全 文 ：丙酮对溶栓酶活力的动力学初步探究
林光美１，陈明２，杨菁２，汪世华２
（１．福建农林大学 作物学院，福建 福州 ３５０００２；
２．福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 ３５０００２）
［摘要］　目的：研究丙酮对枯草芽孢杆菌溶栓酶活力的影响及抑制动力学。方法：用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００凝胶柱色谱分离纯
化酶，以四肽底物法测定酶活，选择丙酮为效应物，测其对溶栓酶的影响。最后，用 ＬｉｎｅｗｅａｖｅｒＢｕｒｋ双倒数作图法，比较酶催
化的动力学参数，确定抑制剂的类型，测定抑制常数。结果：当丙酮浓度增大时，溶栓酶的酶活力损失越严重。在含不同浓度
丙酮的测活体系中，随着丙酮浓度的增大，直线的斜率降低。在双倒数图中，Ｖｍａｘ值随着丙酮的增大而减小，而 Ｋｍ值随着丙酮
的增大而增大。测得丙酮对酶的抑制常数ＫＩ，ＫＩＳ分别为１２５，３１７。结论：丙酮对溶栓酶有抑制作用。丙酮对酶的抑制作用
是可逆过程，抑制类型为混合型抑制。
［关键词］　溶栓酶；丙酮；抑制；动力学
［收稿日期］　２００９０７１７
［通信作者］　汪世华，博士，副教授，研究方向分子免疫与生物药
物学，Ｔｅｌ：（０５９１）８３７８９４９２，Ｅｍａｉｌ：ｗｓｈｙｙｌ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
　　枯草芽孢杆菌是从豆豉中分离出来的高产溶栓
酶的菌株，枯草杆菌溶栓酶是从枯草芽孢杆菌发酵
的产物中发现的一类具有溶血栓作用的酶，这类酶
不仅可以抑制血栓的形成，同时还能显著地溶解体
内外血栓，缩短血球蛋白溶解时间，并能激活静脉内
皮细胞产生纤维蛋白的溶酶原激活剂（ｔＰＡ），最终
将血栓水解成小肽及氨基酸，从而间接表现其溶纤
维活性，且溶血栓效果大于传统的纤溶酶和弹性蛋
白酶，安全性高［１］。
近几年，随着非水酶学的兴起，酶在有机溶剂中
的催化作用受到越来越多的关注。本课题组在筛选
到高产溶栓酶菌株，研究有机溶剂对溶栓酶活力影
响时［２］，发现丙酮有许多有别于其他有机溶剂的地
方，因此本实验进一步从动力学的角度深入研究丙
酮对溶栓酶的影响。
１　材料
四肽底物 ＳｕｃＡｌａＡｌａＰｒｏｐＮＡ（上海生物工程
公司）；酵母粉、胰蛋白胨（ＯＸＯＩＤ公司）；其他试剂
均为国产分析纯。
枯草芽孢杆菌溶栓酶制剂以枯草芽孢杆菌 Ｂａ
ｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＬＤ８５４７的发酵液为材料［３］，经硫酸铵
分级，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００凝胶色谱柱分离纯化获得。
２　方法
２１　菌株活化与扩大培养
挑取ＬＢ斜面培养基上菌落，转接到装有５０ｍＬ
ＬＢ的液体培养基中，于恒温振荡培养箱中，３７℃，
２００ｒ·ｍｉｎ－１活化并扩大培养１０～１２ｈ。
２２　产酶培养［４］
将扩大培养后的菌液以２％的接菌量转接至发
酵培养基中，３２℃，１８０ｒ·ｍｉｎ－１，恒温震荡培养，发
酵７２ｈ。发酵培养基配方：４％豆粕粉，２％大米粉，
００４％ ＣａＣｌ２，０４％ Ｋ２ＨＰＯ４· ３Ｈ２Ｏ，０２％
ＫＨ２ＰＯ４，００７％ ＭｇＳＯ４·１０Ｈ２Ｏ，ｐＨ７４。
２３　溶栓酶的纯化［４８］
２３１　盐析　收集发酵液，将其置于４℃，９０００ｒ
·ｍｉｎ－１下，离心２０ｍｉｎ，收集上清液。向上清液中
加入３５％饱和度的硫酸铵，于磁力搅拌器上低温充
分溶解，４℃沉淀７ｈ，同样温度，９０００ｒ·ｍｉｎ－１离
心２０ｍｉｎ，取上清液。再向上清液中加入７０％饱和
度的硫酸铵，置于磁力搅拌器上低温充分溶解，沉淀
过夜，４℃，６０００ｒ·ｍｉｎ－１离心２０ｍｉｎ，取沉淀。将
收集到的沉淀用 ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８０，００５ｍｏｌ·Ｌ－１）
缓冲液溶解。
２３２　透析与浓缩　将沉淀溶解液小心滴入处理
好的透析袋中，夹子封口。至于小盒子中，４℃下蒸
馏水透析，直至 ＢａＣｌ２检查透析水中无 ＳＯ
２－
４ 为止。
用聚乙二醇 ２００００浓缩透析液，待其体积缩小至
１～２ｍＬ，停止浓缩，并收集浓缩液。
２３３　ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００凝胶柱色谱分离纯化　用
电炉将ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００凝胶煮沸，使其充分膨胀，等
到凝胶液降至室温将其装柱，用００１ｍｏｌ·Ｌ－１Ｔｒｉｓ
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ＨＣｌ（ｐＨ８０）缓冲液平衡。连接并打开紫外检测仪
与Ｎ２０００色谱工作站。平衡后，加入浓缩液上样，
调整流速，继续用００１ｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８０）
缓冲液进行洗脱。分管收集活性组分，浓缩后保存。
２４　酶活的测定方法［９］
以四肽ＳｕｃＡｌａＡｌａＰｒｏｐＮＡ为底物，在１００μＬ
的测活体系中，包括 １０μＬ的酶液，５０μＬ的 Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ（ｐＨ８０，００５ｍｏｌ·Ｌ－１）缓冲液和４０μＬ的底
物，在酶标仪上测定波长为４０５ｎｍ时的１ｍｉｎ内光
吸收变化。
２５　丙酮对枯草芽孢杆菌溶栓酶的影响［１０１１］
选择丙酮为效应物，在 １００μＬ的测活体系中
（含１０μＬ酶液，５０μＬ００５ｍｏｌ·Ｌ－１，ｐＨ８０的
ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液，４０μＬ四肽底物），加入不同浓度
的效应物，以不加丙酮为对照，检测酶的剩余活力。
２６　溶栓酶在丙酮中的抑制动力学［１２］
２６１　丙酮对溶栓酶抑制作用机制的判断　以丙
酮为效应物，探讨其抑制枯草芽孢杆菌溶栓酶的作
用机制。在含不同浓度效应物的１００μＬ测活体系
中，固定底物浓度为４０μＬ，改变加入的酶量，测定
酶促反应的初速度。
２６２　丙酮对酶抑制作用类型和抑制常数测定
　以丙酮为效应物，研究其对枯草芽孢杆菌溶
栓酶的抑制作用类型。在 １００μＬ测活体系中，
固定酶的浓度，改变底物浓度，测定不同浓度抑
制剂对酶活力的影响，以 ＬｉｎｅｗｅａｖｅｒＢｕｒｋ双倒
数作图，比较酶催化的动力学参数，包括米氏常
数（Ｋｍ）和最大反应速度（Ｖｍａｘ）的变化来判断抑
制剂的抑制类型。
３　结果与分析
３１　丙酮对枯草芽孢杆菌溶栓酶的影响
选择丙酮为效应物，研究酮对溶栓酶的效应，结
果见图１。丙酮对酶活力的抑制作用显示了明显的
浓度效应。当丙酮浓度增大时，溶栓酶的酶活力损
失越加。低浓度时（＜１０％），酶活力基本以直线形
式下降，待酶活力丧失５０％后，随着丙酮浓度的增
加，酶活力下降程度趋于缓和。
３２　丙酮对溶栓酶的抑制动力学
３２１　丙酮对对枯草芽孢杆菌溶栓酶抑制作用机
制的判断　以丙酮为效应物，探讨其抑制豆豉溶栓
酶的作用机制。在含不同浓度效应物的测活体系
中，固定底物浓度为０５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，改变加入的酶
　　
图１　不同浓度的丙酮对溶栓酶活力的影响
量，测定酶促反应的初速度。结果见图２，酶促反应
速度对酶量作图得到的一组直线，随着效应物浓度
的增大，直线的斜率降低。说明丙酮对酶的抑制作
用属于可逆过程，因为不可逆作用将会导致有效酶
量下降而产生一组平行线。丙酮是通过抑制酶活力
而导致催化效率的降低，而不是通过降低有效的酶
量导致活力的降低。
图２　丙酮对溶栓酶抑制机制的判断
３２２　丙酮对枯草芽孢杆菌溶栓酶抑制作用类型
和抑制常数的测定　研究丙酮对溶栓酶的抑制作用
类型，在测活体系中，固定酶的浓度，改变底物浓度，
测定不同浓度抑制剂对酶活力的影响，以 Ｌｉｎｅｗｅａｖ
ｅｒＢｕｒｋ双倒数作图，判断抑制剂的抑制类型。
３２３　丙酮对溶栓酶的抑制作用类型　依据可逆
竞争抑制动力学模型建立的动力学方程为：
式中Ｖ０为反应初速度，Ｓ为底物，Ｉ为抑制剂，Ｋｉ
为抑制剂常数（实际就是ＥＩＥ＋Ｉ），Ｋｍ为表观米氏
常数（实际为 ＥＳＥ＋Ｓ平衡的解离常数），Ｖｍａｘ为
最大反应速度。这就是说，在给定抑制剂浓度下，作
１／Ｖ０－１／［Ｓ］双倒数图应该是一条直线，且不同抑
制剂浓度下的直线在纵轴上能相交于一点。反过
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来，如果不同抑制剂浓度下１／Ｖ０－１／［Ｓ］双倒数图
具有上述动力学特征（Ｖｍａｘ不变），那么可以认为该
抑制剂为可逆竞争抑制剂，见图３。
图３　丙酮对溶栓酶的抑制作用类型
同样依据可逆非竞争抑制动力学模型建立的动
力学方程为：
式中Ｖ０为反应初速度，Ｓ为底物，Ｉ为抑制剂，Ｋｉ
为抑制剂常数（实际就是ＥＩ＝Ｅ＋Ｉ），Ｋｍ为表观米氏
常数（实际为 ＥＳ＝Ｅ＋Ｓ平衡的解离常数），Ｖｍａｘ为
最大反应速度。非竞争性抑制作用改变Ｖｍａｘ而不影
响Ｋｍ的效应表现在ＬｉｎｅｗｅａｖｅｒＢｕｒｋ图上的特点是：
有抑制剂存在时得到的直线和没有抑制剂存在时的
直线在横轴上交于一点，即横轴截距相等，都是－１／
Ｋｍ，但纵轴截距和直线斜率增大，并将随着［Ｉ］增大
而增大，如果作图得到的双倒数图具有这个特点，那
么可以判断次抑制剂的抑制类型为可逆非竞争性。
图３是不同浓度丙酮下溶栓酶催化底物反应的
初速度对底物浓度的双倒数图。在图中任一指定丙
酮浓度（在抑制浓度区域选点下），数据皆可拟合成
很好的直线。随着丙酮浓度的增加，得到的一簇直
线斜率也增加，各直线交于第二象限一点，说明丙酮
对酶的Ｋｍ值和 Ｖｍａｘ均产生影响，Ｖｍａｘ值随着丙酮的
增大而减小，而Ｋｍ值随着丙酮的增大而增大。对照
上述描述的可逆竞争性抑制特点和可逆非竞争性抑
制特点，判定丙酮对溶栓酶的抑制作用表现为混合
型抑制，而不是竞争性抑制或者非竞争性抑制。
３２４　丙酮对溶栓酶的抑制常数测定　以双倒数
图的各直线斜率及纵轴截距分别对抑制剂作图，测
定抑制常数ＫＩ，ＫＩＳ分别为１２５，３１７ｍｏｌ·Ｌ
－１。
４　讨论
本研究表明，丙酮对溶栓酶有抑制作用，并呈现
浓度效应，随着有机溶剂浓度的增加，酶活力丧失程
度也越多。溶栓酶之所以被丙酮抑制可能是由于它
们都能介入酶分子的内部，改变酶分子所处环境的
介电常数，引起肽链伸展，从而改变了酶活性中心必
需基团所处的微环境极性，影响了酶的催化活性，这
说明酶的活性中心对丙酮敏感。
以丙酮为效应物研究其对溶栓酶的抑制动力学
结果显示，丙酮对溶栓酶的抑制作用属于可逆抑制。
推测丙酮与溶栓酶分子非共价地可逆结合，受丙酮
抑制的酶蛋白可以用透析、或超滤等方法除去以恢
复活性。溶栓酶分子在丙酮中表现为可逆的混合抑
制型。这可能是丙酮不仅能够介入酶分子的内部，
改变酶活性中心必需基团所处的微环境极性，同时
又能与酶活性中心以外的部位结合，甚至还能与酶
底物复合物结合，改变酶催化功能基团的性质，从而
降低溶栓酶的活性。
［参考文献］
［１］　郭颖，孔繁东，祖国仁，等．纳豆激酶溶栓功效及开发应用前
景［Ｊ］．食品工业科技，２００７，２８（３）：２２５．
［２］　汪世华，张晓鹏，陈明，等．有机溶剂和变性剂对枯草芽胞杆
菌溶栓酶活性的影响［Ｊ］．应用与环境生物学报，２００８，１４
（６）：８２５
［３］　ＷａｎｇＳＨ，ＺｈａｎｇＣ，ＹａｎｇＹＬ，ｅｔａｌＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆａｈｉｇｈｆｉ
ｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｉ
ｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｅｄｆｒｏｍＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＬＤ８５４７［Ｊ］
ＷｏｒｌｄＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２４（４）：４７５
［４］　孙月娥，钱和．豆豉纤溶酶生产菌液体发酵条件的优化［Ｊ］．
河南工业大学学报：自然科学版，２００５，２６（６）：４３，４９．
［５］　阎家麒，童岩，臧莹安．豆豉纤溶酶的纯化及其性质研究［Ｊ］．
药物生物技术，２０００，７（３）：１４９．
［６］　韩润林，张小勇，张建安，等．枯草杆菌溶栓酶的分离纯化研
究［Ｊ］．中国生化药物杂志，２０００，２１（５）：２１９．
［７］　姚晓玲，宋卫江，吴思方．豆豉溶栓酶液态发酵工艺研究［Ｊ］．
中国酿造，２００７，４：３８．
［８］　牟光庆，孙园，霍贵成．豆豉纤溶酶产生菌的产酶条件优化
［Ｊ］．中国酿造，２００７，２（３）：３０，６３．
［９］　郭勇．酶工程［Ｍ］．北京：科学出版社，２００４：３，１７，２０７．
［１０］　彭立凤．有机溶剂对酶催化活性和选择性的影响［Ｊ］．化学进
展，２０００，１２３：２９６．
［１１］　姚晓玲，孟凡涛，吴思方．豆豉溶栓酶提取纯化研究［Ｊ］．食品
研究与开发，２００７，２８（８）：７９．
［１２］　刘睿，刘亮，谢笔钧．高粱原花青素对β淀粉酶活力抑制动力
学的研究［Ｊ］．华中农业大学学报，２００６，２５（３）：３２６．
［责任编辑　吕冬梅］
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