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Vol. 34，Issue 1
January，2009
第 34卷第 1期
2009年 1月
大黄抑制鼠疫耶尔森菌分子机制的初步研究
白群华 1，贾 燕 1，代兴碧 1，肖 虹 1，王应雄 1，杨瑞馥 2，邱景富 1*
（1.重庆医科大学 公共卫生学院，重庆 400016；2 .军事医学科学院 微生物流行病研究所 病原微生物
生物安全国家重点实验室，北京 100071）
[摘要] 目的：探索大黄抑制鼠疫耶尔森菌作用的分子机制。方法：液体稀释法测定大黄水提物对鼠疫菌生长抑制作用
的最小浓度（MIC）。应用鼠疫耶尔森菌全基因组芯片研究大黄作用鼠疫菌的表达谱。选择10倍MIC做为大黄抑制鼠疫菌作
用浓度，作用时间分别选择30，60 min。提取并纯化鼠疫耶尔森菌总RNA；逆转录合成cDNA；用Cy3，Cy5染料标记后，与
鼠疫耶尔森菌全基因组芯片杂交；通过芯片扫描仪获得表达谱分析结果。应用SAM软件对结果进行分析；应用RT-PCR对芯
片结果进行验证。结果：得到了大黄不同作用时间鼠疫菌的表达谱。获得了大黄不同作用时间鼠疫菌的相同差异表达基因。
结论：大黄抑制鼠疫菌的主要分子机制在于影响细菌核糖体蛋白质合成相关基因与细胞膜相关基因的表达。
[关键词] 鼠疫耶尔森菌；大黄；抗菌药；基因芯片；分子机制
14大黄是临床常用中药，性寒、味苦，具有攻
积导滞、泻火、凉血、活血祛瘀、泻下、抗菌、抗
肿瘤、保肝利胆退黄等功效，其抗菌作用尤为突出，
经常用来进行抗菌治疗，在预防和控制细菌性感染
方面发挥了积极作用。在当今抗生素耐药性广泛出
现的情况下，对大黄的抗菌分子机制做进一步研究
具有重要意义。现代分子生物技术的发展为传统中
药的研究提供了先进的技术手段。基因芯片技术发
展为进行大黄的分子药理学研究提供了一个平台。
基因芯片具有大规模、高通量和高平行等特点，利
用基因芯片可以进行药物作用机制研究以及药物
作用靶点筛选[1-2]。本研究应用鼠疫菌全基因组芯片
对大黄不同时间作用鼠疫菌进行了表达谱研究，旨
在从鼠疫菌全基因组水平探索大黄抑制鼠疫菌的
分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
鼠疫菌 201 菌株为布氏田鼠疫源地菌株
Yersinia pestis，分离自锡林郭勒高原布氏田鼠鼠疫
疫源地（军事医学科学院微生物流行病研究所提
供），该菌株对人体无感染性，对小鼠具有高度毒
力。鼠疫菌全基因组基因芯片由军事医学科学院微

[收稿日期] 2008-06-10
[基金项目] 重庆医科大学科技启动基金（2008）
[通信作者] 邱景富，Tel：(023)68485912，E-mail：jfqiu@126.com
生物流行病研究所提供。MasterPureTM RNA提取试
剂盒（Epicentre，Inc. 20061215）。扫描仪 ScanArray
4100 (Axon Instruments，Inc.)，处理软件为 GenePix
Pro 4.1(Axon Instruments，Inc.)。大黄水提物购自西
安中鑫生物技术有限公司，批号 040625，为药用大
黄干燥根及根茎的水提取物，经 HPLC分析大黄素
纯度 98%。
1.2 大黄作用鼠疫菌最小抑菌浓度（MIC）的测定
采用液体稀释法测定大黄作用于鼠疫菌的
MIC。准备系列含有 1 mL TMH液体培养基的试管，
将大黄水煎液配制到相应质量浓度后加入含有培
养基的试管中，以倍比稀释法逐管稀释大黄，最终
各管大黄的质量浓度分别为 100，50，25，12.5，
6.25 g·L-1，在每个试管中加入 1.5×108 CFU·mL-1的
鼠疫菌 10 μL，试验设空白及重复对照，28 ℃培养
24 h后，分别转种普通平板培养基，观察细菌在平
板培养基的生长现象，无细菌生长的试管浓度为大
黄作用鼠疫菌的MIC。
1.3 鼠疫菌基因芯片表达谱实验
1.3.1 分组 选择大黄作用鼠疫菌组作为实验组，
等量生理盐水相同条件作为对照组，进行基因芯片
表达谱试验。大黄作用鼠疫菌的浓度为 10倍MIC，
时间为 30，60 min。实验分组应用系列重复设置，
包括 2 个生物重复，2 个技术重复。对不同分组采
用荧光素互标。


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1.3.2 鼠疫菌RNA提取 应用细菌RNA保护剂分
别对实验组与对照组鼠疫菌进行保护，应用
MasterPureTM RNA 提取试剂盒进行实验组及对照
组鼠疫菌的总 RNA 提取，方法依据试剂盒说明书
进行，提取 RNA 后通过分光光度计与凝胶电泳鉴
定提取 RNA的质量。
1.3.3 探针标记 应用全基因组特异引物与 N6 随
机引物等量混合用于总 RNA 的逆转录。在逆转录
的过程中添加 aa-UTP，将获得的 cDNA用QIAquick
PCR Purification Kit试剂盒纯化，方法参照说明书
进行。应用 Cy3与 Cy5分别标记实验组与对照组的
cDNA，标记完成后纯化。
1.3.4 芯片杂交与扫描 将鼠疫菌全基因组芯片
置于杂交炉内 42 ℃杂交 16 h。然后依次以 1×SSC
＋0.06 %SDS溶液、0.06%SSC溶液及 95%乙醇溶
液各洗涤 2 min，电吹风吹干。用 Scan Array 4100
扫描仪扫描芯片。
1.3.5 结果分析 利用GenePix Pro 4.1软件对扫描
的荧光信号进行处理，采用整体归一法对双色荧光
数据进行归一化处理。SAM软件分析差异表达的基
因。判断基因表达显著的标准为：Cy5/Cy3 大于 2.0
的基因确定为表达明显上调基因；Cy5 / Cy3 小于
0.5的基因确定为表达明显下调基因。
1.3.6 大黄不同时间点作用鼠疫菌的共同差异基
因分析 将获得的大黄不同时间点作用鼠疫菌的
差异基因进行依据鼠疫菌不同基因功能分类进行
归类，分析阐述大黄作用鼠疫菌的分子机制。
1.4 应用实时荧光定量RT-PCR对芯片表达谱结果
进行验证
根据基因在染色体中的位置、片段大小和表达
水平等选择 10 个基因进行验证。利用 Roche 公司
的 Light Cycler Operator，运用相对标准曲线法进行
相对定量，分析这些基因在大黄作用组及无大黄作
用组的差异表达，并与芯片结果进行相关性分析。
2 结果
2.1 大黄水提物作用鼠疫菌MIC的检测结果
大黄水提物作用于鼠疫菌的最小抑菌浓度为
025 g·L-1。
2.2 大黄作用鼠疫菌的表达谱结果
将荧光信号较低的不可信数据剔除后，将有效
数据应用SAM统计软件进行显著性差异基因分析，
获得大黄作用鼠疫菌的表达谱。大黄作用鼠疫菌 30
min后，鼠疫菌的差异表达基因共有 498个，其中
上调 358个，下调 140个。大黄作用鼠疫菌 60 min
后，鼠疫菌的差异表达基因共有 575个，其中上调
420个，下调 155个。
2.3 大黄不同时间点作用鼠疫菌的共同差异表达
基因
大黄 2个不同时间作用点 30，60 min作用鼠疫
菌的共同差异表达基因共有 315个。其中共同上调
基因 250个，共同下调基因 65个。依据鼠疫菌CO92
株基因功能分类，这些共同差异表达基因分别属于
26个不同的基因功能类群（表 1）。在这些共同差
异表达基因中，数量最多的基因功能类群为细胞膜
相关基因（79个），位于变化数量第 2位的基因功
能类群为未知基因功能类群（54个）。处于第 3位
的基因功能类群是大分子合成相关基因（38个），
其中包括下调的核糖体合成相关基因（23个）。处
于第 4位的基因功能类群是转运结合蛋白相关基因
（31个）。
2.4 表达谱结果的 RT-PCR验证
定量 RT-PCR结果与芯片的数据比较相关系数
0.93，证实了基因芯片表达谱数据的可靠。
3 讨论
基因芯片自问世以来，在抗菌药物作用机制研
究领域得到了广泛的应用。Qiu等[3-4]应用鼠疫菌基
因芯片对链霉素与氯霉素作用鼠疫菌的分子机制
进行了阐述。鼠疫菌是引起烈性传染病鼠疫的病原
体，革兰染色阴性杆菌，对常规的抗生素敏感。鼠
疫菌多重耐药株的出现[5]，对鼠疫菌的治疗药物进
行研究便具有一定的现实意义。中药大黄对鼠疫菌
具有较好的抑菌作用[6]，大黄抑菌的分子机制并不
明确。基因芯片的应用，展示了在大黄作用下鼠疫
菌所表现的基因水平改变。从基因组水平揭示了大
黄作用鼠疫菌的分子机制。
核糖体是蛋白质合成的场所，核糖体在所有原
核生物中均具有一定保守性，核糖体常常作为抗微
生物药物作用的靶标。在链霉素、氯霉素等转录抑
制剂作用下，鼠疫菌可以生成更多的核糖体，以补
充流通中核糖体的减少以及减少核苷的重新合成
[3-4]。这些转录抑制剂在作用大肠杆菌、流感嗜血杆
菌以及肺炎球菌的研究中均有部分核糖体基因表


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表 1 大黄不同时间作用鼠疫菌共同表达差异
基因功能分类
功能 上调 下调 合计
小分子降解 2 0 2
能量代谢 8 4 12
中间代谢 2 3 5
氨基酸合成 2 5 7
辅酶合成 12 2 14
核酸补救途径 0 1 1
嘌呤核苷合成 0 2 2
脂肪酸合成 1 0 1
广谱调控子 25 1 26
大分子合成与修饰 7 31 38
大分子降解 5 0 5
细胞膜相关 77 2 79
转运结合蛋白 27 4 31
热休克相关 2 0 2
细胞分裂 1 0 1
动力与趋化 4 0 4
解毒相关 0 0 0
杀细胞相关 0 0 0
致病相关 6 2 8
前噬菌体与噬菌体 2 1 3
大肠菌素相关 1 0 1
药物与类似药物 3 1 4
适应环境相关 1 0 1
未知功能 50 4 54
未分类（噬菌体相关蛋白） 0 0 0
质粒相关 12 2 14
合计 250 65 315

现为上调[7]。在本研究中，鼠疫菌在大黄作用下核
糖体蛋白质合成与修饰的基因发生明显下调，在鼠
疫菌中已知的 54 个基因编码核糖体蛋白合成与修
饰的基因当中，有 23个基因（rplB，D，E，F，K，
N，P，Q，R，U，V，W，rpmC，E，rpsB，C，D，
E，H，J，K，L，R）在 2 个实验点均表现不同程
度的明显下调。表明大黄对核糖体蛋白的抑制作用
是其抗菌作用的重要机制，其作用机制不同于氯霉
素等转录抑制剂对核糖体蛋白质的作用。表明作用
蛋白质合成相关基因是大黄抑制鼠疫菌的关键原
因之一。
鼠疫菌是革兰阴性细菌，鼠疫菌通过内外细胞
膜来进行营养物质的转运。生物体最基本的特征就
是能够进行营养物质的吸收以及代谢废物的排出，
而在细菌中这些生命活动的完成则需要通过细胞
膜来完成。在大黄不同时间作用下，鼠疫菌共有 79
个编码细胞膜蛋白、脂蛋白以及质子动力的基因发
生了明显改变，其中 77 个基因发生上调而另外 2
个细胞膜基因发生下调。大量细胞膜基因发生转录
水平的改变，表明大黄的抑菌作用在很大程度上决
定于细胞膜的改变，重塑细胞膜结构是鼠疫菌抵抗
大黄作用所进行的主动改变。
3.4 转运结合蛋白基因的改变
所有生物体需要获取能量来进行细胞物质构
建。细菌主要通过以下方式进行营养物质的吸收：
协助扩散、渗透转运、结合蛋白转运以及集团转运。
组成转运系统的主要成分是转运结合蛋白，例如透
性酶协助进行协助扩散，结合蛋白转运系统或 ABC
转运系统协助主动运输，磷酸戊糖途径磷酸转移酶
协助集团转运。在大黄不同时间作用下，31个编码
转运／结合蛋白的基因发生了明显改变，其中 27
个基因发生明显上调，4 个基因发生下调。在这些
转录水平发生明显改变的转运结合蛋白中有编码
不同种类透性酶、编码 ABC 转运子以及编码碳水
化合物、阳离子与阴离子的转运结合蛋白。大黄作
用鼠疫菌转运结合蛋白发生转录水平改变的机制
还不十分清楚。这些转录水平的改变说明鼠疫菌影
响了转运调节蛋白的合成。
本实验在转录组水平对大黄抑制鼠疫菌的分
子机制进行了初步研究，获得了不同时间点大黄作
用鼠疫菌的表达谱以及不同时间点大黄作用鼠疫
菌的相同表达基因，通过对上述基因的生物信息学
分析，获得了大黄抑制鼠疫菌的关键功能基因组。
为在分子水平阐述大黄抑制鼠疫菌的分子机制研
究奠定了基础。
[参考文献]
[1] Shaw K J， Miller N， Liu X， et al. Comparison of the changes in
global gene expression of Escherichia coli induced by four
bactericidal agents[J]. J Mol Microbiol Biotechnol，2003，5：105.
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of action of novel antibacterial agents through transcriptional
profiling of conditional mutants[J]. Antimicrob Agents Chemother，
2005，49：749.
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Yersinia pestis induced by streptomycin[J]. FEMS Microbiol Lett，
2005，243(2)：489.
[4] Qiu J，Zhou D，Qin L，et al. Microarray expression profiling of
Yersinia pestis in response to chloramphenicol[J]. FEMS Microbiol
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[5] Smith M D，Vinh D X，Nguyen T T，et al. In vitro antimicrobial


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susceptibilities of strains of Yersinia pestis[J]. Antimicrob Agents
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[6] 薛建江，李立宏，乔海霞，等. 6种抗菌中药对鼠疫耶尔森菌抑菌
作用观察[J]. 中国地方病学杂志，2008，27(2)：85.
[7] Ng W L， Kazmierczak K M， Robertson G T， et al. Transcriptional
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Streptococcus pneumoniae R6 challenged with sublethal
concentrations of translation inhibitors[J]. J Bacteriol，2003，185：
359.



Study of molecular mechanism of Rheum offcinale against Yersinia pestis

BAI Qunhua1，JIA Yan1，DAI Xingbi1，XIAO Hong1，WANG Yingxiong1，
YANG Ruifu2，QIU Jingfu1*
(1. The department of health laboratory technology, The School of Public Health, Chongqing Medicial University,
Chongqing 400016, China ;
2. State Key laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military
Medical Sciences, Beijing 100071, China)

[Abstract] To investigate molecular mechanism of traditional Chinese medicine Rheum offcinale against Yersinia pestis，
whole genome DNA microarray that contains 4005 annotated genes of Y. pestis was used. The minimal inhibition concentration
(MIC) of R. offcinale extract against Y. pestis was determined by liquid dilution method. The gene expression profile of Y. pestis
was performed after exposured to R. offcinale extract at a concentration of 10×MIC for 30 and 60 minutes. The total RNA extracted
and purified from Y. pestis were reverse-transcribed to cDNA and labeled by Cy3-Cy5 dye. The labeled probes were hybridized to
the microarray and the results were obtained by a laser scanner and analyzed by the SAM software. The microarray data was
confirmed by RT-PCR. The platform of the DNA microarray-based bacteria transcriptional profiling was eshtablished. The results
revealed general gene expression changes of Y. pestis were a global phenomenon. Down-regulation of genes encoding proteins
involved in ribosome protein synthesis was a remarkable change. Genes encoding cell envelope and transport/binding proteins were
the major changed genes of the Y. pestis in response to R. offcinale
[Key words] Yersinia pestis；Rheum offcinale；anti-bacterial agents；DNA microarray；molecular
[责任编辑 古云侠]


《中国中药杂志》被国内外数据库收录情况和引证数据

1 国外数据库收录
美国 SciFinder数据库：进入医学索引MEDLINE；进入《化学文摘》（CA）；荷兰 Elsevier公司 Scopus
数据库；《国际药学文摘》(IPA)；《毒物学文摘》（ToxFile）；俄罗斯《文摘杂志》（AJ）；波兰《哥白尼索引》
（IC）；WHO西太平洋地区医学索引(WPRIM)。
2 国内数据库收录
“中国科学引文数据库”来源期刊；“中国学术期刊综合评价数据库”来源期刊；中国自然科学核心
期刊；中国中文核心期刊；中国科技核心期刊；《中国学术期刊文摘》中、英文版。
3 主要引证数据或数据库统计结果
《中国中药杂志》在中国知网（CNKI）的 2007年浏览量为 37万，下载量为 21万，国内外用户达到
2000余家。
据中国科学技术信息研究所分析研究中心发布的中国科技期刊核心版引证报告(2007)：影响因子为
0.693，总被引频次 3 937，基金论文比 0.53，被引半衰期 5.68；扩展版：影响因子 1.052；引文频次 6 853。