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Vol.34，Issue 4
February，2009
第 34 卷第 4 期
2009 年 2 月
人参皂苷 Rg1促进体外培养神经干细胞
增殖的研究
庄朋伟 1，张艳军 1*，庞 坦 1
（1．天津中医药大学 中药学院 天津市中药药理重点实验室，天津 300193）
[摘要] 目的：考察人参皂苷 Rg1对体外培养神经干细胞增殖的影响及其可能机制。方法：体外培养 14 d 大鼠胎鼠神经
干细胞，培养液中掺入终浓度为 10 mg·L-1的 5-溴脱氧尿苷嘧啶（BrdU），在培养液中分别加入 1，10 µmol·L-1的人参皂苷
Rg1，同时设置空白组。通过免疫荧光染色标记，计数 BrdU 阳性细胞数目；利用实时荧光定量 RT-PCR 方法检测神经干细
胞负性分化调节基因 Hes1 和正性分化调节基因 Mash1 mRNA 表达。结果：与空白对照组比较，10 µmol·L-1人参皂苷 Rg1可
显著性增加 BrdU 阳性细胞数目（40.5±10.9 vs 26.2±6.0，P<0.01），上调 Hes1 基因表达（1.00±0.11 vs 1.28±0.14，P<0.05）；
1 µmol·L-1人参皂苷 Rg1同时上调了 Hes1 和 Mash1 基因表达（1.00±0.11 vs 1.28±0.14，1.01±0.17 vs 1.25±0.23，P<0.05），
但 BrdU 阳性细胞数目无显著性差异（26.2±6.0 vs 24.7±9.3）。结论：人参皂苷 Rg1可以促进体外培养的神经干细胞增殖，
这种促增殖作用可能是通过上调 Hes1 基因表达实现的。
[关键词] 人参皂苷 Rg1；神经干细胞；增殖

20 世纪 90 年代科学家从成年小鼠纹状体分离
了能在体外不断分裂增殖，具有多种分化潜能的细
胞群[1]。此后，人们通过不断的实践，证明了神经
系统内多潜能干细胞的存在。但在正常情况下，成
年哺乳动物脑内神经干细胞（neural stem cell，NSC）
的数目太少，而且大多处于静息状态。虽然几种伤
害性刺激[2]，比如缺血、外伤等，能够引起内源性
神经干细胞的增殖，但是它们的神经再生能力似乎
非常局限，并不足以产生自我修复效果。这就使人
们不得不寄希望于通过药物干预，促进 NSC 增殖，
增加 NSC 数目，达到神经损伤修复及功能重建的
目的。中医药治疗中风，在理论探索、临床辨证论
治方面积累了丰富的经验。因此在中医药理论指导
下选择合适中药及其有效成分，诱导神经干细胞的
增殖，促进神经再生和神经功能的修复与重建，可
望为中药治疗神经损伤或神经退行性病变开辟全
新的治疗途径。本实验选择人参皂苷 Rg1，考察其
对体外培养的神经干细胞增殖的影响，并分别以正

[收稿日期] 2008-08-12
[基金项目] 国家自然科学基金(30472177, 30873395)；天津市科技攻关
计划重点科技攻关专项基金（06YFSZSF01600）
[通信作者] *张艳军，Tel：(022)23051052，E-mail：zyjsunye@163.com
[作者简介] 庄朋伟，在读博士，主要从事中药药理研究，E-mail：
zhuangpengwei@163.com，Tel：13212082363
性分化调节基因 Mash1[3]和负性分化调节基因
Hes1[4-5]为目的基因初步探讨其机制。以期为中药治
疗神经损伤及神经退行性疾病提供实验依据。
1 材料
1.1 动物
14 d Wister 孕鼠，由天津中医药大学实验动物
中心提供[北京维通利华实验动物技术有限公司，许
可证号 SCXK(京)2007-0001]。
1.2 药物与试剂
DMEM/F12 基础培养基、B27（invitrogen）；
5-溴脱氧尿苷嘧啶(5-bromodeoxyuridine，BrdU ，
Sigma)； polyclonal anti-Nestin（goat origin）（santa
cruz biotechnology）；monoclonal anti-BrdU（mouse
origin），Rabbit anti-goat IgG-Cy3，Goat anti-mouse
IgG-FITC（北京中杉金桥试剂有限公司）。TRNzol
总 RNA 提取试剂盒、PrimeScriptTM RT Reangent
Kit，SYBR®Premix Ex TaqTM( TaKaRa)购于天根生
化科技（北京）有限公司；人参皂苷 Rg1（ginsenoside
Rg1，批号 110703-20032，中国药品生物制品检定
所）。
1.3 仪器
Forma 3110 CO2 恒温培养箱（Thermo）；
DC300F 倒置相差显微镜（Leica）；D-37520 高速冷


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冻离心机（Heraeus）；DM R×A2 荧光显微镜
（Leica）；DU-530 紫外分光光度计（BECKMAN，
美国），480Kin-Elmer PCR 扩增仪（Branchburg，
NJ），ABI®7300 实时荧光定量系统（Applied
Biosystems，美国）。
2 方法
2.1 神经干细胞（NSC）分离培养
取孕龄 14 d 的大鼠，脱臼处死后 75%乙醇浸泡
消毒 3 min，无菌条件下取出胎鼠，取大脑皮质并
小心剥离软脑膜，冷 D-Hank′s 漂洗后，用 1 mL
移液枪吹打，机械分散，细胞悬液过 75 μm 筛网，
1 000 r·min-1 离心，弃上清，全培基（2%B27，20
µg·L-1bFGF 的 DMEM/F12）重悬，CO2 培养箱中
悬浮培养，3 d 后半量换液，期间每天补加 10
µg·L-1bFGF ，生长 6 d 后，收集培养的神经球传代，
用 5 号注射器机械分散，使之呈单细胞悬液，进行
传代。倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长状
况。实验用稳定生长的第 2 代悬浮神经球。
2.2 巢蛋白(Nestin)免疫荧光鉴定
取生长良好的第 2 代神经干细胞克隆球，接种
于置有预先包被 0.01%多聚赖氨酸的无菌盖玻片的
12 孔培养板中，放入 37 ℃，5％CO2培养箱培养，
使其贴壁 2 min，除去培养液制备细胞爬片，4％多
聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3 次后，5%BSA 室温
封闭 20 min，甩去封闭液，加一抗 Nestin（1∶200），
4 ℃过夜，PBS 洗 3 次后，加入二抗 Cy3（1∶500），
室温避光放置 1 h，DAPI 染核 10 min，甘油封片，
荧光显微镜下观察并照相。
2.3 对神经干细胞增殖的影响
取生长良好的第 2 代神经干细胞克隆球，适当
吹打机械分散成单细胞或是较小克隆球，在培养液
中加入终浓度 10 mg·L-1的 BrdU，分为终浓度为 1，
10 µmol·L-1人参皂苷 Rg1 组，同时设置空白对照组，
24 h 换液 1 次，48 h 后制备细胞爬片，收集 NSCs
克隆球稍加吹打，接种于置有预先包被 0.01%多聚
赖氨酸的盖玻片的 12 孔培养板中，使悬浮的克隆
球贴壁，4％多聚甲醛固定，收获细胞爬片，行 BrdU
免疫荧光染色，观察药物对体外培养 NSC 增殖的
影响。
2.4 BrdU 免疫荧光染色[6]
将细胞爬片用含 0.05%Triton-100 的 PBS 给细
胞膜穿孔，pH 6.0 枸橼酸 95 ℃热修复 5 min，50%
甲酰胺 65 ℃孵育 2 h，然后在 1 mol ·L-1 HCl 37 ℃
孵育 30 min，0.1 mol·L-1 硼酸缓冲液室温放置 10
min，胃酶消化液消化 5 min，正常羊血清封闭 30
min，滴加小鼠抗 BrdU 单克隆抗体（1∶200），4 ℃
过夜，滴加 FITC 标记的羊抗小鼠二抗（1∶200）
孵育 1 h，50%的甘油封片，荧光显微镜下每孔每张
盖玻片随机选取 5 个视野，观察染色结果并记录每
个视野下阳性细胞数目。
2.5 实时荧光定量 RT-PCR 检测 NSC Hes1 和
Mash1 mRNA 表达
2.5.1 分组 选用的细胞及分组、剂量同 2.3 项下，
24 h 换液 1 次，48 h 后收集 NSC 克隆球稍加吹打，
接种于置有预先包被 0.01%多聚赖氨酸的 6 孔培养
板中，使悬浮的克隆球贴壁，每组 4 复孔，每孔加
1mL 细胞裂解液，提取 RNA 备用。
2.5.2 RT-PCR 反应 使用 ABI®7300 实时荧光定
量 PCR 仪 ， 检 测 NSC 分 化 基 因 Hes1 和
Mash1mRNA 表达，并以β-actin 作为内参照。PCR
引物由上海生物工程技术服务有限公司合成
（Hes1：Forwad CACAGAAAGTCATCAAAGCC
TATCA，Reverse TTCTTAAGTGCATCCAAAATC
AGTGT；Mash1：Forward CCAACTACTC CAACGA
CTTGAACTC ， Reverse TCCTGCCATCCTGCTT
CCAAAG；β-actin：Forward AGAGGGAAATCG
TGC；Reverse CGATAGTGATGACCT）。在实时荧
光定量 PCR 仪上检测各样本基因表达，应用
ABI®7300 实时定量 PCR 仪分析软件，获得每个样
品的 Ct 值，取 2-ΔΔCt 值进行数据统计[7]。
2.6 统计学处理
应用 SPSS11.5 统计软件进行数据处理，实验数
据以 x ±s 表示，采用单因素方差分析 LSD 方法统
计，组间比较用 Dunnett′t 检验。P<0.05 为有显著
性差异。
3 结果
3.1 NSC 培养及鉴定
原代接种的 NSCs 呈单个圆球形，培养 3 d 后
培养液中可见由 10 几个细胞组成的细胞球，细胞
排列紧密，培养液中可见许多细胞碎片。培养 6 d
后细胞球形态趋于规则，但球体大小不一，经机械
吹打分散传代后，在培养液中可见较多单细胞及少


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量较小的细胞团。传代后 3 d 单细胞逐渐形成新的
神经干细胞克隆球，并有放射状微小突出伸出。细
胞爬片接种 2 h 后，大部分克隆球贴壁，边缘有部
分单个细胞爬出，排列规则。
荧光显微镜下观察，单个神经干细胞为圆形，
神经干细胞克隆球及散在单个细胞均 Nestin 阳性，
胞浆着红色，DAPI 染细胞核为蓝色（图 1）。

A. NSC 培养 6 d（×100）；B. Nestin 免疫荧光鉴定（×200）。
图 1 NSC 原代培养的细胞形态及鉴定结果

3.2 对 NSC 增殖的影响
10 µmol·L-1人参皂苷 Rg1 对 NSCs 增殖具有明
显促进作用，与对照组比较，Rg1 高剂量可显著性
增加 BrdU 阳性细胞数目（P<0.01），低剂量无显著
性差异（表 1）。
表1 人参皂苷Rg1对NSC增殖的影响( ±sx ，n=5)
分组 剂量
/µmol·L-1
BrdU 阳性细胞
/个
对照 - 26.2±6.0
人参皂苷 Rg1 10 40.5±10.9 1)
1 24.7±9.3
注：与对照组比较1)P<0.01。

3.3 对 NSCs 分化基因的影响
与对照组比较，1，10 µmol·L-1 人参皂苷 Rg1
均可升高 NSC Hes1 mRNA 表达（P<0.05），Rg1 低
剂量还可升高 NSC Mash1 mRNA 表达（P<0.05），
而Rg1高剂量对Mash1 mRNA表达无明显影响 （表
2）。
表2 人参皂苷Rg1对NSCs分化基因Hes1和
Mash1mRNA表达的影响( ±sx ，n=4)
分组 剂量/µmol·L-1 Hes1mRNA 表达 Mash1mRNA 表达
对照 – 1.00±0.11 1.01±0.17
人参皂苷 Rg1 10 1.28±0.141) 1.00±0.14
1 1.23±0.14 2) 1.25±0.232)
注：与对照组比较1)P<0.01，2)P<0.05。
4 讨论
在神经退行性疾病中，可以明显观察到神经细
胞的缺失，研究如何通过神经干细胞增殖并分化为
特定神经细胞来补充缺失的细胞是成体神经再生
研究的热点问题。正常情况下，机体 NSC 数目较
少，且大多处于静息状态，不足以达到神经自我修
复与功能重建的目的[8-9]。这就使人们自然联想到通
过促进内源性增殖或外源性移植而使 NSC 达到合
适数目，从而达到神经再生并改善神经功能活动的
目的。寻找促进 NSC 增殖的药物将对成体神经再
生研究具有重要意义。巢蛋白(Nestin)为 NSC 特异
性的标记物[10]，本实验利用 14 d 胎鼠，建立了 NSC
的体外培养方法，Nestin 免疫荧光染色证明纯度较
高，可用于后续试验。
药理学研究发现，人参皂苷能促进脑内蛋白质
的合成，稳定神经细胞膜，保护突触结构，增加突
触数目，抑制神经毒及抗神经细胞凋亡等作
用[11-14]。而人参皂苷 Rg1 能否通过促进 NSC 增殖，
补充缺失神经细胞数目而达到治疗神经系统疾病
的目的，BrdU 可以在细胞增殖周期的 S 期嵌入细
胞核的 DNA 中，因而 BrdU 阳性细胞被看作是新生
的增殖细胞[3]。本实验利用 BrdU 免疫荧光染色方
法，考察了人参皂苷 Rg1 对体外培养的神经干细胞
增殖的影响，结果发现在同等接种密度条件下，10
µmol·L-1人参皂苷Rg1组BrdU阳性细胞数显著多于
对照组（40.5±10.9 vs 26.2±6.0，P<0.01），而 1
μmol·L-1人参皂苷Rg1组BrdU阳性细胞数与对照组
比较无明显差异，提示高剂量人参皂苷 Rg1 可提高
体外培养的 NSC 的增殖活性。
NSC 的增殖分化受其内在基因调控，Mash1 基
因通常被认为是正性分化调节基因[3]，Hes1 为负性
分化调节基因，两者可互为拮抗。Hes1 可以维持
NSC 的自我更新和抑制其分化，对产生神经细胞的
合适数量和构建正常神经功能具有重要意义[4-5]。本
实验利用实时荧光定量 RT-PCR 技术，检测了 NSC
Hes1 和 Mash1 的 mRNA 表达。结果发现，10
µmol·L-1 人参皂苷 Rg1 作用于 NSC 48 h，与空白组
比较可以明显上调 Hes1 mRNA 表达，对 Mash1
mRNA 表达无明显影响，提示人参皂苷 Rg1 可能是
通过上调 Hes1 mRNA 表达而促进神经干细胞增殖
的；而 1 µmol·L-1 人参皂苷 Rg1 同时上调了 NSC


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Hes1 和 Mash1 mRNA 表达，但细胞免疫荧光染色
结果表明 BrdU 阳性细胞数目与空白组比较无明显
差异，说明在该剂量下人参皂苷 Rg1对 NSC 增殖无
明显影响，上调 Mash1 mRNA 表达提示低剂量人参
皂苷 Rg1 可能对 NSC 分化具有一定影响，其对 NSC
分化的影响将是进一步研究的重点。
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Proliferation effect of neural stem cell of Ginsenoside Rg1 in vitro

ZHUANG Pengwei, ZHANG Yanjun, PANG Tan
(Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin Laboratory of Chinese Medience Pharmacology,
Tianjin 300193, China)

[Abstract] Objective： To study the proliferation effect of neural stem cells (NSCs) of ginsenoside Rg1 in vitro. Method：
NSCs from the embryonic rat (El4) were isolated, 10 mg·L-1 BrdU were added in the medium. The NSCs were incubated together
with 1，10 μmol·L-1 ginsenoside Rg1 for 48 hours, control group were setup. Then BrdU positive cell number were detected and
counted by fluorescence microscop. The Hes1 and Mash1 mRNA expression were detected by real-time RT-PCR. Result： The
number of BrdU positive cells in 10 μmol·L-1 ginsenoside Rg1 group was increased significantly compared with the control group
（40.5±10.9 vs 26.2±6.0，P<0.01）, and the Hes1 mRNA expression were increased significantly（1.00±0.11） vs （1.28±0.14），
P<0.05. Conclusion：ginsenoside Rg1 can promote the proliferation of neural stem cells in vitro, and this effect may be induced by
the up-regulation Hes1 expression.
[Key words] ginsenoside Rg1; neural stem cell; proliferation
[责任编辑 古云侠]