全 文 ：明党参愈伤组织诱导及其细胞悬浮培养的研究
江　曙，段金廒，陈建伟，陶金华，付坤华
（南京中医药大学，江苏 南京 ２１００４６）
［摘要］　目的：建立明党参愈伤组织的诱导及其细胞悬浮培养的技术体系。方法：采用正交试验法研究不同植物激素对
明党参叶柄、根和叶片愈伤组织诱导的影响，以及明党参不同外植体细胞的悬浮培养。结果：叶柄最易诱导出愈伤组织，其次
是根和叶片，４种植物激素对明党参根和叶柄愈伤组织的诱导都具有极显著的效果，其中诱导叶柄愈伤组织形成的最佳激素
组合为０５ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ＋０５ｍｇ·Ｌ－１２，４Ｄ＋０１ｍｇ·Ｌ－１ＫＴ＋０５ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ，培养１４ｄ左右，诱导率达到１００％。此
外，明党参叶柄细胞培养至２１ｄ时，细胞量和多糖均达到最大值，分别１０９０２８，３６８５ｍｇ·Ｌ－１。结论：明党参叶柄是愈伤组
织诱导的最佳外植体和细胞悬浮培养体系的最佳细胞来源。
［关键词］　明党参；愈伤组织；细胞悬浮培养
［收稿日期］　２００８０８０５
［基金项目］　江苏省自然科学基金项目（ＢＫ２００７２４１）
［通信作者］　江曙，博士，副教授。主要从事中药生物技术研究。
Ｔｅｌ：（０２５）８５８１１５１６，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｓｈｕ１９７０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
　　明党参ＣｈａｎｇｉｕｍｓｍｙｒｎｉｏｉｄｅｓＷｏｌｆ隶属于伞形
科明党参属，是我国特有的单种属多年生草本植物，
以根入药，具有益气、生津、润肤、祛痰之功效，并有
滋补强壮作用［１］。现代临床和药理研究表明其含
有多种活性成分，如多糖、γ氨基丁酸、天门冬酰胺、
甘露醇、挥发油等，其中明党参多糖具有增强机体免
疫功能、抗肿瘤等多种生物活性［２］。近年来，由于
人为过度采挖以及明党参种子萌发率低等自身生物
学特性，其野生资源破坏严重，种群呈现明显衰退倾
向，１９８４年明党参已被国家列为珍稀濒危植物［３］。
本研究通过建立明党参愈伤组织的诱导及其细胞悬
浮培养的技术体系，以期为明党参野生资源保护、育
种及其细胞生长、分化、代谢等方面的理论与应用研
究奠定基础。
１　材料
１．１　外植体
明党参采自江苏南京市紫金山，经南京中医药
大学药学院陈建伟教授鉴定为伞形科植物明党参
Ｃ．ｓｍｙｒｎｉｏｉｄｅｓ的新鲜植株。
１．２　培养基
愈伤组织诱导培养基是在ＭＳ培养基中添加不
同浓度的ＮＡＡ，６ＢＡ，ＫＴ，２，４Ｄ；细胞悬浮培养基除
了不添加琼脂外，其他成分组成和愈伤组织诱导培
养基相同。
１．３　仪器与设备
电子天平（ＪＹ２００２，上海精密仪器厂），高压蒸汽
灭菌器（ＭＬＳ３７５０，日本），单人水平垂直两用净化工
作台（ＳＷＣＪ１ＦＢ，苏州净化设备有限公司），紫外可
见分光光度计（７５２型，上海光学仪器有限公司）。
２　方法
２．１　愈伤组织诱导
选取生长健壮的明党参幼嫩叶片、叶柄以及根
尖部位，用自来水反复冲洗干净后，依次用７５％乙
醇消毒３０ｓ，０１％升汞消毒８ｍｉｎ，无菌水冲洗５次
后，切成３～５ｍｍ小段，接种于含有不同植物激素
的ＭＳ培养基中，２５℃进行培养，按正交试验设计进
行，每项试验平行做２组，每组接种１００个外植体。
愈伤组织诱导率 ＝形成愈伤组织的外植体数／接种
的外植体数×１００％。
２．２　细胞悬浮培养体系的建立
将愈伤组织继代培养２～３次后，选取生长旺
盛，质地疏松的愈伤组织约 ２０ｇ，接种于装有 ３００
ｍＬＭＳ液体培养基的１Ｌ三角瓶中，２５℃，１２０ｒ·
ｍｉｎ－１悬浮振荡培养。５ｄ继代１次，连续继代２～３
次，将细胞悬浮培养物用８０目镍网过滤，滤液分装
后继续培养，作为起始悬浮培养液。每隔３ｄ取３
瓶细胞培养液进行离心（５０００ｒ·ｍｉｎ－１，１０ｍｉｎ）
后，于６０℃烘干，测定细胞干重。
２．３　细胞多糖的测定
蒽酮硫酸比色法［４］，在每份明党参细胞干燥物
中加入１０ｍＬ蒸馏水，超声提取２次，每次３０ｍｉｎ，
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过滤。Ｓｅｖａｇ法除蛋白，在提取液中加入等量的氯
仿正丁醇为 ５∶１的混合溶液，振荡混匀，离心
（５０００ｒ·ｍｉｎ－１，１５ｍｉｎ）。取上清液，加入４倍量无
水乙醇，４℃冰箱放置过夜，离心（５０００ｒ·ｍｉｎ－１，
１５ｍｉｎ），沉淀物６０℃干燥后，加入２ｍＬ蒸馏水，即
得明党参细胞粗多糖溶液，测定时稀释。
分别取６２８ｍｇ·Ｌ－１的标准葡萄糖溶液０，ｌ，２，
３，４，５，６ｍＬ，用蒸馏水定容至５０ｍＬ后，各取１ｍＬ
于具塞试管中，再分别加入４ｍＬ０２％蒽酮硫酸试
剂（冰水浴中），然后沸水浴１０ｍｉｎ，取出冷却至室
温放置１０ｍｉｎ后，在６２０ｎｍ处测定标准葡萄糖溶
液的吸光度。葡萄糖在 ２５１２～１５０７２ｍｇ·Ｌ－１，
质量浓度（Ｘ，ｍｇ·Ｌ－１）与吸光度（Ｙ）之间存在良
好的线性关系，Ｙ＝００２９５Ｘ＋００５４７，ｒ＝０９９９２。
取１ｍＬ明党参细胞粗多糖的稀释液，加人 ４ｍＬ
０２％蒽酮硫酸试剂（冰水浴中），其他操作步骤同
标准曲线制作，在６２０ｎｍ处测吸光度，计算明党参
细胞多糖的含量。
２．４　正交试验设计
对明党参不同外植体愈伤组织的诱导试验均设
计成４因素３水平（表１）。
表１　植物激素对明党参外植体愈伤组织诱导的
正交试验因素水平 ｍｇ·Ｌ－１　
水平
Ａ
ＮＡＡ
Ｂ
２，４Ｄ
Ｃ
ＫＴ
Ｄ
６ＢＡ
１ ０５ ０５ ０１ ０５
２ １０ １０ ０２ １０
３ １５ １５ ０３ １５
３　结果与分析
３．１　植物激素对明党参不同外植体愈伤组织诱导
的影响
３．１．１　叶柄愈伤组织　明党参叶柄在含有不同激
素的ＭＳ培养基上培养６ｄ左右就在切口处可见半
透明的愈伤组织，随着培养时间的延长颜色逐渐变
为淡黄绿色。经培养１４ｄ后，进行愈伤组织诱导率
的统计，根据极差Ｒ的大小，其影响顺序为 Ｃ＞Ｄ＞
Ａ＞Ｂ。直观分析可知，明党参叶柄愈伤组织诱导的
最佳激素配比是Ｃ１Ｂ１Ｄ１Ａ１，即在 ＭＳ培养基中添加
０５ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ，０５ｍｇ·Ｌ－１２，４Ｄ，０１ｍｇ·
Ｌ－１ＫＴ，０５ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ，诱导率达到 １００％（表
２）。通过方差分析可知，４种植物激素对叶柄愈伤
组织均产生极显著的诱导效果（Ｐ＜００１）。
表２　植物激素对明党参根、叶柄、叶片愈伤组织诱导率 ％　
试验号
根
试验１ 试验２ 平均值
叶柄
试验１ 试验２ 平均值
叶片
试验１ 试验２ 平均值
１ １００００ １００００ １００００ ４０００ ４５００ ４２５０ ６２５ ９３７ ７８１
２ ９５６２ ８６２０ ９０９１ ２９０３ ３２５１ ３０７７ １２５０ １１９８ １２２４
３ ６３６４ ６９７０ ６６６７ ３６８４ ３９３６ ３８１０ ２０００ ２０６８ ２０３４
４ ９１６７ ９０９１ ９１２９ ７０００ ７５００ ７２５０ ２０００ ２２１０ ２１０５
５ ８３３３ ７６９３ ８０１３ ２８５７ ２６３３ ２７４５ １３３３ １２７５ １３０４
６ ５０００ ４５４６ ４７７３ ５２３８ ５１２０ ５１７９ ３５２９ ３２９５ ３４１２
７ ７２７３ ７００１ ７１３７ ４１３８ ４１９６ ４１６７ ８８８９ ８９４９ ８９１９
８ ３３３３ ２５０１ ２９１７ ６０００ ５６００ ５８００ ７８３８ ７４００ ７６１９
９ ９８６２ ９１６８ ９５１５ ５２１７ ３８７３ ４５４５ ８４３８ ９０６２ ８７５０
３．１．２　根愈伤组织　明党参根在含有不同植物激
素的ＭＳ培养基上培养７ｄ左右，产生半透明的愈伤
组织，随着培养时间的延长颜色逐渐变深。经培养
１４ｄ后，进行愈伤组织诱导率的统计，根据极差 Ｒ
的大小，其影响顺序为 Ｄ＞Ｃ＞Ｂ＞Ａ。直观分析可
知，明党参根愈伤组织诱导的最佳激素配比是 Ａ２Ｂ１
Ｃ２Ｄ３，即在 ＭＳ培养基中添加 １０ｍｇ·Ｌ
－１ＮＡＡ，
０５ｍｇ·Ｌ－１２，４Ｄ，０２ｍｇ·Ｌ－１ＫＴ，１５ｍｇ·Ｌ－１
６ＢＡ，诱导率达到７２５％（表２）。通过方差分析可
知，４种植物激素对叶柄愈伤组织也都产生极显著
的诱导效果（Ｐ＜００１）。
３．１．３　叶片愈伤组织　明党参叶片在含有不同激
素的ＭＳ培养基上培养１５ｄ左右，才在切口处可见
半透明的愈伤组织。经培养２１ｄ后，进行愈伤组织
诱导率的统计，根据极差 Ｒ的大小，其影响顺序为
Ａ＞Ｂ＞Ｄ＞Ｃ。直观分析可知，明党参愈伤组织诱导
的最佳激素配比是Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ２，即在 ＭＳ培养基中添
加１５ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ，０５ｍｇ·Ｌ－１２，４Ｄ，０３ｍｇ·
Ｌ－１ＫＴ，１０ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ，诱导率达到８９１９％（表
２）。通过方差分析可知，ＮＡＡ，２，４Ｄ，６ＢＡ对明党
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参叶片愈伤组织诱导的影响极显著（Ｐ＜００１），而
ＫＴ为不显著因素。
３．２　植物激素对明党参不同外植体愈伤组织生长
的影响
按正交试验结果，根据不同的外植体来源，选取
最佳的植物激素组合，考察植物激素对愈伤组织生
长的影响，培养３０ｄ后进行统计分析，结果表明来
自于叶柄的愈伤组织生长最好，质地疏松，是进行细
胞悬浮培养的最佳材料（表３）。
表３　植物激素对明党参不同外植体愈伤组织生长的影响
外植体
鲜重
／ｇ／个
干重
／ｇ／个
颜色 质地 长势
根　 ０２３１ ００２５ 黄白 较疏松，瘤状　 
叶柄 ０６１２ ００３２ 黄绿 疏松，颗粒状　 
叶片 ０１５８ ００１６ 黄白 较疏松，颗粒状 
　　注：＋表示生长的强弱，＋越多表示生长越旺盛。
３．３　明党参细胞悬浮培养体系的建立
根据明党参的入药部位以及本次正交试验结
果，分别进行了来自于明党参根和叶柄的细胞悬浮
培养的研究。结果表明，明党参叶柄和根部细胞生
长均呈现 Ｓ形生长曲线（图１，２）。其中，明党参叶
柄细胞培养至 ２１ｄ时，细胞量和多糖均达到最大
值，分别是１０９０２８，３６８５ｍｇ·Ｌ－１；明党参根部细
胞培养至１５ｄ时，细胞量和多糖达到最大值，分别
是１０１３８９，２０１３ｍｇ·Ｌ－１。来自于根部细胞的悬
浮培养生长较快，多糖含量也在较短的时间内达到
最大值，这可能和初始接种的细胞密度相关，初始接
种量适当加大有利于细胞在较短的时间内适应培养
环境而快速增殖，但不利于多糖的积累。虽然叶柄
细胞悬浮培养起始细胞密度相对较低，延迟了细胞
量达到最大值的时间，但细胞量比根部细胞悬浮培
养量提高了７５３％，尤其是明党参多糖的积累量比
后者提高了８３０６％。因此，今后通过进一步优化
明党参叶柄细胞悬浮培养条件，将会缩短悬浮培养
时间，进一步提高多糖等活性成分的含量。
４　讨论
４．１　不同植物激素对明党参愈伤组织的诱导
利用明党参的根、叶柄、叶片均可诱导出愈伤组
织，且三者都有较高的诱导率，随着培养时间的延
长，最高可达１００％，每种外植体产生的愈伤组织的
颜色、质地没有显著的区别，但在长势上表现出一定
的差异，来自于叶柄的愈伤组织长势最好。总体来
　　
图１　明党参叶柄细胞生长及其多糖的动态变化
图２　明党参根部细胞生长及其多糖的动态变化
看，明党参各种外植体均容易诱导出愈伤组织，这对
明党参野生资源的保护利用具有重要意义。
４．２　细胞悬浮培养
愈伤组织的外观形态和生理状态直接影响到后
续建立细胞悬浮系的质量，愈伤组织越是疏松，细胞
的分散程度也就越大。因此，挑选颗粒细小、疏松易
碎、外观湿润鲜艳的白色或淡黄色愈伤组织有利于
诱导悬浮细胞系［５］。通过对明党参根和叶柄愈伤组
织的筛选、继代后，进行细胞悬浮培养，从细胞生长曲
线可看出利用明党参的愈伤组织进行细胞悬浮培养
是可行的，这也为明党参细胞悬浮培养的进一步研究
奠定了基础。此外，在明党参细胞悬浮培养过程中，
主要考察了多糖随培养时间的累积变化情况，对于明
党参中挥发油、甘露醇等其他活性成分的动态变化还
有待于进一步研究。因此，通过建立明党参细胞悬浮
培养体系，进行明党参细胞生长、分化及其活性成分
的生产将是一种有益的探索，尤其是对于缓解珍稀濒
危药物植物资源的短缺矛盾具有重要的理论意义和
应用价值，有助于实现中药资源的可持续发展。
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出版社，２００６：２１．
Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆ
Ｃｈａｎｇｉｕｍｓｍｙｒｎｉｏｉｄｅｓ
ＪＩＡＮＧＳｈｕ，ＤＵＡＮＪｉｎ′ａｏ，ＣＨＥＮＪｉａｎｗｅｉ，ＴＡＯＪｉｎｈｕａ，ＦＵＫｕｎｈｕａ
（ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００４６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｔｅｃｈｎｉｃａｌｓｙｓｔｅｍｓｏｆｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｃｅｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆＣｈａｎｇｉｕｍｓｍｙｒ
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ｓｉｇｎ，ａｎｄｃｅｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｆｒｏｍｄｉｆｅｒｅｎｔｅｘｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｃａｒｉｅｄｏｕｔ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｐｅｔｉｏｌｅｗａｓｏｐｔｉｍａｌｔｏｆｏｒｍｃａｌｕｓ，ｆｏｌｏｗｅｄｂｙｔｈｅ
ｒｏｏｔａｎｄｌｅａｆ．Ｆｏｕｒｋｉｎｄｓｏｆｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｓｈｏｗｅｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｅｃｔｏｎｔｈｅｐｅｔｉｏｌｅａｎｄｒｏｏｔｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌ
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ＢＡ；Ａｎｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｒａｔｅｒｅａｃｈｅｄｔｏ１００％ ｗｈｅｎｐｅｔｉｏｌｅｗａｓｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ１４ｄａｙｓ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｗｈｅｎｃｅｌｆｒｏｍｐｅｔｉｏｌｅｃａｌｕｓｗａｓｃｕｌ
ｔｕｒｅｄｆｏｒ２１ｄａｙｓ，ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｙｉｅｌｄｓｏｆｃｅｌｂｉｏｍａｓｓａｎｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗｅｒｅ１０９０．２８ｍｇ·Ｌ－１ａｎｄ３６．８５ｍｇ·Ｌ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＰｅｔｉｏｌｅｗａｓｔａｋｅｎａｓｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｐｌａｎｔｆｏｒｉｎｄｕｃｉｎｇｃａｌｕｓａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｅｌｏｒｉｇｉｎｆｏｒｔｈｅｃｅｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆＣ．
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