H16]+(100);AMS3[267]:239[267-CO]+
(100),211[267-CO-CO]+(15),183[267-CO-CO-CO]+(5),137(6)
corylifol
14 339  MS2[339]:283[M+H-C4H8]+(100),271[M+H-C5H8]+(80),269[M+H-C5H10]+(24),219
[M+H-(phyroxystyrene)]+(16),177[M+H-(phyroxystyrene)-CH2=C=O]+(6),147[M+H-(p
hyroxystyrene)-CH2=C=O-HCHO]+(12);MS3[283]:265[283-H2O]+(22),255[283-CO]+(7),223
[283-H2O-CH2=C=O]+(2),189[283-hydroxybenzene]+(100),181[283-H2O-CH2=C=O-CH2=
C=O]+(9),161[283-hydroxybenzene-CO]+(10)
15 389  MS2[389]:347(9),333(100),321(53),309(37),307(33),293(16),281(20),267(14),239(2),137
(3);MS3[333]:315(28),291(5),290(18),255(100),223(21),183(1),137(28)
未知化合物2
161) 257 MS[257]+(100) 补骨脂酚
  注:1)与对照品进行对照,2)[M+H-glucose]+离子。
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  根据补骨脂样品的质谱总离子流色谱图给出的
碎片信息及相关文献[1618],对色谱图中的8,9,12,
14号色谱峰进行了初步归属。
其中峰8的准分子离子峰为m/z321[M+H]+,
二级质谱显示主要碎片离子为303[M+H-H2O]
+,
293[M+H-CO]+,279[M+H-CH2=C=O]
+与文
献报道补骨脂异黄酮的主要碎片离子一致,故推测
为补骨脂异黄酮。
峰 9在 ESI(+)-MS谱中的[M+H]+的
m/z323,二级谱中丰度较大的离子为221[M+H-
H2O-2CH2=C=O]
+,203[M+H-(phyroxysty
rene)]+与文献报道补骨脂色烯素主要碎片离子一
致,故推测为补骨脂色烯素。
峰12的准分子离子峰为m/z339[M+H]+,二
级质谱显示主要碎片离子为283[M+H-C4H8]
+,
271[M+H-C5H8]
+,269[M+H-C5H10]
+,219
[M+H-(phyroxystyrene)]+,三级质谱主要碎片
离子为 265[283-H2O]
+,255[283-CO]+,223
[283-H2O-CH2=C=O]
+,189[283-hydroxy
benzene]+,主要碎片离子283[M+H-C4H8]
+说
明此化合物含有异戊烯基,根据相对分子质量和碎
片离子推测此化合物比峰6补骨脂二氢黄酮多了一
个甲基,因此推测此化合物为补骨脂二氢黄酮甲醚。
峰14的准分子离子峰为m/z339[M+H]+,二
级质谱显示主要碎片离子为283[M+H-C4H8]
+,
271[M+H-C5H8]
+,269[M+H-C5H10]
+,219
[M+H-(phyroxystyrene)]+,177[M+H-(p-
hyroxystyrene)-CH2=C=O]
+,147[M+H-(phy
roxystyrene)-CH2=C=O-HCHO]
+,三级质谱主
要碎片离子为265[283-H2O]
+,255[283-CO]+
223[283-H2O-CH2 =C=O]
+,189[283-
hydroxybenzene]+,由质谱信息可知峰14与峰12相
对分子质量和碎片离子相同,但保留时间不同,互为
同分异构体,故根据文献推测该成分为补骨脂查
尔酮。
峰7和峰15由于缺乏更多的信息和相关文献
参考,无法推测其结构。
本实验采用HPLC/DADESIMS,根据色谱峰的
保留时间,紫外光谱信息及主要离子及碎片离子的
质谱信息,对补骨脂药材中的2个香豆素苷,3个香
豆素,8个黄酮和1个单萜酚类化合物进行了定性
鉴定,建立了快速、灵敏的补骨脂药材的化学成分定
性分析方法,为补骨脂药材的深入研究奠定了基础。
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IdentificationofcompoundsinfruitsofPsoraleacorylifoliabyHPLCMS
LIUYa′nan,WANGYuefei,HANLifeng,PANGuixiang,WANGHong
(EngineeringResearchCenterofModernChineseMedicineDiscoveryandPreparationTechniqueTraditionalChineseMedicine
ResearchCentreofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China)
[Abstract] Objective:ToidentifythecompoundsinfruitsofPsoraleacorylifoliabyhighperformanceliquidchromatography
massspectrometry.Method:Thechromatographicseparationwascariedoutat30℃ onaDiamonsilTM C18column(46mm×250
mm,5μm)elutedinthegradientprogram.Themobilephaseconsistedofacetonitrile(A)andwatercontaining005% formicacid
(B).Thedetectionwavelengthwasat246nmandtheonlineUVspectrawasrecordedintherangeof190400nm.Themassspectra
wereobtainedbyFinniganLCQDecaXPplusiontrapmassspectrometerinthepositiveionmodewithionsprayvoltage45kV,sheath
gas(N2),60arbitraryunits,auxiliarygas(N2),20arbitraryunits;capilarytemperature,350℃,capilaryvoltage19V,tubelens
ofsetvoltage25V,massrangerecorded,m/z90800.Result:Twocoumaringlycosides,threecoumarins,eightflavonoidsandone
meroterpenewereidentifiedbyHPLCMSmethod.Conclusion:Themethodissimpleandrapidfortheidentificationandqualitycon
trolforthefruitsofP.corylifolia.
[Keywords] Psoraleacorylifolia;coumarins;flavonoids;HPLCMS
[责任编辑 王亚君]
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《中国中药杂志》荣获第三届国家期刊奖百种重点期刊。荣获国家中医药管理局“以岭杯”第三届全国中医药优秀期刊评
选一等奖;荣获第五届中国百种重点学术期刊;获得中国科协精品科技期刊工程项目B类资助。
《中国中药杂志》为半月刊,128~144页,2010年定价每期3000元,全年24期定价为72000元。国内刊号112272/R,
国际刊号11015302。
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第34卷第22期
2009年11月
                           
Vol.34,Issue 22
 November,2009