全 文 ：射光，可促进黄酮类化合物的积累，而后期降解作
用减缓［８］。除环境因素外，遗传因素也可能是造成
夏枯草黄酮含量差异显著的主要原因，对此可从分
子生物学水平进一步研究。
２００５年版药典规定夏枯草以果穗入药，本实验
结果表明，叶片中黄酮含量远高于果穗中黄酮含量，
若对夏枯草中黄酮进行开发利用，可以考虑采收一
定成熟度的叶片，并可进一步探讨不同部位、不同生
长时期叶片中总黄酮含量的变化，以确定最佳采收
期和采收叶片部位。
［参考文献］
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ＳｔｕｄｙｏｎｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｉｎｖａｒｉｏｕｓｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＰｒｕｎｅｌａｖｕｌｇａｒｉｓ
ＬＩＡＯＬｉ，ＧＵＯＱｉａｏｓｈｅｎｇ，ＬＩＵＬｉ，ＬＩＵＭｉｎ
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎａｌＭａｔｅｒｉａｌｓ，ＮａｎｊｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＰｒｕｎｅｌａｖｕｌｇａｒｉｓ．ｆｒｏｍｄｉｆｅｒｅｎｔｐｏｐ
ｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄ（ＲＳＭ）．Ｔｈｅａｍｏｕｎｔｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓｕｓｉｎｇ３５％ ｅｔｈａｎｏｌａｔ２５ｔｉｍｅｓｏｆｓａｗｐｌｅｖｏｌｕｍｅ，
ｒｅｆｌｕｘｉｎｇａｔ８７℃ ｆｏｒ３５ｈ．Ｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗａｓ２１６％１０２９％ ｉｎＰ．ｖｕｌｇａｒｉｓ．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ
ｉｎｌｅａｆｗｈｉｌｅｔｈａｔｉｎｒｏｏｔｗａｓｔｈｅｌｏｗｅｓｔ．Ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｉｎｓｐｉｋｅａｆｔｅｒｒｅｍｏｖｅｄｓｅｅｄｓｗａｓ２７６％ ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｎｅｒｅ
ｓｅｒｖｅｄｓｅｅｄｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅＲＳＭｗａｓｆｅａｓｉｂｌｅｆｏｒｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｎｄｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｓｈｏｗｅｄａｓｉｇｎｉｔｉｃａｎｔ
ｒｅｇｉｏｎａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｐａｔｅｒｎｉｎｕａｒｉｏｕｓｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＰ．ｖｕｌｇａｒｉｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｐｒｕｎｅｌａｖｕｌｇａｒｉｓ；ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ；ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄ；ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
［责任编辑 王亚君］
［收稿日期］ ２００７０８１６
［基金项目］ 国家重点基础研究发展计划（２００６ＣＢ５０４７００）；国家高新技术研究发展计划（２００７ＡＡ０２Ｚ１０４）
［通讯作者］ 黄璐琦，Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１２９５５，Ｅｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｌｕｑｉ＠２６３．ｎｅｔ
丹参毛状根化学成分稳定性研究
吕冬梅１，袁 媛１，张 东１，黄璐琦１，梁日欣１，邱德有２
（１．中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００；２．中国林业科学院，北京 １０００９１）
［摘要］ 目的：研究丹参毛状根的化学物质稳定性，为进一步探索丹参毛状根作为原料药的可行性提供研究
基础。方法：ＰＣＲ扩增１０批丹参毛状根的ｒｏｌＡ基因，ＨＰＬＣ指纹图谱分析１０批丹参毛状根的化学成分稳定性。结
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果：ＰＣＲ结果表明，外源基因ｒｏｌＡ在１０批样品的基因组 ＤＮＡ中均可以检测到；通过对丹参毛状根的指纹图谱研
究，１０批毛状根的相似度均在０９７０以上。结论：不同批次丹参毛状根样品间化学成分的差异不显著。
［关键词］ 丹参毛状根；ＰＣＲ；化学稳定性；ＨＰＬＣ
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０６０６５３０３
丹参Ｓａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｈｉｚａ始载于《神农本草经》列
为上品，具有活血化瘀、通经止痛的功能，是临床常
用的中药。由于丹参有效成分在原植物根中含量
低、生长周期长，加之近年来产地环境污染等原因，
在短时间内大量繁殖有效成分含量高且无污染的绿
色丹参原料药成为很有意义的一项工作。自２０世
纪９０年代，张荫麟［１］，胡之璧［２］，黄炼栋［３］等研究
人员开始利用丹参毛状根生产活性成分。目前丹参
毛状根大规模培养研究在我国已取得重要的成果，
邱德有等［４］利用球状气升式反应器进行了丹参毛
状根培养的初级放大试验，为今后丹参毛状根的工
业化生产奠定了基础。本研究在 ＰＣＲ扩增 ｒｏｌＡ基
因，证明１０批丹参毛状根遗传稳定的基础上，利用
高效液相色谱指纹图谱技术对１０个批次的丹参毛
状根的化学成分的稳定性进行了分析，为进一步探
索丹参毛状根作为原料药的可行性提供研究基础。
１ 材料
由发 根 农 杆 菌 菌 株 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏ
ｇｅｎｅｓ１５８３４诱导的丹参叶片形成的毛状根（由中国
林业科学院邱德有教授提供）。继代于无激素的６，
７Ｖ固体培养基上，６～８周继代１次，每继代１次为
１个批次。
ＡＢＩ９７００ＰＣＲ扩增仪，ＤＮＡｍａｒｋｅｒ、Ｔａｑ酶、
ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自 ＴａｋａＲａ公司，引物由上
海生物工程公司合成。
ＷａｔｅｒｓＡｌｉａｎｃｅ高效液相色谱仪，Ｗａｔｅｒｓ２９９６
二极管阵列检测器；对照品二氢丹参酮（批号０８６８
２００１０３），隐丹参酮（批号 ０８５２９９０２），二氢丹参酮
Ⅰ（批号 ０８６７２００２０５），丹参酮ⅡＡ（批号 １１０７６６
２００４１６），丹酚酸 Ｂ（批号１１１５６２２００５０４）均购自中
国药品生物制品检定所，色谱甲醇（天津四友生物
医学技术有限公司），色谱乙腈（Ｆｉｓｈｅｒ公司），其余
试剂为分析纯，高纯水为本所自制。
２ 方法与结果
２．１ ＰＣＲ检测
用ＣＴＡＢ法［５］提取毛状根的总 ＤＮＡ，ＣＴＡＢ提
取缓冲液组成：２％ ＣＴＡＢ，１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ８０），２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ（ｐＨ８０），２５ｍｏｌ·
Ｌ－１ＮａＣｌ，１２０℃高压灭菌２０ｍｉｎ。ＰＣＲ检测引物：
ｒｏｌＡ１：５′ＡＧＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡ３′
ｒｏｌＡ２：５′ＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＴＣＧＡＡＧＡＣ３′
２５μＬ反应体系：１８０μＬ灭菌双蒸水，２５μＬ
１０×Ｂｕｆｅｒ（Ｍｇ２＋ Ｐｌｕｓ），２μＬｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１），Ｐｒｉｍｅｒ各０５μＬ（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１），０５
μＬＴａｑ酶（５Ｕ·μＬ－１），１μＬ模板 ＤＮＡ（２５～２５０
ｎｇ）。反应条件为：９４℃变性３０ｓ，６３℃退火１ｍｉｎ，
７２℃延伸 １ｍｉｎ，３５个循环后，７２℃保温 ７ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物在１０％的琼脂糖凝胶上电泳，在ＳＹＮＧＥ
ＮＥ型凝胶成像系统下观察，拍照（图１），结果表明
在所有的批次中均可以检测到５１９ｂｐ的特异 ＤＮＡ
片段，在阴性对照中检测不到此片段。
图１ 丹参毛状根ｒｏｌＡ基因片段的ＰＣＲ检测
Ｍ．２０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１～１０．１０个批次的丹参毛状根；
１１．丹参组培苗根组织（阴性对照）
将目标片段用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收，回收
产物送北京三博生物技术公司测序。利用 ＤＮＡ
ＭＡＮ软件对测序结果进行分析，结果表明丹参毛状
根ｒｏｌＡ序列与 ＧｅｎｅＢａｎｋ登录序列（Ｘ１２５７９）［６］的
同源性为１００％，由此可以说明１０个批次的丹参毛
状根样品中都含有的ｒｏｌＡ基因。
２．２ 化学指纹图谱研究
２．２．１ 色谱条件［７］ ＺｏｂａｘＥｘｔｅｎｄＣ１８（４６ｍｍ×
２５０ｍｍ，５μｍ）色谱柱；柱温：２０℃；流速０８ｍＬ·
ｍｉｎ－１；流动相为乙腈００２６％磷酸水溶液，梯度洗
脱；检测波长２８０ｎｍ，进样体积１０μＬ。
２．２．２ 溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取
丹酚酸Ｂ对照品适量，置于５ｍＬ量瓶中，用７５％甲
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醇溶解并定容至刻度，配制成浓度已知的对照品储
备液；精密称取二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹
参酮ⅡＡ对照品适量，置于５ｍＬ量瓶中，用乙腈溶
解并定容至刻度，配制成浓度已知的对照品储备液。
供试品溶液的制备：精密称取毛状根样品粉末
０１５ｇ，精密加入７５％甲醇２５ｍＬ，称定质量，加热
回流１ｈ，取出，放冷，再称定质量，用 ７５％甲醇补
重，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。
２．２．３ 精密度试验 取丹参毛状根按２．２．２项供
试品溶液制备方法制备，在２．２．１项色谱条件下，连
续进样６次，记录指纹图谱，选取７个共有峰，其中
１个作为参照峰，结果表明各色谱峰相对峰面积和
相对保留时间的 ＲＳＤ（％）分别为０１６／０５２，１／１，
００５／０７４，００６／０９０，００６／０９０，００６／０９６，
００６／０５４，小于１％，表明仪器精密度良好。
２．２．４ 稳定性试验 取丹参毛状根２．２．２项供试
品溶液制备方法制备，在２．２．１项色谱条件下，分别
在０、４、６、８、１２和２４ｈ进样，记录指纹图谱，结果表
明各色谱峰相对峰面积和相对保留时间的 ＲＳＤ％
分别 为 ００９／１４０，１／１，００２／０５４，００２／０６７，
００２／２７４，００２／０７６，００２／０５４，分别小于 １％和
３％，表明样品溶液在２４ｈ内稳定。
２．２．５ 重复性试验 取同一批６份丹参毛状根样
品，按２．２．２项供试品溶液制备方法制备，在２．２．１
项色谱条件下，连续进样，记录指纹图谱，结果表明
７个色谱峰相对峰面积和相对保留时间的ＲＳＤ（％）
分别 为 ００１／０５２，１／１，００９／０７４，０１１／０９０，
００９／０９０，００９／０９６，０１１／０５４，小于１％，重复性
良好。
２．２．６ 丹参毛状根指纹图谱测定 精密称取１０个
批次的丹参毛状根样品，按２．２．２项供试品溶液制
备方法制备，在２．２．１项色谱条件下，记录指纹图
谱，见图 ２，３，记录共有峰的相对保留时间及峰面
积。建立１０个批次的丹参毛状根对照品指纹图谱，
相对保留时间的平均值和ＲＳＤ（％）值分别为０９３／
００５，１／０，１９３／０４３，２１６／０６８，２２４／０１９，２３５／
０５１，２５０／０２５。相对峰面积的平均值和 ＲＳＤ
（％）分别为 ０２８／０３６，１／０，００６／０７４，００３／
０６６，００７／０５６，００５／０５６，００６／０５７，利用《中药
色谱指纹图谱相似度评价系统》２００４Ａ处理，相似度
均高于０９７０。
３ 讨论
图２ ２８０ｎｍ波长条件下，丹参毛状根指纹图谱
２丹酚酸Ｂ；３二氢丹参酮；４隐丹参；５丹参酮Ⅰ；７丹参酮
ⅡＡ；１，６未确认
图３ １０个批次丹参毛状根指纹图谱
控制毛状根形成的是发根农杆菌 Ｒｉ质粒 Ｔ
ＤＮＡ上的ｒｏｌ基因，ＴＤＮＡ上分布有４个ｒｏｌ基因位
点，分别命名为 ｒｏｌＡ基因，ｒｏｌＢ基因，ｒｏｌＣ基因和
ｒｏｌＤ基因［８］。本实验从随机培养的丹参毛状根中
任选１０批，ＰＣＲ结果表明，外源基因 ｒｏｌＡ在１０批
样品的基因组ＤＮＡ中均可以检测到，说明不同批次
的丹参毛状根遗传较稳定。在此基础上，对其化学
成分的稳定性进行了分析。通过对丹参毛状根的指
纹图谱研究，并利用中药色谱指纹图谱相似度评价
系统２００４Ａ版软件进行相似度分析，从计算结果可
以看出，１０批毛状根的相似度均在０９７０以上，符
合国家药典委员会对“成品指纹图谱相似度计算结
果在０９～１０（或以９０～１００表示）作为符合要求”
的范围，说明不同批次丹参毛状根样品间化学成分
组成的差异不显著。下一步将利用这些丹参毛状根
样品进行相关的药效学、毒理学研究，从而为开发利
用丹参毛状根提供新的依据。
［参考文献］
［１］ 张荫麟，宋经元，吕桂兰，等．丹参毛状根培养的建立和丹参酮
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ＬＶＤｏｎｇｍｅｉ１，ＹＵＡＮＹｕａｎ１，ＺＨＡＮＧＤｏｎｇ，ＨＵＡＮＧＬｕｑｉ１，ＬＩＡＮＧＲｉｘｉｎ１，ＱＩＵＤｅｙｏｕ２
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎａＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９１，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｒｈｉｚａｈａｉｒｙｒｏｏｔ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅｒｏｌＡｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｙＰＣＲｉｎＤＮＡａｎｄｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｔｉｔｕｅｎｔｖａｒｉａｎｃｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＨＰＬＣ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｒｏｌＡｇｅｎｅｗａｓｆｏｕｎｄｉｎａｌｔｈｅ１０ｂａｔｃｈｅｓ
ｏｆｔｈｅｃｕｌｆｕｒｅｄｈａｉｒｙｒｏｏｔ．Ｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｏｆｔｈｅ１０ｂａｔｃｈｅｓａｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ０９５．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：
Ｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｉｎ１０ｈａｉｒｙｒｏｏｔｓａｍｐｌｅｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｓａｌｖｉａｍｉｌｔｉｒｈｉｚａｈａｉｒｙｒｏｏｔ；ｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ；ＨＰＬＣ
［责任编辑 王亚君］
［收稿日期］ ２００７０３０１
［基金项目］ 北京市属市管高等学校人才强教计划资助项目；首都医科大学科研基金（２００６ＺＲ０９）
［通讯作者］ 王桥，Ｔｅｌ：（０１０）８３９１１５２４，Ｅｍａｉｌ：ｑｉａｏｗ＠ｃｃｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
４４种中药中１，２，３，４，６五Ｏ倍酰Ｄ葡萄糖
含量的测定
王维聪，王 潮，宋学英，赵文华，王 桥
（首都医科大学 化学生物学与药学院，北京 １０００６９）
［摘要］ 目的：采用高效液相色谱测定４４种中药中１，２，３，４，６五Ｏ倍酰Ｄ葡萄糖（１，２，３，４，６ｐｅｎｔａＯｇａｌ
ｌｏｙｌＤｇｌｕｃｏｓｅ，ＰＧＧ）的含量。方法：以乙醇水溶液（５０∶５０）为提取剂，在５０～６０℃的温度下超声１ｈ，从中药中提
取ＰＧＧ；采用ＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）色谱柱，流动相为乙腈２５％醋酸水溶液（１８∶８２），紫外检测
波长２８０ｎｍ，流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１。结果：ＰＧＧ在１～１５０μｇ·ｍＬ－１呈良好的线性关系（ｒ＝０９９９４）。五倍子、牡
丹皮、赤芍、白芍等１７种中药中均含有ＰＧＧ，且在五倍子、牡丹皮、赤芍、白芍中 ＰＧＧ含量较高。结论：本实验用简
单快捷的方法考察了４４种中药中ＰＧＧ的含量，并准确测定了五倍子等１７种含ＰＧＧ中药中ＰＧＧ的含量，为从中药
中分离、纯化ＰＧＧ以及中药的开发利用提供了实验基础。
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第３３卷第６期
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