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Vol.34，Issue 4
February，2009
第 34 卷第 4 期
2009 年 2 月
HPLC 测定萹蓄中槲皮素和山柰素的含量
陈 娟，师彦平*
（中国科学院 兰州化学物理研究所 甘肃省天然药物重点实验室，甘肃 兰州 730000）
[摘要] 目的：建立同时测定中药萹蓄中槲皮素和山柰素含量的高效液相色谱方法。方法：采用 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×
250 mm，5 µm），以甲醇-0.1%磷酸溶液（65∶35）为流动相，流速 1.0 mL⋅min-1，检测波长为 366 nm。对样品提取和水解过
程中的各个影响因素进行了考察。结果：甲醇是萹蓄中槲皮素和山柰素的最佳提取溶剂，65%甲醇是槲皮素和山柰素及其苷的
最佳提取溶剂，优化的水解条件为采用 4.0 mol⋅L-1盐酸溶液，80 ℃水浴上水解 1.0 h。槲皮素和山柰素分别在 0.58∼362，0.51∼320
mg⋅L-1峰面积与浓度呈良好的线性关系（r=0.999 9），最低检出限分别为 0.03，0.02 mg⋅L-1；平均加样回收率分别为 99.7%和
99.0%，RSD 分别为 1.7%和 3.9%。结论：该方法简便、准确、重现性好，可用于中药萹蓄的质量控制。
[关键词] 高效液相色谱；萹蓄；槲皮素；山柰素

中药萹蓄为蓼科植物萹蓄 Polygonum aviculare
L.的干燥地上部分，具有利尿通淋，杀虫止痒的功
能，用于膀胱热淋，小便短赤，淋利涩痛，皮肤湿
疹，阴痒带下等。萹蓄中富含黄酮类化合物，如从
萹蓄中分离出山柰素，槲皮素，杨梅树皮素，胡桃
宁，槲皮苷，萹蓄苷、黄芪苷、杨梅树皮苷等[1-3]。
目前萹蓄多以槲皮素，萹蓄苷、金丝桃苷、木犀草
素等黄酮类化合物作为其质量控制的指标成分[4-6]，
但尚未将山柰素纳入其质量控制指标成分中。2005
年版《中国药典》一部对萹蓄的质量控制仅采用薄
层色谱法以槲皮素为对照进行鉴别，无含量测定
项。为了提高萹蓄的质量标准，更好地控制药材质
量，该实验首次建立了萹蓄中槲皮素和山柰素的高
效液相色谱含量测定方法。
1 仪器与试药
Waters 高效液相色谱仪，包括δ-600E 四元梯度
泵，WAT033381 手动进样器（25 µL），2996 型二
极管阵列检测器，Millennium32 色谱工作站；槲皮
素对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定
所，批号 10081-9905）；山柰素对照品（供含量测
定 用 ， 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 ， 批 号
0861-200002）；萹蓄购自于甘肃复兴厚第一药庄，

[收稿日期] 2008-07-03
[基金项目] 国家科技支撑计划项目（2007AA09Z403）；中国科学院科
技支撑项目
[通信作者] ∗师彦平，Tel：(0931)4968208，Fax：（0931）8277088，
E-mail: shiyp@lzb.ac.cn
[作者简介] 陈娟，副研究员，博士，从事天然药物分离分析研究。
经甘肃省药品检验所朱俊儒副主任药师鉴定；甲醇
为色谱纯，水为重蒸水，磷酸、盐酸均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），
流动相 甲醇-0.1%磷酸溶液(65∶35)；流速 1.0
mL⋅min-1；柱温室温；检测波长 366 nm；进样量 10
µL。在流动相的优化中，选用了甲醇-0.1%磷酸体
系并以不同配比（70∶30，65∶35，62∶38，60∶
40）进行试验，结果随着甲醇体积分数的降低，槲
皮素和山柰素的保留时间增加，并与杂质峰的分离
度增大，当甲醇体积分数降低到 65%时，与杂质峰
达到基线分离（图 1），为获得好的分离效果和短
的分离时间，最终选定流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液
（65∶35）。


1. 槲皮素；2. 山柰素。
图 1 甲醇-0.1%磷酸溶液不同配比条件
下样品的 HPLC 图


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2.2 线性关系的考察
精密称取槲皮素对照品 3.62 mg，山柰素对照
品 3.20 mg（准确至±0.01 mg），分别置于 10 mL
量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作
为槲皮素对照品贮备液和山柰素对照品贮备溶液。
从槲皮素和山柰素对照品贮备溶液中分别吸取 1
mL，用甲醇作梯度稀释，得 72.40，14.48，2.90，
0.58 mg⋅L-1的槲皮素对照品溶液和 64.00，12.80，
2.56，0.51 mg⋅L-1 的山柰素对照品溶液。分别精密
吸取槲皮素和山柰素的对照品贮备溶液和稀释液
各 10 µL 注入高效液相色谱仪，测定槲皮素和山柰
素峰面积值。以峰面积值（A）为纵坐标，对照品
浓度（C，mg⋅L-1）为横坐标，绘制标准曲线，得槲
皮素的回归方程为 A=73 575.65 C-73 100.42，r=
0.999 9；山柰素的回归方程为 A=60 617.79 C-
79 634.34，r=0.999 9。结果表明，槲皮素和山柰素
分别在 0.58∼362，0.51∼320 mg⋅L-1 峰面积值与进样
浓度有良好的线性关系。按信噪比 S/N=3，最低检
出限分别为 0.03，0.02 mg⋅L-1。
2.3 仪器精密度试验
精密吸取混合对照品溶液（槲皮素 18.10 mg⋅L-1
和山柰素 16.00 mg⋅L-1）10 µL，重复进样 5 次，测
定峰面积值，求得槲皮素和山柰素 RSD 分别为
0.7%，0.9%，仪器精密度良好。
2.4 供试品水解条件的考察
取萹蓄药材，粉碎，过三号筛，称取 20.0 g，
加入甲醇，加热回流 2 次，每次甲醇用量 200 mL，
回流时间 1 h，提取液浓缩并转移至 200 mL量瓶中，
用甲醇定容，摇匀，滤过，取滤液进行以下试验。
2.4.1 盐酸浓度的优化 精密吸取滤液数份，每份
15 mL，分别加入 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，8.0 mol⋅L-1
盐酸溶液 5 mL，80 ℃水浴回流 1 h，取出，立即冰
水冷却 5 min，放置至室温，转移至 25 mL 量瓶中，
用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液进样测定，
考察盐酸溶液浓度对槲皮素和山柰素含量的影响
（图 2）。
由图 2 可知，随着盐酸溶液浓度的增加，槲皮
素和山柰素含量也增加，3.0，4.0 mol⋅L-1 时达到最
大，但增加到 8.0 mol⋅L-1 时，含量有所下降。
2.4.2 水解时间的优化 精密吸取滤液数份，每份
15 mL，分别加入 2.0，4.0 mol⋅L-1 盐酸溶液 5 mL，

图 2 盐酸溶液浓度对槲皮素和山柰素含量的影响

80 ℃水浴分别回流 0.5，1.0，1.5，2.0 h，按 2.1 项
下色谱条件测定，考察水解时间对槲皮素和山柰素
含量的影响（图 3）。盐酸溶液浓度为 2.0 mol⋅L-1
时，槲皮素和山柰素含量在水解 1.5 h 时达到最大，
浓度为4.0 mol⋅L-1时，在水解1.0 h时含量达到最大，
从节省时间的角度，确定盐酸溶液浓度为 4.0
mol⋅L-1，水解时间 1.0 h。

图 3 水解时间对槲皮素和山柰素含量的影响

2.4.3 水解温度的优化 精密吸取滤液数份，每份
15 mL，分别加入 4.0 mol⋅L-1 盐酸溶液 5 mL，60，
70，80，90，100 ℃水浴回流 1.0 h，按 2.1 项下色
谱条件测定，考察水解温度对槲皮素和山柰素含量
的影响（图 4）。槲皮素和山柰素含量随着水解温
度的增加而增加，80 ℃时达到最大，因此，水解温
度确定为 80 ℃。

图 4 水解温度对槲皮素和山柰素含量的影响

2.5 供试品提取条件的考察
2.5.1 提取溶剂的优化 称取 4 份粉碎萹蓄药材，


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每份 2.5 g，分别用甲醇、85%甲醇、65%甲醇、45%
甲醇回流提取 2 次，每次 0.5 h，提取液浓缩并定容
至 25 mL，摇匀，过滤，取滤液进样测定，考察提
取溶剂对未水解样品中槲皮素和山柰素（游离态）
含量的影响。另吸取上述滤液 15 mL，加入 4.0
mol⋅L-1 盐酸溶液 5 mL，80 oC 水浴回流 1.0 h，按上
述方法测定，考察提取溶剂对提取物水解后样品中
槲皮素和山柰素（包括游离态和结合态）含量的影
响(表 1)。
表 1 甲醇浓度对未水解和水解后样品中槲皮素
和山柰素质量分数的影响 mg·g-1
槲皮素 山柰素 甲醇
/% 未水解 水解后 未水解 水解后
100% 0.12 0.75 0.053 0.19
85% 0.11 0.95 0.047 0.20
65% 0.10 0.99 0.045 0.21
45% 0.08 0.96 0.038 0.18

由表 1 可知，对于未水解样品中的槲皮素和山
柰素而言，其含量随着甲醇浓度的降低而降低，但
是对于水解后样品而言，其含量反而随着甲醇浓度
的降低而升高，65%时达到最大，因此，选择甲醇
作为萹蓄中游离槲皮素和山柰素的提取溶剂，65%
甲醇作为测定游离和结合态共存槲皮素和山柰素
的提取溶剂。
2.5.2 提取次数的优化 称取 4 份粉碎萹蓄药材，
每份 2.5 g，分别用甲醇回流提取 1 次、2 次、3 次、
4 次，每次 0.5 h，提取液过滤，按上述方法测定，
考察提取次数对未水解样品和水解后样品中槲皮
素和山柰素含量的影响（表 2）。
表 2 提取次数对未水解和水解后样品中槲皮素和山柰素
质量分数的影响 mg·g-1
槲皮素 山柰素 提取
次数 未水解 水解后

未水解 水解后
1 次 0.07 0.47 0.038 0.10
2 次 0.10 0.75 0.053 0.19
3 次 0.11 0.85 0.053 0.21
4 次 0.12 0.85 0.053 0.21

由表 2 可知，随着提取次数的增加，提取液中
槲皮素和山柰素的含量增加，但提取 3 次后，含量
几乎不再随提取次数的增加而增加，说明提取 3 次
后，已基本完全。因此，确定提取次数为 3 次。
2.6 供试品溶液的制备
取萹蓄药材，粉碎，过三号筛，称取 2.5 g，用
甲醇回流提取 3 次，每次 0.5 h，提取液浓缩并定容
至 25 mL，摇匀，过滤，取滤液作为测定萹蓄中游
离槲皮素和山柰素的供试品溶液。另取萹蓄药材 2.5
g，用 65%甲醇回流提取 3 次，每次 0.5 h，提取液
浓缩并定容至 25 mL，摇匀，过滤，吸取滤液 15 mL，
加入 4.0 mol⋅L-1 盐酸溶液 5 mL，80 oC 水浴回流 1.0
h，取出，立即冰水冷却 5 min，放置至室温，转移
至 25 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，
取滤液作为测定萹蓄中游离和结合态的槲皮素和
山柰素的供试品溶液。
2.7 重复性试验
称取 10 份粉碎的萹蓄药材，按供试品溶液制
备方法制备，每一样品分别进样 2 次，取峰面积平
均值进行计算，测得萹蓄中游离槲皮素和山柰素的
平均质量分数分别为 0.11，0.053 mg⋅g-1，RSD 分别
为 4.0%，1.6%；测得萹蓄中游离和结合态的槲皮素
和山柰素的平均质量分数分别为 1.02，0.23 mg⋅g-1，
RSD 分别为 1.8%和 3.7%（图 5）。

A. 对照品；B. 未水解样品；C. 水解后样品；
1. 槲皮素；2. 山柰素。
图 5 对照品和样品的 HPLC 图

2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的萹蓄 5 份，分别加入槲皮


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素对照品溶液（1.64 g⋅L-1）和山柰素对照品溶液
（0.39 g⋅L-1）各 1 mL，按供试品溶液制备方法（需
水解）制备，依上述色谱条件测定，计算回收率，
结果见表 3。
表 3 槲皮素和山柰素加样回收率
化合物 样品中量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
1.56 1.64 3.15 97.0
1.53 1.64 3.15 98.8
1.54 1.64 3.19 100.6
1.55 1.64 3.17 98.8
槲皮素
1.54 1.64 3.20 101.2
99.3 1.7
0.35 0.39 0.72 94.9
0.35 0.39 0.74 100.0
0.35 0.39 0.75 102.6
0.35 0.39 0.72 94.9
山柰素
0.35 0.39 0.75 102.6
99.0 3.9

3 讨论
采用二极管阵列检测器对进样后的槲皮素和
山柰素对照品进行扫描，结果槲皮素在 255，368 nm
处有最大吸收，山柰素在 266，365 nm 处有最大吸
收，但 368 nm（365 nm）处的吸收值比 255 nm（266
nm）处的大，为了获得更高的灵敏度，选择 366 nm
作为槲皮素和山柰素的检测波长。
通过酸水解，槲皮素和山柰素的含量大大提
高，说明槲皮素和山柰素在萹蓄药材中是以苷（结
合态）和苷元（游离态）2 种形式存在。本试验建
立的方法既可以直接测定萹蓄药材中游离态的槲
皮素和山柰素含量，也可以通过酸水解测定以游离
态和结合态两种形式混合存在的槲皮素和山柰素
含量。文献报道的关于其酸水解的条件不尽一
致[7-10]，故此，本试验对酸水解过程中的相关影响
因素酸浓度、水解时间、水解温度进行了详细考察，
获得了优化条件。
从提取溶剂的优化结果看，对未水解样品而
言，甲醇提取效果最好，而对水解后样品而言，65%
甲醇提取效果最好，这一结果与槲皮素和山柰素在
萹蓄药材中的不同存在形式相关，即在未水解样品
中，提取溶剂仅针对槲皮素和山柰素苷元成分，因
此纯甲醇的溶解性能和提取效果最好，而对于水解
后样品，提取溶剂针对槲皮素和山柰素苷元以及它
们的葡萄糖苷 2 种形式，为此，含水甲醇的溶解性
能和提取效果均优于纯甲醇。
[参考文献]
[1] 陈晓虎，陈道峰. 萹蓄的化学成分研究[J]. 中国中药杂志，2004，
29（9）：918.
[2] 于兆海，孙 结. 萹蓄的化学成分研究[J].中草药，2002，23（6）：
498.
[3] 赵爱华，赵勤实，林中文，等. 萹蓄的化学成分研究[J]. 天然产
物研究与开发，2002，14（5）：29.
[4] 胥秀英，郑一梅，傅善权，等. 高效液相色谱法测定萹蓄中金丝
桃苷等 3 种有效成分的含量[J]. 时珍国医国药，2006，17（4）：
563.
[5] 赵会礼，唐声武，郭 力. 高效液相色谱法测定四川产两种萹蓄
中槲皮素的含量[J]. 中医药学报，2004，32（1）：17.
[6] 徐礼燊，刘爱茹. 萹蓄中萹蓄苷的含量测定[J]. 药学学报，1983，
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[7] 杨燕飞. HPLC 测定金胆片中山柰素和槲皮素的含量[J]. 中成药，
2005，27（11）：1263.
[8] Dinelli G，Bonetti A，Minelli M，et al. Content of flavonols in Italian
bean (Phaseolus vulgaris L.) ecotypes [J]. Food Chem，2006，99:
109.
[9] Sultana B，Anwar F. Flavonols (kaempeferol，quercetin，myricetin)
contents of selected fruits，vegetables and medicinal plants [J]. Food
Chem，2008，108(3)：879.


Determination of quercetin and kaempferol in Polygonum aviculare by HPLC

CHEN Juan，SHI Yanping*
(Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics，
Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China)

[Abstract] Objective: To develop a high performance liquid chromatographic method for the simultaneous determination of
quercetin and kaempferol in Polygonum aviculare. Method: The optimized method was achieved for the separation and detection of
quercetin and kaempferol using Kromasil C18 column (4.6 mm×250 mm，5 µm) as the stationary phase，methanol-0.1% aqueous
phosphoric acid solution (65:35) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL⋅min-1，366 nm as the detection wavelength. The main
factors, extraction solvent extraction time, hydrolysis tine, temperature and hydrochloric acid concentration, which influenced the
sample extraction and hydrolysis procedure, were intensively explored. Result: Methanol and 65% methanol were chosen as the


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extracting solvent for the free compounds and for the total compounds，respectively. The optimized hydrolysis procedure was that the
sample was hydrolyzed 1.0 h with 4.0 mol⋅L-1 hydrochloric acid at 80 ℃. Quercetin and kaempferol showed good relationship at the
range of 0.58-362 mg⋅L-1 and 0.51-320 mg⋅L-1，respectively. Both of the correlation coefficients of the calibration curves were 0.999
9. The detection limits of quercetin and kaempferol were 0.03 mg⋅L-1 and 0.02 mg⋅L-1 at a signal-to-noise ratio of 3，respectively. The
average recoveries of quercetin and kaempferol were 99.7% and 99.0% with relative standard derivation (RSD) of 1.7% and 3.9%.
Conclusion: The results showed that the method is simple，accurate and repeatable and it is suitable for quality control of Polygonum
aviculare.
[Key words] high performance liquid chromatography; Polygonum aviculare; quercetin; kaempferol
[责任编辑 王亚君]






《中国中药杂志》2009 年征订启事
《中国中药杂志》系中国科协主管，中国药学会主办，中国中医科学院中药研究所承办的综合性中药
学术期刊。创刊于 1955 年 7 月，是创刊最早、发行量最大的中药学术刊物。《中国中药杂志》全面反映我
国中医药科研最高学术水平，主要报道该领域新成果、新技术、新方法与新思路，内容包括栽培、资源与
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