全 文 ：补骨脂素的植物雌激素作用及其机制探讨
赵丕文，牛建昭，王继峰，王玲巧
（北京中医药大学 基础医学院，北京 １０００２９）
［摘要］ 目的：利用雌激素受体（ＥＲ）α，β阳性Ｔ４７Ｄ细胞和子宫内膜癌Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞观察补骨脂素的雌激素
样作用，并探讨其可能的作用机制。方法：以１×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１雌二醇（Ｅ２）为阳性对照药，利用ＭＴＴ细胞增殖试验
观察１×１０－５～１×１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素对Ｔ４７Ｄ增殖的影响，同时观察１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１和１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１
补骨脂素对Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞增殖的影响；以半定量ＲＴＰＣＲ法检测１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１和１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素对
Ｔ４７Ｄ细胞雌激素效应基因ＰＲｍＲＮＡ表达情况的影响；并以雌激素受体拮抗剂 ＩＣＩ１８２，７８０为工具药进行干预。
同时，通过流式细胞术检测１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１和１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素引起Ｔ４７Ｄ细胞ＥＲα，ＥＲβ含量的变
化。结果：１×１０－５～１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素能够显著促进Ｔ４７Ｄ细胞增殖；１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１和１×１０－７ｍｏｌ·
Ｌ－１补骨脂素对Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞增殖也有显著的促进作用；ＲＴＰＣＲ结果显示：１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１和１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１
补骨脂素可使Ｔ４７Ｄ细胞ＰＲｍＲＮＡ表达显著增加，表现出雌激素样作用，而且以上效应可被ＩＣＩ１８２，７８０拮抗。１
×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１和１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素还可诱导Ｔ４７Ｄ细胞ＥＲα，ＥＲβ表达明显增加。结论：补骨脂素具
有植物雌激素作用，并且其作用是通过ＥＲ途径介导的。
［关键词］ 补骨脂素；植物雌激素；人乳腺癌细胞；子宫内膜癌细胞；细胞增殖；孕激素受体；雌激素受体
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０１００５９０５
［收稿日期］ ２００６１２１０
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３０５１０４０３２０２）；教育部
“长江学者和创新团队发展计划”（ＩＲＴ０４１３）；教育部博士点基金
（２００５００２６０１２，２００６００２６０１９）
［通讯作者］ 牛建昭，Ｔｅｌ：（０１０）６４２８６７１６，Ｅｍａｉｌ：ｎｉｕｊｚｚ＠
２６３．ｎｅｔ
中草药在妇女保健和妇科病症治疗中有着广泛
的应用，这与其含有具雌激素活性的化学成分密切
相关，这类成分被称为植物雌激素（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）。
而靶组织雌激素受体（ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＲ）亚型的
种类及相对含量影响着雌激素，包括植物雌激素的
生物学效应。作为传统的补虚药，补骨脂是豆科草
本植物补骨脂的果实，补肾壮阳。本实验室在以前
的整体动物实验中曾观察到：补骨脂具有雌激素样
作用［１］。而中药所含活性成分是中药用于防治疾
病的物质基础［２］。本实验选取了补骨脂所含有的
一种重要活性成分：补骨脂素（ｐｓｏｒａｌｅｎ）作为研究对
象，直接观察它们对雌激素依赖性人乳腺癌细胞
（Ｔ４７Ｄ）和子宫内膜癌（Ｉｓｈｉｋａｗａ）细胞的雌激素样
作用，并检测其引起 Ｔ４７Ｄ细胞雌激素受体亚型表
达的变化情况，为揭示其发挥雌激素样作用的机制
提供依据，并为指导妇科临床用药，特别是为更年期
妇女保健及乳腺癌等雌激素依赖性肿瘤患者的用药
提供参考。
１ 材料
１．１ 试剂 ＤＭＥＭ（高糖）（批号 ＮＲＦ００１４）、无酚红
ＤＭＥＭ（高糖）（批号ＡＲＥ２６２８３）、活性炭葡聚糖苷处
理的胎牛血清（ＣＤＴＦＢＳ）为Ｈｙｃｌｏｎｅ公司产品；小牛血
清购自中国医学科学院生物工程研究所灏洋生物（批
号 ＴＢＤ００３２ＨＹＰ）；雌 二 醇 （ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，Ｅ２）（批 号
０３５Ｋ０９６９），ＭＴＴ，ＤＭＳＯ为Ｓｉｇｍａ公司产品；ＥＲα，ＥＲβ
抗体为Ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司产品（批号Ｊ０５０５）；ＦＩＴＣ标记羊
抗鼠ＩｇＧ购自ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ公司；Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒提供
及ＰＣＲ引物合成为北京赛百胜基因技术有限公司；雌
激素受体拮抗剂ＩＣＩ１８２，７８０为Ｔｏｃｒｉｓ公司产品；一步
法ＲＴＰＣＲ试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司（批号２１５７８３）。
１．２ 药物 补骨脂素购自中国生物制品检定所，批
号１１０７３９，纯度９８％；实验时以无水乙醇溶解，加药
后乙醇终含量为０．１％～１％。
１．３ 细胞株 人乳腺癌 Ｔ４７Ｄ细胞购自凯基生物
科技发展有限公司；子宫内膜癌 Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞由本
实验室保存并传代。
１．４ 仪器 ＣＯ２培养箱（Ｂｉｎｄｅｒ）；酶联免疫检测仪
（ＥＰＳＯＮＬＸ－８００）；倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ）；ＰＣＲ仪
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（ＭＪ）；凝胶成像分析仪（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；流式细胞仪
（ＢＤ）。
２ 方法
２．１ 细胞培养 人乳腺癌细胞 Ｔ４７Ｄ和子宫内膜
癌细胞 Ｉｓｈｉｋａｗａ，常规培养在含 １０％小牛血清的
ＤＭＥＭ高糖溶液中，培养条件为３７℃，５％ ＣＯ２，相
对饱和湿度。实验开始前４ｄ将细胞用 ＰＢＳ洗涤２
次后，改为在无酚红 ＤＭＥＭ（含５％ ＣＤＴＦＢＳ）中培
养，以耗尽细胞内储存的雌激素。
２．２ ＭＴＴ细胞增殖试验 Ｔ４７Ｄ细胞传代３次，经无
酚红ＤＭＥＭ（含５％ ＣＤＴＦＢＳ）培养４ｄ后，选取对数
生长期细胞，用０２５％胰蛋白酶消化，ＰＢＳ洗涤２次，
加入无血清ＤＭＥＭ，以２×１０３个／孔的细胞密度接种
于９６孔板内，每孔培养液总体积为２００μＬ。培养２４
ｈ待细胞贴壁后，换为含１×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１Ｅ２或１×
１０－５～１×１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素的ＤＭＥＭ培养液中
继续培养；拮抗组同时加入 １×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１ＩＣＩ
１８２，７８０；每种受试物均设６个复孔。分别于２４，４８ｈ
时，加入ＭＴＴ（５ｍｇ·ｍＬ－１，１５μＬ／孔），继续孵育４
ｈ，吸去培养液，加入ＤＭＳＯ１５０μＬ。以ＤＭＳＯ调零，
用酶联免疫检测仪在５７０ｎｍ下测定各孔吸光度（Ａ），
计算平均Ａ值和增殖率（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅ，ＰＲ）。
ＰＲ（％）＝（实验组Ａ／溶剂对照组Ａ）×１００％
Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞增殖试验步骤及结果测定与上述
Ｔ４７Ｄ细胞相同，干预药物为１×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１Ｅ２或
１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１和 １×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素。
２．３ ＲＴＰＣＲ法检测ＰＲｍＲＮＡ表达 取经无酚红
ＤＭＥＭ（含５％ ＣＤＴＦＢＳ）培养４ｄ的Ｔ４７Ｄ细胞，以
５×１０５个／瓶的细胞密度接种于 ２５ｃｍ２的培养瓶
中，以无血清ＤＭＥＭ接种２４ｈ待细胞贴壁后，换为
含１×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１Ｅ２或１×１０
－６～１×１０－７ｍｏｌ·
Ｌ－１补骨脂素的ＤＭＥＭ培养液；拮抗组同时加入１×
１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１ＩＣＩ１８２，７８０。继续培养４８ｈ后，终止
培养并收获细胞，利用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ，并进
行ＲＮＡ纯度和浓度测定；ＲＴＰＣＲ反应：按照试剂
盒说明书进行；引物序列如下：内参 βａｃｔｉｎ正引物
序列为：５′ＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＧ３′；负引
０物序列为：５′ＣＡＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧ３′，
扩增片段为２４２ｂｐ；ＰＲ正引物序列为：５′ＡＧＴＴＧＴ
ＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＴＧＣ３′；负 引 物 序 列 为：５′
ＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＣ３′，扩增片段为 ４７５
ｂｐ。ＰＣＲ产物分析：２％琼脂糖凝胶电泳，电泳条带
密度扫描，进行半定量分析。
２．４ 流式细胞术检测 ＥＲα，ＥＲβ含量的变化
Ｔ４７Ｄ细胞培养及接种同２．３。接种２４ｈ待细胞贴
壁后，换为含１×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１Ｅ２或１×１０
－６ｍｏｌ·
Ｌ－１和１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素的 ＤＭＥＭ培养
液。４８ｈ收获细胞后，ＰＢＳ洗涤；４％多聚甲醛室温
固定２０ｍｉｎ；ＰＢＳ洗涤２次；用含０５％皂素和５％
血清的 ＰＢＳ重悬细胞，冰上孵育２０ｍｉｎ；分别加入
ＥＲα，ＥＲβ抗体（１∶２００），冰上孵育４０ｍｉｎ；ＰＢＳ洗
涤；加入工作浓度 ＦＩＴＣ标记羊抗鼠 ＩｇＧ，冰上避光
放置４０ｍｉｎ；ＰＢＳ洗涤，１％多聚甲醛重悬，１ｈ内流
式细胞仪检测。
２．５ 数据统计 结果均用 珋ｘ±ｓ表示，用ＳＰＳＳ１１０
软件进行数据处理，用ｔ检验进行统计学分析。
３ 结果
３．１ ＭＴＴ细胞增殖试验 表１可见，与溶剂对照
组相比，１×１０－５～１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素作用
２４，４８ｈ，表现出对 Ｔ４７Ｄ细胞增殖具有明显的促进
作用，作用趋势与 Ｅ２相似，而且呈现出剂量效应关
系。
表１ ＭＴＴ法检测补骨脂素对Ｔ４７Ｄ细胞增殖的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别
剂量
／ｍｏｌ·Ｌ－１
２４ｈ
Ａ ＰＲ／％
４８ｈ
Ａ ＰＲ／％
溶剂对照 － ０４１７±００２ １００００±０００ ０７２８±００６ １００００±０００
雌二醇 １×１０－８ ０４７５±００４２） １１３９１±９４３２） ０８９３±０１０２） １２２６６±１４３７２）
补骨脂素 １×１０－９ ０４０９±００２ ９８０８±４４９ ０７５９±００７ １０４２６±９１７
１×１０－８ ０４２１±００４ １００９６±８４６ ０７９１±００２ １０８６５±２５５
１×１０－７ ０４５３±００２１） １０８６３±４５５２） ０８４４±００８１） １１５９３±１１１９１）
１×１０－６ ０４７１±００１２） １１２９５±２０９２） ０８７６±００８２） １２０３３±１１４４２）
１×１０－５ ０４４５±００５ １０６７１±１１４３ ０８２９±００６１） １１３８７±７６３２）
注：与溶剂对照组相比１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１（表２同）
Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞增殖试验结果表明：与溶剂对照 组结果０６４４±００７８相比，１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１Ｅ２可
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使细胞增殖明显加速，吸光度上升为 ０８７３±
００９８，增殖率为１３５６％；１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１和１×
１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素作用４８ｈ，吸光度分别上升
至０７５０±００５和 ０７２５±００７，增殖率分别为
１１６５％和１１２６％，即对细胞增殖也具有显著的促
进作用，但幅度稍低于对Ｔ４７Ｄ的作用。
３．２ ＩＣＩ１８２，７８０对补骨脂素促细胞增殖效应的拮
抗作用 当同时在 Ｔ４７Ｄ细胞增殖试验中１×１０－８
ｍｏｌ· Ｌ－１Ｅ２组和增殖效应显著的 １×１０
－６ｍｏｌ·
Ｌ－１补骨脂素作用４８ｈ组加入雌激素受体拮抗剂
ＩＣＩ１８２，７８０后，Ｅ２和补骨脂素的促细胞增殖作用被
完全拮抗，吸光度分别下降至 ０７１４±００７和
０７３７±００８，与溶剂对照组相比无显著性差异。
３．３ ＲＴＰＣＲ法检测 ＰＲｍＲＮＡ表达 图１显示，
选取上述Ｔ４７Ｄ细胞增殖试验中效应较为显著的４８
ｈ作为检测时间点，补骨脂素剂量分别为１×１０－６
ｍｏｌ·Ｌ－１和１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１。ＲＴＰＣＲ结果表明：
与溶剂对照组结果（ＥＢ荧光值为 １４５±００５）相
比，Ｅ２可诱导雌激素效应基因 ＰＲ表达水平显著增
高，ＥＢ荧光值为４７７±０２３；补骨脂素的效应与Ｅ２
类似，１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１和１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂
素均可显著提高 ＰＲｍＲＮＡ表达水平，依次提高为
３７１±０１６和４５９±０１６（Ｐ＜００１）。同时加入
ＩＣＩ１８２，７８０后，Ｅ２和１×１０
－６ｍｏｌ· Ｌ－１补骨脂素作
用４８ｈ引起ＰＲ表达增高的效应均被显著抑制；荧
光值分别下降为 ２０３±００９和 ２６２±０１１（Ｐ＜
００１）。
图１ 补骨脂素对Ｔ４７Ｄ细胞ＰＲｍＲＮＡ表达的影响
１．ＥｔＯＨ；２．Ｅ２１×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１；
３．补骨脂素１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１；４．补骨脂素１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１；
５．Ｅ２１×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１＋１×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１ＩＣＩ１８２，７８０；
６．补骨脂素１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１＋１×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１ＩＣＩ１８２，７８０；
Ｍ：ＤＮＡ标准品
３．４ 流式细胞术对Ｔ４７Ｄ细胞ＥＲα，ＥＲβ表达的检
测结果 表２显示，与溶剂对照组相比，Ｅ２可诱导Ｔ４７Ｄ
细胞ＥＲα和ＥＲβ表达水平显著增高；１×１０－６ｍｏｌ·
Ｌ－１和１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１补骨脂素的作用与Ｅ２类似，也
可显著提高ＥＲα和ＥＲβ表达水平，与溶剂对照组相
表２ 补骨脂素对Ｔ４７Ｄ细胞ＥＲα和ＥＲβ表达的影响
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
组别
剂量
／ｍｏｌ·Ｌ－１
ＥＲα ＥＲβ
溶剂对照 － ６８３±０２４ ６６３±０３７
雌二醇 １×１０－８ １１８２±０４８２） ９２５±０３３２）
补骨脂素 １×１０－７ １１４４±０５３２） ９９１±０４２２）
１×１０－６ １２５７±１０３２） １０３４±０３９２）
比均有显著性差异，并呈现一定的剂量依赖性。
４ 讨论
中草药植物在妇女保健和妇科疾病的治疗中有
着广泛的应用，这与其所含植物雌激素成分的药效
作用密切相关［３］。据统计，具有雌激素活性的中药
主要集中在植物药，而补益药在其中占有的比例最
大［４］，补骨脂即是其中重要的一种。补骨脂素是补
骨脂所含的一种具有重要生物活性的药化组分，属
于呋喃香豆素类化合物，香豆素是植物雌激素中的
重要一类［５］。
应用体外细胞培养，通过检测药物与雌激素依
赖性肿瘤细胞增殖间的关系，可反映出药物的雌激
素样作用［６］。同时，雌激素将通过与受体结合，并
进而与位于靶基因启动子区域的雌激素反应元件
（ＥＲＥ）结合，调控靶基因的表达。孕激素受体（ＰＲ）
基因即属于上述雌激素效应基因或靶基因，其 ｍＲ
ＮＡ表达水平可作为评价受试物是否具有雌激素样
作用的检测指标［７］。本实验中，在雌激素耗竭的情
况下，细胞ＭＴＴ增殖试验结果表明，补骨脂素具有
与雌激素类似的促 ＥＲ阳性细胞增殖的作用，且呈
现出明显的剂量效应关系。同时，通过比较相同浓
度补骨脂素作用４８ｈ，影响 Ｔ４７Ｄ和 Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞
增殖试验的结果可以发现：Ｅ２对 Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞的促
增殖作用更为明显，而补骨脂素对 Ｔ４７Ｄ细胞的促
增殖作用更为显著。作者在以往的实验中曾发现：
虽然是雌激素受体２种亚型：ＥＲα和 ＥＲβ双阳性
细胞，但正常情况下 Ｔ４７Ｄ细胞 ＥＲα与 ＥＲβ表达
比例约为２６６４［８］；而据文献报道：Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞中
ＥＲα与ＥＲβ表达比例约为３０５５［９］；即与Ｉｓｈｉｋａｗａ
细胞相比，Ｔ４７Ｄ细胞ＥＲβ表达较强，而 ＥＲα表达
相对较弱。同时，也有文献表明：Ｅ２与 ＥＲα亲和力
更高［１０］，而多数植物雌激素往往与 ＥＲβ亲和力更
高［１１］。因此，本研究中 Ｅ２对 ＥＲα表达较强的 Ｉｓｈ
ｉｋａｗａ细胞的促增殖作用更为明显，而补骨脂素对
ＥＲβ表达较强的 Ｔ４７Ｄ细胞的促增殖作用更为显
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著的实验结果，与文献报道是相一致的，也进一步证
实了植物雌激素更多地将通过ＥＲβ发挥作用。
ＲＴＰＣＲ结果显示：补骨脂素可增加 Ｔ４７Ｄ细胞
雌激素效应基因ＰＲｍＲＮＡ的表达。而且上述促增
殖和诱导ＰＲ表达增强的效应均可被雌激素受体拮
抗剂ＩＣＩ１８２，７８０所拮抗，进一步说明补骨脂素发挥
上述作用是通过ＥＲ介导的。
Ｔ４７Ｄ细胞虽然为 ＥＲ阳性细胞，但在雌激素
耗竭的情况下，因雌激素水平过低将导致 ＥＲ亚型
表达水平相对较低。此时加入外源性雌激素可诱
导细胞内 ＥＲα和 ＥＲβ表达水平显著提高。有研
究表明：因与雌二醇结构相似，多种植物雌激素也
可影响靶细胞 ＥＲα和 ＥＲβ水平［１２］。曾有文献
报道：包括补骨脂在内的补肾中药可提高去卵巢
大鼠骨组织内 ＥＲ表达，发挥雌激素样作用［１３］。
本实验中补骨脂素对 Ｔ４７Ｄ细胞 ＥＲα和 ＥＲβ表
达的影响也与雌激素类似，即也可明显提高二者
的表达水平。但与雌二醇相比，补骨脂素活化 ＥＲ
β的能力相对较强，而对 ＥＲα表达的升高作用不
及 ＥＲβ。这与文献报道另一种植物雌激素槲皮素
对 ＥＲ亚型的影响相似［１４］。但因由 ＥＲα和 ＥＲβ
介导的下游基因并不完全相同［１５］，所以补骨脂素
通过影响 ＥＲα和 ＥＲβ水平而产生的间接效应还
需进一步研究。此外，女性在衰老或绝经后，除体
内雌激素水平降低之外，各组织的 ＥＲｓ水平亦下
降。上述实验结果提示：补骨脂素在体内也可能
具有提高组织 ＥＲｓ表达水平的作用，从而达到缓
解更年期综合征的疗效。
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ｓｔｒｅａｍｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐ
ｔｏｒαｏｒβ［Ｊ］．ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ，２００４，７１（４）：１２５２．
Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃｅｆｅｃｔｓａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｓｏｒａｌｅｎ
ＺＨＡＯＰｉｗｅｎ，ＮＩＵＪｉａｎｚｈａｏ，ＷＡＮＧＪｉｆｅｎｇ，ＷＡＮＧＬｉｎｇｑｉａｏ
（ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２９，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｏｂｓｅｒｖｅａｎｄｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃｅｆｅｃｔｓａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｓｏｒａｌｅｎｉｎｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ
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第３３卷第１期
２００８年１月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １
Ｊａｎｕａｒｙ，２００８
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｐｓｏｒａｌｅｎ；ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ；Ｔ４７Ｄ；ｉｓｈｉｋａｗａｃｅｌ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００６１０２０
［基金项目］ 浙江省中医药重点项目研究计划（２００７ＺＡ０１５）
［通讯作者］ 陈君柱，Ｔｅｌ：（０５７１）８７２３６５００，Ｆａｘ：（０５７１）
８７２３６８８９，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｊｚ０１＠１６３．ｃｏｍ
大黄素对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌
细胞增殖的影响
杨雨民１，王世君１，金丹丹２，刘云英２，王兴祥１，陈君柱１
（１．浙江大学 医学院 附属第一医院 心内科，浙江 杭州 ３１０００３；
２．浙江大学 病原微生物实验室，浙江 杭州 ３１００３１）
［摘要］ 目的：观察大黄素对血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）诱导血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的影响及机制。方法：
斑贴法培养大鼠主动脉ＶＳＭＣ，ＡｎｇⅡ刺激ＶＳＭＣ建立细胞增殖模型。采用ＭＴＴ法检测细胞增殖，观察大黄素（１０，
２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１）、亚硝基精氨酸甲酯（ＬＮＡＭＥ，１００μｍｏｌ·Ｌ－１）对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ增殖的影响。免疫组化
法检测增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达；硝酸还原酶及化学比色法测细胞上清液中一氧化氮（ＮＯ）、一氧化氮合酶
（ＮＯＳ）、诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）水平。半定量逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测 ＶＳＭＣｉＮＯＳｍＲＮＡ的表
达。结果：大黄素在１０～８０μｍｏｌ·Ｌ－１呈剂量及时间依赖性抑制ＶＳＭＣ增殖，但可被１００μｍｏｌ·Ｌ－１的ＬＮＡＭＥ部
分抵消；大黄素能减少ＰＣＮＡ阳性细胞表达，升高 ＮＯ，ＮＯＳ，ｉＮＯＳ水平，增加 ｉＮＯＳｍＲＮＡ的表达。结论：大黄素对
ＡｎｇⅡ诱导的ＶＳＭＣ增殖有抑制作用，抑制ＶＳＭＣＰＣＮＡ的表达，上调 ｉＮＯＳ基因表达，升高 ＮＯ水平可能是其发挥
作用的机制。
［关键词］ 大黄素；血管紧张素Ⅱ；血管平滑肌细胞；一氧化氮；一氧化氮合酶
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０１００６３０５
血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）异常增殖是许多心血
管疾病的共同病理过程，是高血压血管重构、动脉硬
化、血管成形术后再狭窄主要病因之一。血管紧张
素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）是一种重要的血管活性物质，可以自
分泌和旁分泌的方式作用于ＶＳＭＣ，促进其增殖［１］，
因此抑制ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ增殖可预防许多心血管
疾病的发生及发展。大黄是我国常用的传统中药，
具有“活血化瘀，泻下攻积”的功效，在心血管疾病
中应用很广。大黄素（ｅｍｏｄｉｎ）是从大黄中提取的
有效成分，属蒽醌类衍生物。研究表明，大黄素对
ＶＳＭＣ等多种细胞增殖有抑制作用［２４］，但其作用机
制尚不明确。研究结果显示：激活 ｐ５３途径［５］；下
调细胞周期蛋白 Ｄ１表达，阻滞细胞周期的进程
［６］；
增加过氧化物歧化酶，降低自由基水平［４］等可能是
其发挥作用的机制。为进一步研究大黄素抑制
ＶＳＭＣ增殖的机制，作者通过体外培养大鼠 ＶＳＭＣ，
观察大黄素对 ＡｎｇⅡ诱导 ＶＳＭＣ增殖的影响，并探
讨与一氧化氮（ＮＯ）信号通路的关系。
１ 材料
１．１ 动物 ４只６周雄性ＳＤ大鼠，体重（１２０±１０）
ｇ，浙江省医学科学院提供，动物合格证号医动字第
０２２３８。
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第３３卷第１期
２００８年１月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １
Ｊａｎｕａｒｙ，２００８