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Research on callus  induction and cell suspension culture of Changium smyrnioides

明党参愈伤组织诱导及其细胞悬浮培养的研究


目的:建立明党参愈伤组织的诱导及其细胞悬浮培养的技术体系。方法:采用正交试验法研究不同植物激素对明党参叶柄、根和叶片愈伤组织诱导的影响,以及明党参不同外植体细胞的悬浮培养。结果:叶柄最易诱导出愈伤组织,其次是根和叶片,4种植物激素对明党参根和叶柄愈伤组织的诱导都具有极显著的效果,其中诱导叶柄愈伤组织形成的最佳激素组合为0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 6-BA,培养14 d左右,诱导率达到100%。此外,明党参叶柄细胞培养至21 d时,细胞量和多糖均达到最大值,分别1 090.28,36.85 mg·L-1。结论:明党参叶柄是愈伤组织诱导的最佳外植体和细胞悬浮培养体系的最佳细胞来源。

Objective: To establish the technical systems of callus induction and the cell suspension culture of Changium smyrnioides. Method:Effects of different plant growth regulators on leaf, petiole and root callus induction were studied by orthogonal design, and cell suspension cultures from different explants were carried out. Result:Petiole was optimal to form callus, followed by the root and leaf. Four kinds of plant growth regulators showed a significant effect on the petiole and root callus induction. The optimal plant growth regulators for petiole callus induction was 0.5  mg·L-1 NAA,0.5 mg·L-1 2,4-D,0.1  mg·L-1 KT and 0.5  mg·L-1 6-BA; And induction rate reached to 100% when petiole was cultured for 14 days. In addition, when cell from petiole callus was cultured for 21 days, the maximum yields of cell biomass and polysaccharide were 1 090.28 mg·L-1 and 36.85 mg·L-1, respectively. Conclusion:Petiole was taken as the optimal explant for inducing callus and the optimal cell origin for the cell suspension culture of C. smyrnioides.


全 文 :明党参愈伤组织诱导及其细胞悬浮培养的研究
江 曙,段金廒,陈建伟,陶金华,付坤华
(南京中医药大学,江苏 南京 210046)
[摘要] 目的:建立明党参愈伤组织的诱导及其细胞悬浮培养的技术体系。方法:采用正交试验法研究不同植物激素对
明党参叶柄、根和叶片愈伤组织诱导的影响,以及明党参不同外植体细胞的悬浮培养。结果:叶柄最易诱导出愈伤组织,其次
是根和叶片,4种植物激素对明党参根和叶柄愈伤组织的诱导都具有极显著的效果,其中诱导叶柄愈伤组织形成的最佳激素
组合为05mg·L-1NAA+05mg·L-12,4D+01mg·L-1KT+05mg·L-16BA,培养14d左右,诱导率达到100%。此
外,明党参叶柄细胞培养至21d时,细胞量和多糖均达到最大值,分别109028,3685mg·L-1。结论:明党参叶柄是愈伤组
织诱导的最佳外植体和细胞悬浮培养体系的最佳细胞来源。
[关键词] 明党参;愈伤组织;细胞悬浮培养
[收稿日期] 20080805
[基金项目] 江苏省自然科学基金项目(BK2007241)
[通信作者] 江曙,博士,副教授。主要从事中药生物技术研究。
Tel:(025)85811516,Email:jiangshu1970@yahoo.com.cn
  明党参ChangiumsmyrnioidesWolf隶属于伞形
科明党参属,是我国特有的单种属多年生草本植物,
以根入药,具有益气、生津、润肤、祛痰之功效,并有
滋补强壮作用[1]。现代临床和药理研究表明其含
有多种活性成分,如多糖、γ氨基丁酸、天门冬酰胺、
甘露醇、挥发油等,其中明党参多糖具有增强机体免
疫功能、抗肿瘤等多种生物活性[2]。近年来,由于
人为过度采挖以及明党参种子萌发率低等自身生物
学特性,其野生资源破坏严重,种群呈现明显衰退倾
向,1984年明党参已被国家列为珍稀濒危植物[3]。
本研究通过建立明党参愈伤组织的诱导及其细胞悬
浮培养的技术体系,以期为明党参野生资源保护、育
种及其细胞生长、分化、代谢等方面的理论与应用研
究奠定基础。
1 材料
1.1 外植体
明党参采自江苏南京市紫金山,经南京中医药
大学药学院陈建伟教授鉴定为伞形科植物明党参
C.smyrnioides的新鲜植株。
1.2 培养基
愈伤组织诱导培养基是在MS培养基中添加不
同浓度的NAA,6BA,KT,2,4D;细胞悬浮培养基除
了不添加琼脂外,其他成分组成和愈伤组织诱导培
养基相同。
1.3 仪器与设备
电子天平(JY2002,上海精密仪器厂),高压蒸汽
灭菌器(MLS3750,日本),单人水平垂直两用净化工
作台(SWCJ1FB,苏州净化设备有限公司),紫外可
见分光光度计(752型,上海光学仪器有限公司)。
2 方法
2.1 愈伤组织诱导
选取生长健壮的明党参幼嫩叶片、叶柄以及根
尖部位,用自来水反复冲洗干净后,依次用75%乙
醇消毒30s,01%升汞消毒8min,无菌水冲洗5次
后,切成3~5mm小段,接种于含有不同植物激素
的MS培养基中,25℃进行培养,按正交试验设计进
行,每项试验平行做2组,每组接种100个外植体。
愈伤组织诱导率 =形成愈伤组织的外植体数/接种
的外植体数×100%。
2.2 细胞悬浮培养体系的建立
将愈伤组织继代培养2~3次后,选取生长旺
盛,质地疏松的愈伤组织约 20g,接种于装有 300
mLMS液体培养基的1L三角瓶中,25℃,120r·
min-1悬浮振荡培养。5d继代1次,连续继代2~3
次,将细胞悬浮培养物用80目镍网过滤,滤液分装
后继续培养,作为起始悬浮培养液。每隔3d取3
瓶细胞培养液进行离心(5000r·min-1,10min)
后,于60℃烘干,测定细胞干重。
2.3 细胞多糖的测定
蒽酮硫酸比色法[4],在每份明党参细胞干燥物
中加入10mL蒸馏水,超声提取2次,每次30min,
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过滤。Sevag法除蛋白,在提取液中加入等量的氯
仿正丁醇为 5∶1的混合溶液,振荡混匀,离心
(5000r·min-1,15min)。取上清液,加入4倍量无
水乙醇,4℃冰箱放置过夜,离心(5000r·min-1,
15min),沉淀物60℃干燥后,加入2mL蒸馏水,即
得明党参细胞粗多糖溶液,测定时稀释。
分别取628mg·L-1的标准葡萄糖溶液0,l,2,
3,4,5,6mL,用蒸馏水定容至50mL后,各取1mL
于具塞试管中,再分别加入4mL02%蒽酮硫酸试
剂(冰水浴中),然后沸水浴10min,取出冷却至室
温放置10min后,在620nm处测定标准葡萄糖溶
液的吸光度。葡萄糖在 2512~15072mg·L-1,
质量浓度(X,mg·L-1)与吸光度(Y)之间存在良
好的线性关系,Y=00295X+00547,r=09992。
取1mL明党参细胞粗多糖的稀释液,加人 4mL
02%蒽酮硫酸试剂(冰水浴中),其他操作步骤同
标准曲线制作,在620nm处测吸光度,计算明党参
细胞多糖的含量。
2.4 正交试验设计
对明党参不同外植体愈伤组织的诱导试验均设
计成4因素3水平(表1)。
表1 植物激素对明党参外植体愈伤组织诱导的
正交试验因素水平 mg·L-1 
水平

NAA

2,4D

KT

6BA
1 05 05 01 05
2 10 10 02 10
3 15 15 03 15
3 结果与分析
3.1 植物激素对明党参不同外植体愈伤组织诱导
的影响
3.1.1 叶柄愈伤组织 明党参叶柄在含有不同激
素的MS培养基上培养6d左右就在切口处可见半
透明的愈伤组织,随着培养时间的延长颜色逐渐变
为淡黄绿色。经培养14d后,进行愈伤组织诱导率
的统计,根据极差R的大小,其影响顺序为 C>D>
A>B。直观分析可知,明党参叶柄愈伤组织诱导的
最佳激素配比是C1B1D1A1,即在 MS培养基中添加
05mg·L-1NAA,05mg·L-12,4D,01mg·
L-1KT,05mg·L-16BA,诱导率达到 100%(表
2)。通过方差分析可知,4种植物激素对叶柄愈伤
组织均产生极显著的诱导效果(P<001)。
表2 植物激素对明党参根、叶柄、叶片愈伤组织诱导率 % 
试验号

试验1 试验2 平均值
叶柄
试验1 试验2 平均值
叶片
试验1 试验2 平均值
1 10000 10000 10000 4000 4500 4250 625 937 781
2 9562 8620 9091 2903 3251 3077 1250 1198 1224
3 6364 6970 6667 3684 3936 3810 2000 2068 2034
4 9167 9091 9129 7000 7500 7250 2000 2210 2105
5 8333 7693 8013 2857 2633 2745 1333 1275 1304
6 5000 4546 4773 5238 5120 5179 3529 3295 3412
7 7273 7001 7137 4138 4196 4167 8889 8949 8919
8 3333 2501 2917 6000 5600 5800 7838 7400 7619
9 9862 9168 9515 5217 3873 4545 8438 9062 8750
3.1.2 根愈伤组织 明党参根在含有不同植物激
素的MS培养基上培养7d左右,产生半透明的愈伤
组织,随着培养时间的延长颜色逐渐变深。经培养
14d后,进行愈伤组织诱导率的统计,根据极差 R
的大小,其影响顺序为 D>C>B>A。直观分析可
知,明党参根愈伤组织诱导的最佳激素配比是 A2B1
C2D3,即在 MS培养基中添加 10mg·L
-1NAA,
05mg·L-12,4D,02mg·L-1KT,15mg·L-1
6BA,诱导率达到725%(表2)。通过方差分析可
知,4种植物激素对叶柄愈伤组织也都产生极显著
的诱导效果(P<001)。
3.1.3 叶片愈伤组织 明党参叶片在含有不同激
素的MS培养基上培养15d左右,才在切口处可见
半透明的愈伤组织。经培养21d后,进行愈伤组织
诱导率的统计,根据极差 R的大小,其影响顺序为
A>B>D>C。直观分析可知,明党参愈伤组织诱导
的最佳激素配比是A3B1C3D2,即在 MS培养基中添
加15mg·L-1NAA,05mg·L-12,4D,03mg·
L-1KT,10mg·L-16BA,诱导率达到8919%(表
2)。通过方差分析可知,NAA,2,4D,6BA对明党
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参叶片愈伤组织诱导的影响极显著(P<001),而
KT为不显著因素。
3.2 植物激素对明党参不同外植体愈伤组织生长
的影响
按正交试验结果,根据不同的外植体来源,选取
最佳的植物激素组合,考察植物激素对愈伤组织生
长的影响,培养30d后进行统计分析,结果表明来
自于叶柄的愈伤组织生长最好,质地疏松,是进行细
胞悬浮培养的最佳材料(表3)。
表3 植物激素对明党参不同外植体愈伤组织生长的影响
外植体
鲜重
/g/个
干重
/g/个
颜色 质地 长势
根  0231 0025 黄白 较疏松,瘤状  
叶柄 0612 0032 黄绿 疏松,颗粒状  
叶片 0158 0016 黄白 较疏松,颗粒状 
  注:+表示生长的强弱,+越多表示生长越旺盛。
3.3 明党参细胞悬浮培养体系的建立
根据明党参的入药部位以及本次正交试验结
果,分别进行了来自于明党参根和叶柄的细胞悬浮
培养的研究。结果表明,明党参叶柄和根部细胞生
长均呈现 S形生长曲线(图1,2)。其中,明党参叶
柄细胞培养至 21d时,细胞量和多糖均达到最大
值,分别是109028,3685mg·L-1;明党参根部细
胞培养至15d时,细胞量和多糖达到最大值,分别
是101389,2013mg·L-1。来自于根部细胞的悬
浮培养生长较快,多糖含量也在较短的时间内达到
最大值,这可能和初始接种的细胞密度相关,初始接
种量适当加大有利于细胞在较短的时间内适应培养
环境而快速增殖,但不利于多糖的积累。虽然叶柄
细胞悬浮培养起始细胞密度相对较低,延迟了细胞
量达到最大值的时间,但细胞量比根部细胞悬浮培
养量提高了753%,尤其是明党参多糖的积累量比
后者提高了8306%。因此,今后通过进一步优化
明党参叶柄细胞悬浮培养条件,将会缩短悬浮培养
时间,进一步提高多糖等活性成分的含量。
4 讨论
4.1 不同植物激素对明党参愈伤组织的诱导
利用明党参的根、叶柄、叶片均可诱导出愈伤组
织,且三者都有较高的诱导率,随着培养时间的延
长,最高可达100%,每种外植体产生的愈伤组织的
颜色、质地没有显著的区别,但在长势上表现出一定
的差异,来自于叶柄的愈伤组织长势最好。总体来
  
图1 明党参叶柄细胞生长及其多糖的动态变化
图2 明党参根部细胞生长及其多糖的动态变化
看,明党参各种外植体均容易诱导出愈伤组织,这对
明党参野生资源的保护利用具有重要意义。
4.2 细胞悬浮培养
愈伤组织的外观形态和生理状态直接影响到后
续建立细胞悬浮系的质量,愈伤组织越是疏松,细胞
的分散程度也就越大。因此,挑选颗粒细小、疏松易
碎、外观湿润鲜艳的白色或淡黄色愈伤组织有利于
诱导悬浮细胞系[5]。通过对明党参根和叶柄愈伤组
织的筛选、继代后,进行细胞悬浮培养,从细胞生长曲
线可看出利用明党参的愈伤组织进行细胞悬浮培养
是可行的,这也为明党参细胞悬浮培养的进一步研究
奠定了基础。此外,在明党参细胞悬浮培养过程中,
主要考察了多糖随培养时间的累积变化情况,对于明
党参中挥发油、甘露醇等其他活性成分的动态变化还
有待于进一步研究。因此,通过建立明党参细胞悬浮
培养体系,进行明党参细胞生长、分化及其活性成分
的生产将是一种有益的探索,尤其是对于缓解珍稀濒
危药物植物资源的短缺矛盾具有重要的理论意义和
应用价值,有助于实现中药资源的可持续发展。
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Researchoncalusinductionandcelsuspensioncultureof
Changiumsmyrnioides
JIANGShu,DUANJin′ao,CHENJianwei,TAOJinhua,FUKunhua
(NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China)
[Abstract] Objective:ToestablishthetechnicalsystemsofcalusinductionandthecelsuspensioncultureofChangiumsmyr
nioides.Method:Efectsofdiferentplantgrowthregulatorsonleaf,petioleandrootcalusinductionwerestudiedbyorthogonalde
sign,andcelsuspensionculturesfromdiferentexplantswerecariedout.Result:Petiolewasoptimaltoformcalus,folowedbythe
rootandleaf.Fourkindsofplantgrowthregulatorsshowedasignificantefectonthepetioleandrootcalusinduction.Theoptimal
plantgrowthregulatorsforpetiolecalusinductionwas0.5mg·L-1NAA,0.5mg·L-12,4D,0.1mg·L-1KTand0.5mg·L-16
BA;Andinductionratereachedto100% whenpetiolewasculturedfor14days.Inaddition,whencelfrompetiolecaluswascul
turedfor21days,themaximumyieldsofcelbiomassandpolysaccharidewere1090.28mg·L-1and36.85mg·L-1,respectively.
Conclusion:PetiolewastakenastheoptimalexplantforinducingcalusandtheoptimalceloriginforthecelsuspensioncultureofC.
smyrnioides.
[Keywords] Changiumsmyrnioides;calus;celsuspensionculture
[责任编辑 吕冬梅]
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