全 文 ：[ 作者简介] 黄晓其 ,男 ,硕士研究生 , E-mai l:huang-xiaoqi@163.com　[ 通讯作者] 苏子仁 ,男 , 研究员 ,电话:020-36585814 , E-mai l:suzi ren@
126.com
高效液相梯度法测定红花牡丹膏中人参皂苷 Rg1 、Rb1 、Re及三七皂苷
R1的含量
黄晓其 ,曾宝 ,苏子仁　(广州中医药大学新药研究开发中心 , 广东 广州 510405)
[ 摘要] 　目的:建立红花牡丹膏中有效成分的含量测定方法。方法:采用高效液相色谱梯度法测定红花牡丹膏中有效成分含
量。结果:三七中人参皂苷 Rg1 、Rb1 、Re及三七皂苷 R1 4 种成分均达到良好分离 , 在测定范围内线性良好 , 回收率在 98%～
101%之间。结论:所建立的定量方法简便可行 、重复性好 , 可用于红花牡丹膏的质量监控。
[ 关键词] 　高效液相色谱法;红花牡丹膏;人参皂苷 Rg 1 ;人参皂苷 Rb1 ;人参皂苷 Re;三七皂苷 R1
[中图分类号] R927.2　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2007)10-1393-04
Determination of ginsenoside Rg1 , Rb1 ,Re and notoginsenoside R1 in Honghua Mudan ointment
by HPLC
HUANG Xiao-qi , ZENG Bao , SU Zi-ren(Guang zhou Univ ersity of T raditional Chinese Medicine , Guangdong Guang-
zhou 510405 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To e stablish a me thod of HPLC assay fo r simultaneous determining ginsenoside Rg 1 , Rb1 , Re and
no toginseno side R1 in Honghua Mudan o intment.METHODS　The effec tive components in Honghua Mudan o intment w ere de-
te rmined by H PLC.RESULTS　The reso lution and the linearity were fine.The average recoveries o f g inseno side Rg1 , Rb1 , Re
and no tog inseno side R1w ere 99.14%,(RSD 0.83%), 99.18%,(RSD 1.26%), 99.39%,(RSD 1.24%) and 99.05%,(RSD
1.15%)separ ately.CONCLUSION　The quantita tive method fo r determinating the ing redients o f Honghua Mudan ointment is
simple , feasible and repea table , and is beneficial fo r quality contro l of Yishenling G ranules.
KEY WORDS:H PLC;Honghua M udan o intment;ginsenoside Rg1 ;ginsenoside Rb1 ;ginsenoside Re;noto ginsenoside R1
　　红花牡丹膏是由红花 、三七 、两面针 、生川乌等
10味药组成的水包油型软膏剂 ,具有消肿止痛 、疏
经通络 、活血化淤之功效 。用于跌打损伤 、局部淤肿
疼痛及骨关节病之肿胀疼痛属血淤阻滞 、寒湿内侵
等症 。其中三七为君药 ,且为贵重细料药 ,其主要成
分为人参皂苷 Rgl 、人参皂苷 Rb1 、人参皂苷 Re 、三
七皂苷 R1等 。中国药典 2005年版收录了三七中人
参皂苷 Rg1 、Rb1 、三七皂苷 R1的含量测定方法[ 1] 。
为建立红花牡丹膏质量控制方法 ,采用 HPLC 法同
时对人参皂苷 Rg 1 、Rb1 、Re 及三七皂苷 R1进行含
量测定 ,以保证本制剂的质量及临床疗效。
1　材料
DION EX SUMM IT P680高效液相色谱仪(美
国戴安公司);人参皂苷 Rg 1(批号 110703-200322)、
人参皂苷 Rb1(批号 110704-200318)、人参皂苷 Re
(批号 0754-9911)、三七皂苷 R1 (批号 110745-
200313)均购自中国药品生物制品检定所;D101 型
大孔吸附树脂(天津树脂厂);红花牡丹膏(南方医科
大学珠江医院药材科 ,批号 20051128 , 20051129 ,
20051130);乙腈为色谱纯;水为纯化水;其他试剂均
为分析纯 。
2　处方与制备
红花 200 g ,三七 100 g ,两面针 100 g ,生川 50
g ,丹皮酚 10 g ,松节油 5 g ,樟脑2.5 g ,薄荷脑 2 g ,
冰片 2.5 g ,肉桂油 5 g ,共制成 1 000 g 。以上 10
味 ,两面针 、三七 、川乌 ,分别打成粗粉 ,与红花一起
加 6倍量 75%乙醇回流提取 3 次 ,滤过 ,合并滤液 ,
减压回收乙醇至无醇味 ,置洁净容器中 ,备用。将苯
甲酸钠 、甘油 、卡波姆和水配成溶液混匀 ,再与两面
针等药材提取液混匀 ,作为水相 ,备用 。另取丹皮
酚 、松节油 、樟脑 、薄荷脑 、冰片 、肉桂油 、乳化剂聚山
梨酯 80混匀 ,作为油相 ,加入水相中 ,搅匀 ,分装 ,即
得。
3　方法与结果
3.1　色谱条件和系统适应性试验　色谱柱:Phe-
nomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm ,5 μm);流动
相:乙腈-水梯度洗脱(0 ～ 35 min ,乙腈质量分数为
19%;35 ～ 55 min , 乙腈质量分数由 19%递升至
·1393·中国医院药学杂志 2007年第 27卷第 10期 Chin H osp Pharm J , 2007 Oct , Vol 27 , No.10
29%;55 ～ 70 min ,乙腈质量分数为 29%;70 ～ 100
min ,乙腈质量分数由 29%递升至 40%);柱温:
27 ℃(70 min时降为20 ℃);流速:1.0 mL·min-1 ,
检测波长:203 nm ,进样量:10 μL 。在该色谱条件
下 ,人参皂苷 Rg 1 、Rb1 、Re及三七皂苷 R1 4种成分
可达基线分离 ,其他成分对测定无干扰 ,见图 1 。
图 1　红花牡丹膏中人参皂苷 Rg1 、Rb 1 、Re及三七皂苷 R1的 HPLC
图谱
A.三七皂苷 R1;B.人参皂苷 Rg1 ;C.人参皂苷 Re;D.人参皂苷 Rb 1
Fig 1　HPLC of gin senoside Rg1 , Rb1 , Re and notoginsenoside R 1
A.notoginsenoside R1;B.ginsenoside Rg1;C.gin senoside Re;D.
ginsenoside Rb 1
3.2　对照溶液的制备
3.2.1　对照品溶液的制备　精密称取人参皂苷 Re
对照品9.8 mg ,置 10 mL 量瓶中 ,用甲醇溶解并稀
释至刻度 ,摇匀 ,为人参皂苷 Re 对照品储备液(每 1
mL 含人参皂苷 Re 0.98 mg);精密称取三七皂苷
R1对照品9.4 mg ,置 5 mL 量瓶中 ,用甲醇溶解并稀
释至刻度 ,摇匀 ,为三七皂苷 R1对照品储备液(每 1
mL 含三七皂苷 R1 1.88 mg);精密称取人参皂苷
Rg1对照品10.3 mg 、人参皂苷 Rb1对照品8.8 mg ,
精密吸取人参皂苷 Re 对照品储备液1.5 mL 、三七
皂苷 R1对照品储备液置 1 mL ,置同一 10 mL 量瓶
中 ,用甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,得每 1 mL 含人参皂
苷 Rg1 1.03 mg 、人参皂苷 Rb1 0.88 mg 、人参皂苷
Re 0.147 mg 、三七皂苷 R10.188 mg 的混合对照品
溶液 。
3.2.2　三七对照溶液的制备　取三七单味药材 ,按
制剂工艺及“3.4.3”项下供试品制备方法 ,制成三七
药材样品溶液。
3.2.3　阴性对照溶液的制备　按不含三七的处方 ,
按制剂工艺及“3.4.3”项下供试品制备方法 ,制成缺
三七阴性样品溶液。
3.3　线性范围的考察　精密吸取混合对照品溶液
2 ,4 , 6 ,8 , 10 ,12 μL 进行色谱测定 ,按上述色谱条件
测定峰面积 ,并以峰面积对进样量(μg)进行线性回
归 ,结果各成分的线性关系良好。
人参皂苷 Rg1回归方程为 Y =289.59 X +
33.504 , r=0.999 9 ,线性范围为2.06 ～ 12.36 μg;
人参皂苷 Rb1回归方程为Y =230.34X +1.692 , r=
0.999 9 ,线性范围为1.76 ～ 10.56 μg ;人参皂苷 Re
回归方程为Y =242.19X +2.559 7 , r=0.999 9 ,线
性范围为0.294 ～ 1.764 μg ;三七皂苷 R1回归方程
为Y =287.36X-8.879 1 , r=0.999 9 ,线性范围为
0.376 ～ 2.256μg 。
3.4　供试品溶液的制备[ 2] 　应用无水硫酸钠破乳 、
超声提取 , 大孔吸附树脂富集纯化三七总皂苷 ,
HPLC 测定样品中人参皂苷 Rg1 、人参皂苷 Rb1 、人
参皂苷 Re 、三七皂苷 R1的含量 。
3.4.1　大孔吸附树脂洗脱溶媒的选择　取本品约
5 g(相当于三七药材0.5 g),精密称定 ,置具塞三角
瓶中 ,加无水硫酸钠 25 g ,搅拌 , 破乳 ,加甲醇 50
mL ,密塞 , 超声提取 30 min(功率 250 W , 频率 33
kHz),滤过 ,残渣再加甲醇 30 mL ,密塞 ,超声提取
15 min ,滤过 ,用甲醇洗涤药渣及容器 2 次 ,每次 15
mL ,合并滤液与洗液 ,置水浴上蒸干 ,残渣加水 30
mL 使溶解 ,置 D101 型大孔吸附树脂柱上 ,用 200
mL 注射用洗脱至洗脱液无色 ,依次用 50%乙醇 、
70%乙醇 、90%乙醇各 100 mL 梯度洗脱。洗脱液
流速 2 mL·min-1 ,50%乙醇 、70%乙醇 、90%乙醇洗
脱液分别收集 25 mL(各 4份),测定人参皂苷 Rg1 、
人参皂苷 Rb1 、人参皂苷 Re和三七皂苷 R1总含量。
以量瓶编号为横坐标(X),人参皂苷 Rg1 、人参皂苷
Rb1 、人参皂苷 Re 和三七皂苷 R1总含量为纵坐标
(C)绘制洗脱曲线(图 2)。结果表明 ,在 50%乙醇
洗脱液中 ,可洗脱大部分 4 种皂苷;70%乙醇洗脱
液可将 4 种皂苷洗脱完全 ,90%乙醇洗脱部分已基
本无这 4 种皂苷 ,而且 70%乙醇洗脱速度较快 ,故
选用 70%乙醇洗脱。
图 2　不同浓度乙醇梯度洗脱曲线
1 ～ 4号 50%乙醇洗脱液;5 ～ 8号 70%乙醇洗脱液;9 ～ 12号 90%乙
醇洗脱液
Fig 2　E lut ion curve of ethan ol w ith diff erent concent ration s
1-4.50% ethanol elut ion;5-8.70% ethan ol elu tion;9-12.90%
ethanol elut ion
　　按“3.4.1”项下最佳参数制备红花牡丹膏甲醇
·1394· 中国医院药学杂志 2007年第 27卷第 10期 Chin H osp Pharm J , 2007 Oct , Vol 27 , No.10
提取液 , 蒸干 ,加水溶解 , 平行 3 份 ,分别上柱 , 用
200 mL 注射用水洗脱至洗脱液无色 , 再分别用
50%乙醇 、70%乙醇各 200 mL 洗脱 ,分 4次收集洗
脱液 ,每次 50 mL ,测定 1 ～ 4 号洗脱液中 4种皂苷
的总量。以洗脱体积为横坐标(X), 4种皂苷的总
含量为纵坐标(C)绘制洗脱曲线见图 3。
图 3　50%乙醇(A)、70%乙醇(B)洗脱人参皂苷 Rg1 、Rb1 、Re 和三
七皂苷 R1的流出曲线
Fig 3　 Elut ing cu rves of gin sen oside Rg1 , Rb1 , Re and notoginsen-
oside R1 by 50% ethanol(A)and 70% ethanol(B)
　　结果显示 , 200 mL 体积的 50%乙醇不能将 4
种皂苷洗脱尽 ,而 200 mL 70%乙醇能将其洗脱尽 ,
且洗脱速度快。因此 ,优选的洗脱条件为先用 200
mL 纯化水洗涤至洗脱液无色 ,继用 70%乙醇洗脱 ,
收集 70%乙醇洗脱部分 ,最后用 95%的乙醇再生树
脂。
3.4.2 　大孔吸附树脂洗脱溶媒用量的考察　按
“2.4.1”项下最佳参数制备红花牡丹膏甲醇提取液 ,
蒸干 ,加水溶解 ,置 D101型大孔吸附树脂柱上 ,用
200 mL 注射用水洗脱至洗脱液无色 ,再用 225 mL
70%乙醇洗脱 ,收集 25 mL 9份 ,测定其 4种皂苷的
累计百分含量 ,以洗脱体积为横坐标(X), 4种皂苷
的累计百分含量为纵坐标(Y),绘制洗脱曲线 ,见图
4。
图 4　洗脱液用量考察结果
Fig 4　T he result of elution volum e
　　结果表明 ,用 200 mL 70%可将样品中的人参
皂苷 Rg1 、人参皂苷 Rb1 、人参皂苷 Re 和三七皂苷
R1基本洗脱下来 ,故洗脱溶媒用量确定为 200 mL。
3.4.3　供试品溶液的制备方法　取本品约 5 g(相
当于三七药材0.5 g),精密称定 ,置具塞三角瓶中 ,
加无水硫酸钠 25 g ,搅拌 ,破乳 ,加甲醇 50 mL ,密
塞 ,超声提取 min(功率 250 W , 频率 33 kHz),滤
过 ,残渣再加甲醇 30 mL ,密塞 ,超声提取 15 min ,滤
过 ,用甲醇洗涤药渣及容器 2次 ,每次 15 mL ,合并
滤液与洗液 ,置水浴上蒸干 ,残渣加水 30 mL 使溶
解 ,置 D101型大孔吸附树脂柱(内径约1.5 cm ,柱
高 10 cm),以 2 mL·min-1的流速 ,用水 200 mL 洗
脱 ,弃去洗脱液 ,继用 70%乙醇 200 mL 洗脱 ,弃去
7 ～ 9 mL ,收集续洗脱液 ,蒸干 ,残渣用甲醇溶解并
转移至 25 mL 量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀 ,即得 。
3.5　精密度考察　取2.2.1项下对照品溶液 ,注入
液相色谱仪测定 ,重复进样 6次 ,每次 10 μL ,记录
峰面积平均值 ,人参皂苷 Rg1 RSD为 0.73%,人参
皂苷 Rb1 RSD 为 1.13%, 人参皂苷 Re RSD 为
1.21%,三七皂苷 Re RSD为0.92%,表明本方法精
密度良好 。
3.6　稳定性考察　取红花牡丹膏供试品溶液 ,分别
在 0 ,2 ,4 ,8 ,12 h进样 10 μL ,测定峰面积 。结果人
参皂苷 Rg1 RSD 为1.66%,人参皂苷 Rb1 RSD 为
1.87%,人参皂苷 Re RSD 为1.21%,三七皂苷 R1
RSD为0.92%,表明 12 h内各成分基本稳定。
3.7　重复性考察　取同一批样品(批号 20060428),
平行 6次取样制备供试品溶液 ,测定峰面积并计算
含量 ,人参皂苷 Rg1 RSD 为1.63%,人参皂苷 Rb1
RSD为1.31%,人参皂苷 Re RSD 为1.89%,三七
皂苷 R1 RSD为1.34%,表明本方法有较好的重复
性。
3.8　回收率考察　取已知含量的同一批样品(批号
20060428)约2.5 g ,精密称定 ,分别精密加入一定量
的人参皂苷 Rg1 、人参皂苷 Rb1 、人参皂苷 Re 、三七
皂苷 R1对照品按供试品溶液制备方法 ,制成加样供
试品溶液 ,精密吸取溶液 10 μL ,在上述色谱条件测
定 ,结果见表 1 。加样回收率(%)=(实测量-样品
量)/加样量×100%。
3.9 　样品测定 　取本品约 5 g , 精密称定 , 按
“2.4.2”项下的供试品溶液制备方法操作 ,制备供试
品溶液 ,精密吸取供试品溶液 10 μL ,按上述色谱条
件测定 ,结果见表 2。
4　讨论
本品处方由多味中药组成 ,活性成分多 ,影响鉴
别的干扰因素较多 。本试验曾用甲醇直接超声提取
样品 ,用 80%乙醇直接回流提取等方法进行提取 ,
结果皂苷类成分提取效果均不佳 。用水直接超声提
取再以氯仿脱酯并以正丁醇萃取样品 ,结果皂苷类
·1395·中国医院药学杂志 2007年第 27卷第 10期 Chin H osp Pharm J , 2007 Oct , Vol 27 , No.10
表 1　红花牡丹膏加样回收率试验结果
Tab 1　Ana ly tical recovery test o f g inseno side Rg 1 , Rb1 , Re
and no tog inseno side R1 in H onghua Mudan ointment
成分 样品含量/mg
对照品加
人量/mg
测得总量
/mg
回收率
/ %
平均回收
率/%
RSD
/ %
人参皂
苷 Rg1
7.264
7.155
7.399
7.358
6.869
7.004
5.9
5.9
7.4
7.4
8.4
8.4
13.160
13.015
14.719
14.743
15.150
15.186
99.94
99.31
98.91
99.80
98.57
97.40
98.99 0.94
人参皂
苷 Rb1
5.610
5.527
5.683
5.762
5.410
5.463
4.5
4.5
4.7
5.7
6.5
6.5
10.074
10.074
11.310
11.378
11.992
12.056
99.19
101.72
98.71
98.53
101.26
101.43
100.14 1.48
人参皂
苷 Re
1.160
1.143
1.199
1.196
1.097
1.119
0.9
0.9
1.2
1.2
1.3
1.3
2.096
2.061
2.352
2.359
2.412
2.449
100.80
98.96
97.72
98.53
99.60
100.75
99.39 1.24
三七皂
苷 R1
1.116
1.128
1.098
1.091
1.019
1.039
0.9
0.9
1.1
1.1
1.2
1.2
2.001
2.007
2.182
2.197
2.222
2.226
98.33
97.67
98.55
100.55
100.25
98.92
99.04 1.14
表 2　红花牡丹膏中人参皂苷 Rg 1 、Rb1 、Re 及三七皂苷 R1
的含量测定结果(n=3)
Tab 2　De te rmination re sult of ginsenoside Rg1 , Rb1 , Re and
noto ginseno side R1 in Honghua Mudan ointment(n=3)
　批号 含量测定/mg·g-1
20060428 2.63±0.09 2.02±0.020 0.39±0.016 0.43±0.004 5.47±0.10
20060429 2.69±0.006 2.04±0.014 0.39±0.024 0.41±0.008 5.53±0.13
20060430 2.55±0.10 2.11±0.020 0.39±0.005 0.41±0.018 5.46±0.12
提取效果差。考虑到三七中主要为皂苷类成分 ,且
本品为 O/W 软膏剂 ,无水硫酸钠具有强吸水性 ,可
吸收水包油型基质软膏中的水相而破乳 ,因此采用
样品先加无水硫酸钠适量 ,搅拌 ,以便脱水破乳 ,再
用甲醇超声提取 2 次。试验结果表明 ,该法可使样
品中的人参皂苷 Rg1 、Rb1 、Re 及三七皂苷 R1提取
完全 ,于是直接用高效液相色谱对其进行含量测定 ,
结果杂质峰较多 ,分离效果差。因此需对三七中皂
苷类成分进行分离纯化 。
参考文献:
[ 1] 　中国药典.一部[ S] .2005:105 , 10-11.
[ 2] 　刘中秋 ,蔡雄 ,赖小平 ,等.大孔吸附树脂富集纯化三七总皂苷
工艺研究[ J] .中国实验方剂学杂志, 2001 , 7(3):4-6.
[收稿日期] 2006-08-06
[ 作者简介] 秦昉 ,女 ,学士 ,高级工程师 ,电话:0510-85919626 , E-mail:qff last@sina.com.
液相色谱-质谱联用测定养血清脑颗粒中芍药苷的含量
秦昉 ,虞锐鹏 ,蔡宝玉　(江南大学食品科学与技术国家重点实验室 , 江苏 无锡 214036)
[ 摘要] 　目的:建立灵敏 、准确的液相色谱/质谱法测定养血清脑颗粒中芍药苷的含量。 方法:样品经 50%甲醇提取后 , 采用
Sunfire TM C18柱(2.1 mm×150 mm , 5μm)分离 ,甲醇-0.2%甲酸为流动相 ,梯度洗脱。质谱采用 ESI方式 , 正离子采集 ,以选择
离子(SIR)方式进行定量测定。结果:测定方法的线性范围为0.68 ～ 13.52 mg·L-1 , 平均加样回收率为 96.0%, RSD 为
1.54%。结论:该法简便 、快速 、准确 、灵敏 ,适用于中药制剂中芍药苷的含量检测。
[ 关键词] 　芍药苷;液相色谱-串联质谱;养血清脑颗粒
[中图分类号] R927.2　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2007)10-1396-03
Determination of paeoniflorin in Yangxue Qingnao granules by LC-MS
QIN Fang , YU Ruei-peng , CAI Bao-yu(S ta te Key Labo rato ry of Food Science and Technolog y , Jiangnan Univer sity ,
Jiang su Wuxi 214122 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To establish a me thod fo r de te rmining the content o f paeoniflo rin in Yangxue Qingnao gr anules by
LC/MS.METHODS　Sample was extr acted by 50% mathano l-w ater solution , separ ated by Sunfire TM C18 co lumn(2.1 mm×150
mm , 5 μm), mobile phase w as mathanol-0.2% fo rmic acid in g radient change.Mass spectromet ry w as set in electro spray(ESI
+)mo lde , and SIR func tion fo r quantifica tion.RESULTS　The linear range of paeoniflo rin was 0.68-13.52 mg·L-1 .The re-
covery ra te w as 96.0% with an RSD of 1.54%(n=6).CONCLUSION　Thc method is simple , rapid , accura te and sensitiv e , can
be used to determine the content of paeoniflo rin in Chinese traditional medicine.
KEY WORDS:paeoniflo rin;LC-MS;yangxueqingnao g ranules
·1396· 中国医院药学杂志 2007年第 27卷第 10期 Chin H osp Pharm J , 2007 Oct , Vol 27 , No.10