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Enrichment of total cardiac glycoside from Semen Descuraniae by macroporous adsorption resin

大孔吸附树脂分离富集分离葶苈子中总强心苷



全 文 :大孔吸附树脂分离富集分离葶苈子中总强心苷
祁 琴1,石晋丽1,闫兴丽1,万 新1,王爱芹2,王秀坤 1
(1.北京中医药大学 中药学院,北京 100102;
2.北京市宣武区第三职业学校,北京 100053)
[摘要] 目的:考察6种大孔树脂对葶苈子总强心苷的分离富集分离性能,确定最佳工艺条件。方法:以总强
心苷吸附量,洗脱率,洗脱物总强心苷含量为指标,采用紫外可见分光光度法进行含量测定。结果:NKA-9型树
脂对葶苈子中总强心苷具有较好的分离富集分离能力,其最佳的工艺条件为:葶苈子提取物质量浓度4g·mL-1
(生药量),最大吸附量354mg·g-1,装柱径高比1/3,吸附流速2mL·min-1,水洗脱量3倍柱体积,洗脱剂80%
乙醇,洗脱量3倍柱体积,洗脱速度1mL·min-1。结论:NKA-9型树脂分离富集总强心苷的最佳工艺稳定高效,
可推广应用于生产。
[关键词] 葶苈子;总强心苷;大孔吸附树脂
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)02013604
[收稿日期] 20070210
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30572463)
[通讯作者] 石晋丽,Tel:(010)84738623,Email:shijl@vip.
sina.com
  葶苈子来源于十字花科植物独行菜 Lepidium
apetalumWild和播娘蒿 Descurainiasophia(L.)
Webb.exPrantl的干燥成熟种子,均具有泻肺平喘、
利水消肿之功效。现代研究证明,葶苈子提取物具
有明显的强心、增加冠脉流量[1]、降低肺动脉高
压[2]等作用,其主要活性部位为强心苷类。本试验
通过对极性不同的6种常用树脂进行筛选,首次确
定了针对葶苈子总强心苷吸附分离性能较好的树
脂,进而得出了最佳富集分离富集工艺。
1 仪器与试药
  U-2000型可见紫外分光光度计(日本日立公
司);电子分析天平;色谱柱(188cm×30cm);地
高辛对照品(中国药品生物制品检定所,批号
100015200308,供含量测定用);AB-8,X-5,S-
8,NKA-Ⅱ,D4006型大孔树脂(南开大学化工
厂),NKA-9型树脂(天津海光化工有限公司),详
见表1。其他试剂均为分析纯,葶苈子药材(购自北
京金象大药房)经北京中医药大学中药生药系石晋
丽副教授鉴定为播娘蒿D.sophia的干燥成熟种子。
2 方法与结果
表1 各树脂的物理性能
树脂极性 树脂型号 平均孔径/nm 比表面积/m2·g-1 粒径范围/mm 孔容/mL·g-1 外观
非极性 D4006 65~75 500~600 03~100 073~077 乳白色不透明颗粒
  X-5 290~300 400~440 03~125 12~124 乳白色不透明颗粒
弱极性 AB-8 130~140 480~520 03~125 073~077 乳白色不透明颗粒
极性  NKA-Ⅱ 145~155 160~200 03~125 062~066 红棕色不透明颗粒
  NKA-9 155~165 250~290 03~125 062~066 乳白色至微黄色不透明颗粒
  S-8 280~300 100~120 03~125 078~082 乳白色不透明颗粒
2.1 对照品溶液的制备
精密称取102mg地高辛对照品,置50mL量
瓶中,加70%乙醇溶解定容至刻度,得0204mg·
mL-1的地高辛对照品溶液。
2.2 标准曲线的制备
精密量取00,04,06,10,12,14mL地高辛
对照品溶液置10mL量瓶中,加入6mL新鲜配置的
碱性三硝基苯酚溶液(10mL1%三硝基苯酚10mL
与5mL氢氧化钠试液5mL混合,水溶解至50mL),
定容,放入暗箱30min,立即在489nm处测定吸光度
值,得回归方程A=27527C-00075,r=09997,线
性范围816~2856μg·mL-1。
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2.3 样品溶液的制备
葶苈子乙醇提取液减压回收,除去黏液质,经石
油醚萃取,取水相浓缩得棕褐色样品溶液。
2.4 样品含量的测定
精密吸取1mL样品溶液于100mL量瓶中,水
定容至刻度。吸取10mL该溶液,加6mL碱性三硝
基苯酚显色,采用标准曲线法测定总强心苷的含量。
2.5 大孔吸附树脂的预处理
新树脂用95%乙醇浸泡24h,湿法装柱,95%
乙醇冲洗至流出液与水1∶5混合后不出现白色混浊
为止,大量水冲柱至无醇味。
2.6 树脂的筛选
将等量预处理后的树脂装成6根等规格的树脂
柱,等量药液上样进行动态吸附,收集流出液测定其
中总强心苷含量,计算树脂吸附量。吸附量(mg·
g-1)=[上样液总强心苷量(mg)-流出液总强心苷
量(mg)]/树脂湿重(g)。树脂柱水洗脱完全(mol
ish反应呈阴性)后,95%乙醇以相同流速充分洗脱,
碱性三硝基苯酚紫外显色检验洗脱终点,洗脱液蒸
干称重,计算树脂总强心苷吸附量、洗脱率及洗脱物
中总强心苷含量。结果表明,NKA-9在以上3项
指标中均最高,确定选用该树脂,见表2。
表2 各树脂的吸附及洗脱性能对总强心苷的影响
树脂型号
吸附量
/mg·g-1
洗脱率
/%
洗脱物
质量分数/%
S-8 158 3419 238
D4006 171 3167 238
X-5 177 3501 271
NKA-Ⅱ 178 6630 266
AB-8 196 6060 294
NKA-9 201 6678 314
2.7 NKA-9树脂分离富集葶苈子中总强心苷的
工艺参数考察
2.7.1 洗脱溶剂的考察 预处理树脂装柱,依上法
进行吸附,依次用 10%,20%,30%,40%,50%,
60%,70%,80%,90%,20%,40%,60%,80%,95%
乙醇充分洗脱,碱性三硝基苯酚紫外显色检验洗脱
终点,计算树脂吸附量、总强心苷吸附量、洗脱率及
洗脱物总强心苷含量,结果见图1。由图可见,总强
心苷在20%乙醇中洗脱量相对较大,30% ~80%乙
醇也能洗脱出大量的强心苷类成分,为了保证较高
的洗脱率及纯度,确定采用80%乙醇为洗脱溶剂。
结果表明,虽然总强心苷的洗脱率随着乙醇纯度的
增加逐渐增大,但洗脱物总强心苷含量在80%乙醇
中最大,确定采用80%乙醇为适宜的洗脱溶剂,见
表3。
图1 总强心苷泄漏曲线
表3 洗脱溶剂对总强心苷的影响 %
乙醇量 洗脱率 洗脱物中总强心苷
20 1925 074
40 3147 209
60 5436 264
80 6682 286
95 6885 271
  注:总强心苷吸附量202mg·g-1
2.7.2 上样浓度的确定 葶苈子药材本身黏稠性
较大,浓度过高容易堵塞树脂柱,而过低则导致耗时
较长,因此通过预试验确定了适宜质量浓度的上下
限,并在此范围内,选择3个不同质量浓度的样品溶
液分别上样于树脂柱,以80%乙醇为洗脱溶剂依上
法操作,计算以上3项指标。结合所得结果及实际
生产的成本考虑,确定样品溶液适合的质量浓度为
4g·mL-1(生药量),见表4。
表4 上样液质量浓度考察
上样液质量浓度
/g·mL-1
吸附量
/mg·g-1
洗脱率
/%
洗脱物
中总强心苷/%
2 201 6114 284
4 198 6868 287
8 203 6280 291
2,7.3 树脂径高比的考察 将预处理的树脂以不同
径高比湿法装柱,80%乙醇为洗脱溶剂依上法操作,
计算总强心苷吸附量、洗脱率及洗脱物总强心苷含
量。结果表明,随着径高比增大洗脱物总强心苷含量
逐渐减小。由于其总强心苷洗脱率相差较小,着重考
虑含量差异,确定适宜径高比为1/3,见表5。
表5 树脂径高比对总强心苷的影响
径高比
吸附量
/mg·g-1
洗脱率
/%
洗脱物中
总强心苷/%
1/3 215 6190 368
1/5 201 6124 319
1/10 205 6237 296
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2.7.4 吸附流速的考察 样品溶液以不同流速上
样,依上述条件及方法操作,计算以上3项指标。结
果表明,上样流速在2mL·min-1时,树脂吸附量、
洗脱物中总强心苷含量为最高,洗脱率较高,确定2
mL·min-1为适宜吸附流速,见表6。
表6 吸附流速对总强心苷的影响
吸附流速
/mL·min-1
吸附量
/mg·g-1
洗脱率
/%
洗脱物
总强心苷/%
1 271 6148 446
2 281 6863 472
3 225 6876 456
2.7.5 泄漏曲线的考察 依上述吸附条件每5mL
收集1份流出液,共收集20份。分别测定总强心苷
的含量,以上样液体积为横坐标,吸光度值为纵坐标
绘制泄漏曲线(图1),确定该条件下最大吸附量为
354mg·g-1(最大上柱体积25mL)。
2.7.6 洗脱曲线的考察 依上述条件进行样品溶
液吸附,待吸附至最大吸附量时洗脱,每10mL收集
1份洗脱液,共收集20份,分别测定总强心苷的含
量,以洗脱液体积为横坐标,吸光度为纵坐标绘制洗
脱曲线(图2)。由图2可见,洗脱液在3倍量柱体
积(50mL)之后总强心苷吸光度值均很小,可认为
总强心苷洗脱完全,确定最佳洗脱用量为3倍量柱
体积。
图2 总强心苷洗脱曲线
2.7.7 洗涤用水量的选择 样品溶液依上述条件
及方法操作,分别用不同量的水洗涤,计算以上3项
指标,结果表明,总强心苷的纯度随着水洗量增加而
有所增加,但同时洗脱率降低,鉴于3种水洗量得到
的最终洗脱物总强心苷含量相差不大,确定采用3
倍量水洗,详见表7。
2.7.8 洗脱流速的考察 依上述条件及方法上样
吸附,3倍量柱体积的80%乙醇以不同流速洗脱,计
算以上 3项指标。结果表明,洗脱流速为 1mL·
min-1时总强心苷的洗脱率及含量最大,确定
表7 洗脱用水量对总强心苷的影响
水洗量
/BV
洗脱率
/%
洗脱物
总强心苷/%
3 7370 362
5 7368 364
8 6927 369
  注:均为28062mg·g-1
1mL·min-1为适宜洗脱流速,详见表8。
表8 洗脱流速对总强心苷的影响
洗脱流速
/mL·min-1
洗脱率
/%
洗脱物
总强心苷/%
1 7666 513
2 6358 428
3 6299 403
  注:均为28062mg·g-1。
2.7.9 工艺验证 10gNKA-9树脂预处理后以
1/3径高比装柱,4g·mL-1(生药量)质量浓度上样
25mL,以2mL·min-1流速吸附,45mL水洗脱后,
80%乙醇(50mL)以1mL·min-1流速洗脱,收集洗
脱液,测定得总强心苷洗脱率为 7783%,含量为
532%。
3 结论
经过工艺筛选得到的最佳的洗脱工艺为:葶苈
子提取物质量浓度4g·mL-1(生药量)上样于径高
比1/3的NKA-9树脂柱,最大吸附量354mg·
g-1(2倍柱体积量),吸附流速2mL·min-1,3倍
柱体积水洗脱后,3倍量80%乙醇洗脱,洗脱速度1
mL·min-1。在此条件下操作,得到总强心苷的洗
脱率为7783%,含量能达到532%。
强心苷类化合物由于在植物体中含量较小
(1%以下),且常常与性质相似的皂苷混杂在一起,
因此对中药中的强心苷成份进行分离提纯具有很大
的困难,本试验采用常见的 NKA-9树脂对葶苈子
中的强心苷进行富集分离,其纯度与传统提取方法
所得提取物含量相比提高6倍且方法简便迅速、安
全有效,可以推广应用于大规模生产制备。
[参考文献]
[1] 吴晓玲,杨裕忠,黄东亮.葶苈子水提物对狗左心室功能的作
用[J].中药材,1998,21(5):243.
[2] 方志坚,熊旭东.葶苈子中黄白糖芥苷对 MCT所致肺动脉高
压大鼠血流动力学影响[J].实用中西医结合临床,2004,4
(5):73.
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EnrichmentoftotalcardiacglycosidefromSemenDescuraniae
bymacroporousadsorptionresin
QIQin1,SHIJinli1,YANXingli1,WANXin1,WANGAiqin2,WANGXiukun1
(1.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;
2.XuanwuNo3VocationalSchoolinBeijing,Beijing100053,China)
[Abstract] Objective:ToestablishtheseparationandenrichmenttechnologyfortotalcardiacglycosidefromSemendescurani
ae,6typesofmacroporousadsorptionresinwereinvestigated.Method:Theadsorptioncapacity,elutionratioandpurifyoftotalcardi
acglycosidewereusedasevaluatingcriteria.TheUVVISspectrophotometricmethodwasusedinthedeterminationoftotalcardiacgly
cosidecontent.Result:NKA9hadbeterpropertyofseparationandpurificationandtheoptimaltechnologicalconditionswere:the
concentrationofthesampleofSemenDescuraniae,4g·mL-1(amounttocrudedrug),Themaximumadsorptioncapacityoftotalcar
diacglycoside,354mg·g-1,theoptimalcolumndiameter/height,1/3,theflowvelocityofadsorption,2mL·min-1,washingwa
ter,3timesofresinvolume,theelutingreagent,80% ethanol(3timesoftheresinvolume),elutingvelocity,1mL·min-1.Con
clusion:ThetechnologyofseparatingandpurifyingtotalcardiacglycosideofSemenDescuraniaewithNKA9wasstableandefective,
andcanbeappliedtomanufacture.
[Keywords] SemenDescuraniae;totalcardiacglycoside;macroporousadsorptionresin
[责任编辑 鲍 雷]
[收稿日期] 20061210
[基金项目] 湖北省教育厅科技创新课题(2004J001)
[通讯作者] 刘朝霞,Tel:(0717)6395931,Email:xyr011@
sina.com
大孔吸附树脂分离纯化资木瓜黄酮的研究
刘朝霞1,杨兴海2,邹 坤1,程 凡1,周 媛1,柳 蔚2
(1.三峡大学 化学与生命科学学院 湖北省天然产物研究与利用重点实验室,湖北 宜昌 443002;
2.三峡大学 医学院,湖北 宜昌 443002)
[摘要] 目的:研究大孔吸附树脂分离纯化资木瓜黄酮工艺,为资木瓜黄酮的工业化生产提供依据。方法:采
用DM-01,DA-201,DS-401,D-101-Ⅰ,D-1015种型号大孔吸附树脂对资木瓜黄酮进行吸附纯化,以黄酮收
率、纯度为考察指标综合评价,优选出最佳树脂;对优选出的树脂进行洗脱溶剂和洗脱用量的探讨。结果:5种大孔
吸附树脂静态饱和吸附量以干树脂计分别为7080,7972,6624,6312,5616mg·g-1(干树脂);静态洗脱率分
别为8576%,7924%,7357%,8145%,7101%;DM-301型树脂综合性能最好,以50% 乙醇为洗脱剂得到的
目标产物纯度最高,为9663%;30%和50%乙醇能洗脱树脂柱上大部分黄酮。结论:DM-301型大孔吸附树脂表
现出较好的综合性能,可以用于纯化资木瓜黄酮;用30%和50%的乙醇作为洗脱剂较好。
[关键词] 资木瓜黄酮;大孔吸附树脂;分离纯化
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)02013904
  资木瓜的基源植物为皱皮木瓜Chaenomelesspe ciosa(sweet)Nakai,是木瓜中的主流产品[1],主产于
长阳资丘。《神农本草经》曰[2]:木瓜,生夷陵(今湖
北宜昌附近)。湖北省科技厅已将资木瓜列入十大
道地药材;其化学成分主要为黄酮、皂苷、齐墩果酸
等。目前对资木瓜乙醇提取物的药理作用有相关报
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