全 文 ：四物汤对环磷酰胺致血虚证小鼠骨髓
蛋白质组的影响
刘丽丽 o马增春 o王宇光 o秦红霖 o谭洪玲 o肖成荣 o高 月 3
k北京放射与辐射医学研究所 o北京 tss{xsl
≈摘要  目的 }研究四物汤对环磷酰胺k≤×÷l损伤致血虚证小鼠骨髓蛋白质组的影响 o旨在分子水平上探讨四
物汤促进骨髓造血的作用机制 ∀方法 }采用 ≤×÷ uxs °ª#®ªp t腹腔注射制成化学损伤型血虚证小鼠模型 o利用蛋白
质组学技术研究四物汤治疗后的差异蛋白质组 ∀结果 }研究发现 ≤×÷ 使小鼠骨髓中 tu个蛋白表达上调 !v个蛋白
表达下调 o四物汤可使 ≤×÷ 造模后这些表达改变的蛋白有不同程度恢复 ∀结论 }四物汤可能通过影响与细胞凋亡 !
造血干祖细胞增殖分化有关的蛋白质而促进骨髓造血 ∀
≈关键词  四物汤 ~≤×÷ ~骨髓 ~蛋白质组学
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyltw2ttzu2sw
≈收稿日期  ussx2s{2tu
≈基金项目  国家自然科学基金资助项目kvsvztzuxl
≈通讯作者  3高月 oר¯ }kstslyy|vtvtu oƒ¤¬}kstslyy|vtvtu o∞2
°¤¬¯}ª¤²¼∏¨ ƒ ±¬¦q¥°¬q¤¦q¦±
中医传统补血方剂四物汤对于由放射损伤 !化学
损伤和综合放血等方法所致的血虚证模型动物具有
补血作用 ∀对环磷酰胺k≤×÷l致血虚证补血机制而
言 o一般认为是四物汤通过增加 ≤×÷ 致血虚证小鼠
骨髓造血细胞培养的集落数 !抑制 ≤×÷ 引起的细胞
凋亡 !升高小鼠骨髓细胞中 ≤⁄vwn细胞的比例 o进而
升高外周血象≈t  ∀然而 o对于四物汤促进骨髓造血的
分子机制仍不十分清楚 ∀本实验应用蛋白质组学技
术在蛋白质水平上研究四物汤促进化学药物 ≤×÷ 损
伤致血虚证小鼠骨髓造血的作用靶点及作用机制 ∀
1 材料
111 药物 四物汤的 w味药材熟地黄 !当归 !白芍 !
川芎均购自北京同仁堂 o由本所马百平教授鉴定 o按
照5太平惠民合剂局方6规定的质量比ktxΒtsΒtsΒyl
称取 o经过水煎 !过滤 !浓缩 !配制成 tss h药液k即
每 t °药液含生药 t ªl ow ε 保存备用 ∀ ≤×÷k江苏
恒瑞医药股份有限公司 o批号 ‹vusus{xzl ∀
112 试剂与仪器 尿素 !≤‹„°≥ !丙烯酰胺 !Ν , Νχ2
甲叉双丙烯酰铵 !׬¶¨2¥¤¶¨ !十二烷基磺酸钠k≥⁄≥l !
过硫酸铵 !°«¤µ°¤¯¼·¨ v2ts !固定干胶条kŒ°Šl !Œ°Š缓
冲液 !低相对分子质量蛋白质 ¤µ®¨µ!甘氨酸k„°¨ µ2
¶«¤° …¬²¶¦¬¨±¦¨¶公司l o琼脂糖k°µ²°¨ ª¤公司l o考马
斯亮蓝 •2uxs oŠ2uxsk„°µ¨¶¦²公司l o三氟乙酸k׃„ o
 µ¨¦®公司l o乙腈kƒ¬¶«¨µ公司l o核酸酶k≥¬ª°¤公
司l o蛋白酶抑制剂 !胰酶k•²¦«¨ 公司l o蛋白质定量
标准k°¬¦µ¦¨ 公司l o其他试剂均为国产分析纯 ∀
⁄˜yws核酸蛋白分析仪k美国 …¨ ¦®°¨ ± 公司l o
蛋白质组学研究配套仪器k„°¨ µ¶«¤° …¬²¶¦¬¨±¦¨ 公
司l o质谱仪k…µ∏®¨µ公司 o• ∞ƒ∞÷ ŒŒŒ基质辅助激光
解吸r电离飞行时间质谱 o„⁄Œ2גƒ2≥l ∀
113 动物及分组处理 ≤xz…ry小鼠 o雌性 oy ∗ {
周龄 o体重kus ? ul ªouw只 o由中国医学科学院实验
动物研究所提供 o许可证号 ≥≤÷Ž京 ussw2ssst ∀常
规饲养数天后适应环境 o按体重随机分为 v组 }正常
组 !模型组和四物汤组 ∀四物汤组按临床剂量计算
小鼠用药剂量为 ts ª#®ªpt#§pt≈u  ∀给与灌胃 v §o
正常组和模型组给予等体积蒸馏水 o第 w天模型组
和四物汤组按 uxs °ª#®ªpt一次腹腔注射 ≤×÷ 造
模 o继续灌胃 ts §o最后一次给药后 uw «颈椎脱臼
处死小鼠 o取股骨骨髓 ∀
2 方法
211 样品制备 用磷酸缓冲液冲洗小鼠骨髓 o加入
细胞裂解液及蛋白酶抑制剂 o液氮反复冻融 v次 o加
入核酸酶 o冰浴 us °¬±o离心 o取上清 ∀用 …µ¤§©²µ§≈v 
法测蛋白质含量 ∀正常组 !模型组 !四物汤组小鼠骨
髓蛋白的含量分别是 wu1us owy1|u oww1{| °ª#°pt ∀
212 双向电泳 采用胶内泡涨法上样 ∀将含有 t1x
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°ª蛋白质的各组骨髓提取液分别与 Œ°Š胶条再水
化液混匀后加入电泳槽内 o进行一向等电聚焦 ∀电
泳参数 }vs ∂ 再水化 tu «~vss ∂ ot «~xss ∂ ot «~
t sss ∂ ot «~{ sss ∂ ot «~{ sss ∂ otu «∀一向等电聚
焦结束后 Œ°Š胶条先后在含有二硫苏糖醇 k⁄××l和
碘乙酰胺的平衡液中各平衡 tx °¬±∀然后将 Œ°Š胶
条置于预先制备的 tu1x h的 ≥⁄≥2°„Š∞o进行第二向
电泳 ∀电泳参数 }tus °„ ows °¬±~txs °„ o至溴酚蓝
迁移至 ≥⁄≥2°„Š∞凝胶的底部边缘结束电泳 o将凝
胶转移至考马斯亮蓝 •2uxs染色液中过夜 o考马斯
亮蓝脱色液脱色 v «∀
213 凝胶图像分析及肽质量指纹鉴定 脱色后凝
胶进行扫描 o扫描图像应用 Œ°¤ª¨ ¶·¨µ×u⁄ °¯¤·¬±∏°
软件分析系统分析 ∀将凝胶上差异的蛋白质点沿其
边缘切下 o进行脱色 o采用胰酶进行胶内酶切 o应用
„⁄Œ2גƒ2≥检测肽质量指纹谱k°ƒl o然后在蛋
白质数据库 «·³}rrººº q°¤·µ¬¬¶¦¬¨±¦¨ q¦²°输入拟查
询的物种 !°ƒ数据及其他限定参数 o查询与待查询
肽段较匹配的蛋白质 ∀
3 结果
311 凝胶电泳结果扫描图像 图 t为小鼠骨髓蛋
白二向电泳结果图谱 o其一向等点聚焦 ³‹ 梯度为
v ∗ ts o胶条长度为 uw ¦°ov次电泳结果图谱中均能
分辨出 {ss个蛋白点以上 o图像重复性好 o可以做图
像分析 ∀对图像分析结果中找到的差异蛋白点进行
标记k图 tl ∀
图 t 小鼠骨髓蛋白电泳结果图谱k ν € vl
分别将 tw otx号蛋白点扫描图像局部放大后进
行比较 o直观的反映出 ≤×÷ 造模后该点代表的蛋白
质表达量明显上调 o而在给予四物汤后其表达又有
所下调 ∀两蛋白质点的三维立体处理图像 o同样可
以直观的看出蛋白点表达量的变化规律k图 u ovl ∀
图 u u个蛋白点的局部放大图像
312 凝胶图像分析结果 分别将正常组和四物汤
组图像灰度值与模型组图像灰度值进行比较 o采用
τ检验进行统计学处理 ∀
四物汤可以使造模后 tu个表达上调和 v个表
达下调的蛋白点有不同程度的恢复 ∀其中 ≤×÷ 造
模后 ot ou ow oy otw otx oty号蛋白质显著升高 ov号蛋
白点明显降低ktl Π s1sx oul Π s1stl o给予四物汤

图 v u个蛋白质点的三维立体图像
后可以使在造模后表达上调的 tt otx号蛋白点表达
明显下调k表 tl ∀
313 差异蛋白质的质谱鉴定及蛋白质查询结果
经过肽指纹图谱分析结合生物信息学 o检索到与骨
髓造血和细胞凋亡有关的 w个蛋白分别是 v号碳酸
酐酶 Œk¦¤µ¥²±¬¦¤±«¼§µ¤¶¨ ´l otw号 ¤±±¨ ¬¬± „t otx号
肌动蛋白结合蛋白 k¦²©¬¯¬±l oty 号 ³¨µ²¬µ¨§²¬¬±2∂
k°µ÷2∂lk表 ul ∀
4 讨论
四物汤是中医临床常用补血方剂 o四物汤可以
影响放射损伤致血虚证小鼠骨髓和血清中蛋白质水
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表 t 四物汤对血虚证小鼠骨髓蛋白的影响kcξ ? σl
‘²q
等电点r相对分子
质量k ≅ tsvl
正常组 模型组 四物汤组
t w qz{rvs s qusw ? s qsw{tl s qytw ? s qtxs s qw{s ? s qswv
u w qyxrvt s qsxz ? s qssvtl s qtxs ? s qsv{ s qtvx ? s qssy
v y q|trvy s qttw ? s qst{ul s qsuz ? s qstt s qsu| ? s qss{
w w qyxrvu s qsvu ? s qstwtl s qttt ? s qsu{ s qs{{ ? s qssv
x w qxsruy s qutt ? s qttv s qwtz ? s qty| s qvzx ? s qtwv
y w q{yruu s qsys ? s qsuwtl s qttz ? s qssx s qtts ? s qss|
{ x q{|ru| s qsuw ? s qssv s qszs ? s qs{t s qstt ? s qsts
| x qu{rxu s qsw| ? s qstv s qsuw ? s qstt s qsvs ? s qsu|
ts x qwurvt s qsu{ ? s qss| s qstu ? s qstt s qsuw ? s qssy
tt { q{vrus s qtx| ? s qsyv s quy| ? s qsxv s qttu ? s qswstl
tu w qzvrvz s qw{z ? s qtu| s q{sv ? s quzw s qyv{ ? s qttv
tv w qyxrv| s qvux ? s qs|t s qxz| ? s qtwx s qwzz ? s qtwx
tw z qsxrxt s quvu ? s qsw|tl s qxvs ? s qtzz s qvvy ? s qtv|
tx { qv|ruv s quws ? s qsv{tl s qvw{ ? s qsv| s quvs ? s qswstl
ty { qturt| s qtxt ? s qsvuul s qvvz ? s qswt s qu{{ ? s qsw|
注 }与模型组比较tl Π s1sx oul Π s1st
平 o通过促进造血细胞的生长和分化来促进骨髓造
血 o从而降低辐射引起的损伤≈w ox  o作者的研究同样
提示四物汤可以减轻化学损伤k≤×÷l引起的小鼠骨
髓的损伤 ∀
在红细胞分化早期有一些特异性标志物 o其中
血红蛋白和血浆糖蛋白是已被公认的红细胞分化早
期标志物 ∀ ∂¬¯¯ √¨¤¯≈y 等研究表明碳酸酐酶 Œk≤„ Œl
在红细胞分化早期特异性出现 o同时也在类红细胞
祖细胞中表达 ∀如表 t中 v号数据所示 o在 ≤×÷ 造
模后第 ts天小鼠骨髓中 ≤„ Œ的表达显著降低 o与
造模后外周血红细胞降低的时间点相一致≈t  o而四
物汤能够在一定程度上起升高 ≤„ Œ表达的作用 ∀
这说明四物汤可能通过作用于 ≤„ Œ来促进红细胞
的分化 !成熟 ∀
表 u 四物汤作用于化学损伤致血虚证小鼠骨髓差异蛋白质鉴定
‘²q 蛋白序列号 分值 覆盖序列 匹配率 等电点r相对分子质量k ≅ tsvl 蛋白质名称
v ≤„‹t tsv wzh zrtu yq|trvy ¦¤µ¥²±¬¦¤±«¼§µ¤¶¨ t
tw „‘÷„tp’˜≥∞ |w vvh {rty zqsxrxt ¤±±¨ ¬¬± „t
tx ≤’ƒtp’˜≥∞ ys vyh yrut {qv|ruv ¦²©¬¯¬±
ty „„ƒsw{xx tv| y|h ttrvt {qturt| °µ÷2∂
骨髓造血干r祖细胞的增殖 !分化离不开造血微
环境 ∀ Ž²±¤®¤«¤µ¤≈z 等对造血干r祖细胞迁移机制进
行了研究 o发现 • «²2Š×°¤¶¨rŒŽtr¦²©¬¯¬±在造血干
r祖细胞的迁移中起着关键作用 o其中 ¦²©¬¯¬±是一种
肌动蛋白结合蛋白 o它与肌动蛋白结合能够限制肌
动蛋白对特异位点的识别与结合 o从而抑制造血干r
祖细胞的移动 o影响其进入造血微环境进行增殖 !分
化 ∀本研究发现 o≤×÷ 造模后第 ts §¦²©¬¯¬±的表达明
显升高 o而四物汤可以明显降低其表达 o如表 t中
tx号蛋白点数据所示 ∀由此见四物汤可能通过抑
制¦²©¬¯¬±的表达而促进骨髓造血干r祖细胞进入造
血微环境进行增殖 !分化 o从而改善骨髓造血 ∀
„±±¨ ¬¬± tk¯¬³²¦²µ·¬± t o„‘÷ „tl是钙离子依赖的
磷脂结合蛋白 o属于 ¤±±¨ ¬¬±家族成员 o在转染含有
„‘÷ „t质粒的人髓性白血病细胞株 ˜|vz中 o细胞
的凋亡加速 ∀ „‘÷ „t ‘端表达产物在 בƒ或鬼臼
亚乙苷的诱导下 o通过升高胱冬肽酶2v和磷脂酶2u
的活性使细胞更易发生凋亡≈{ o|  ∀此外 o在神经酰
胺诱导的凋亡中 o内源性的 „‘÷ „t ‘2端的加工产
物促进了神经酰胺诱导的凋亡≈ts  ∀表 t中 tw号蛋
白点数据所示 o≤×÷ 造模后 o„‘÷ „t表达升高 o而应
用四物汤后其表达有下降的趋势 o推测 ≤×÷ 造模后
可能通过高表达 „‘÷ „t或者其加工产物来激活胱
冬肽酶2v o从而启动凋亡途径加速细胞凋亡 o而四物
汤则通过抑制 „‘÷ „t的表达或是其加工产物的生
成来抑制 ≤×÷ 引起的凋亡 o但是其具体作用机制有
待进一步研究探讨 ∀
本研究中还发现一种含硫醇的蛋白 ³¨µ²¬µ¨§²¬2
¬±2∂k°µ¬2∂l o在 ≤×÷ 造模后表达明显升高 o如表 t中
ty号蛋白点数据所示 o应用四物汤后其表达又有所
下降 ∀该蛋白主要存在于线粒体 !过氧化物酶体和
细胞核的过氧化还原酶中 o目前已发现该家族有 y
个亚型成员kŒ2Œ∂l o它们在氧化应激中起信号转导
和降解过氧化氢的作用 ∀此外 o还参与受体信号转
导 !蛋白磷酸化 !转录调节和凋亡等过程 ∀ °µ¬2∂ 在
细胞抗氧化过程中的作用是通过与 °xv诱导产生的
活性氧发生作用 o因此 °µ¬2∂ 抑制 °xv引起的凋亡
可能是通过氧化还原反应来实现的≈tt  o而 °xv是诱
导基因损伤而无法修复的细胞发生凋亡≈tu  ∀因此
四物汤可能是通过抑制 °µ¬2∂ 的表达来减轻其对
°xv诱导的凋亡的抑制 o从而清除由 ≤×÷ 导致的基
因损伤而无法修复的细胞 ∀四物汤还可以抑制 ≤×÷
诱导微核率升高≈tv  o可能由该机制介导 ∀
由本实验结果证明四物汤能在多个作用靶点上
#wztt#
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参与促进化学损伤小鼠骨髓造血 o可能主要是通过
作用于 ≤„ Œo¦²©¬¯¬±o„‘÷ „t和 °µ¬2∂ 等蛋白来促进
红细胞的分化成熟 !促进造血干r祖细胞进入造血微
环境增殖 !分化以及参与细胞凋亡过程等途径来促
进骨髓造血 o与本课题组的前期研究结果相一致 ∀
因此 o四物汤可能通过影响与细胞凋亡 !造血干祖细
胞增殖分化有关的蛋白质而促进骨髓造血 ∀
≈参考文献 
≈t  马增春 o高 月 o刘永学 q ≤×÷ 所致血虚证小鼠骨髓 ≤⁄vwn
细胞的变化 q中国中医基础医学杂志 ousst ozkzl }wu q
≈u  陈 奇 q中药药理研究方法学 q北京 }人民卫生出版社 ot||y q
ttsv q
≈v  …µ¤§©²µ§   q „ µ¤³¬§¤±§¶¨±¶¬·¬√¨ ° ·¨«²§©²µ·«¨ ∏´¤±·¬·¤·¬²± ²©
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¥¬±§¬±ªq„±¤¯ …¬²¦«¨ ° ot|zy ozkzul }uw{ q
≈w  郭 平 o马增春 o王升启 o等 q四物汤对放射线致血虚证小鼠
骨髓蛋白质表达的影响 q中国中药杂志 oussw ou|k|l }{|v q
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血清蛋白质表达的影响 q中国中药杂志 oussv ou{kttl }tsxs q
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Εφφεχτσ οφ Σιωυ δεχοχτιον ον βονε µαρροω προτειν εξπρεσσιον οφ βλοοδ
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(Ινστιτυτε οφ Ραδιατιον Μεδιχινε , Βειϕινγ tss{xs , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶·∏§¼·«¨ ©¨©¨¦·¶²© ≥¬º∏ §¨¦²¦·¬²± ²± ³µ²·¨¬± ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²© ¥¯²²§ §¨©¬¦¬¨±¦¼ °¬¦¨ ¬±§∏¦¨§¥¼ ¦¼¦¯²³«²¶2
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º µ¨¨ ¶¨·¤¥¯¬¶«¨ §¥¼¬±­¨¦·¬±ª¬³ º¬·«uxs °ª#®ªp t ≤×÷ q°µ²·¨²°¬¦·¨¦«±²¯²ª¬¦¶º µ¨¨ ¤³³¯¬¨§·²¬§¨±·¬©¼·«¨ §¬©©¨µ¨±·³µ²·¨¬±q Ρεσυλτ : ≥¬º∏
§¨¦²¦·¬²± ¦²∏¯§µ¨¶·²µ¨ ·«¨ ¦«¤±ª¨¶²©tu ∏³2µ¨ª∏¯¤·¨§¤±§v §²º±2µ¨ª∏¯¤·¨§³µ²·¨¬±¶¬± ¥²±¨ °¤µµ²º ²©¥¯²²§§¨©¬¦¬¨±¦¼ °¬¦¨ ¬±§∏¦¨§¥¼ ¦¼2
¦¯²¶³«²¶³«¤°¬§¨ qΧονχλυσιον : ≥¬º∏§¨¦²¦·¬²±¦²∏¯§ ©¨©¨¦·¨ ¬³µ¨¶¶¬²± ²©³µ²·¨¬±¶º«¬¦«©∏±¦·¬²±¶¬±¦¯∏§¬±ª¤³²³·²¶¬¶o³µ²¯¬©¨µ¤·¬²±¤±§§¬©©¨µ¨±2
·¬¤·¬²± ²©·«¨ «¤¨ °¤·²³²¬¨·¬¦¶·¨°r³µ²ª¨ ±¬·²µ¦¨¯¯ q׫¨ µ¨ª∏¯¤·¬²±¬±·«¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¯ √¨¨¯ °¬ª«·¥¨ ·«¨ ° ¦¨«¤±¬¶° ²©¶·¬°∏¯¤·¬±ª«¨ °¤·²³²¬¨¶¬¶¬±
¥²±¨ °¤µµ²º ©²¶¬º∏§¨¦²¦¨·¬²±q
[ Κεψ ωορδσ] ≥¬º∏§¨¦²¦·¬²±~¦¼¦¯²¶³«²¶³«¤°¬§¨ ~¥²±¨ °¤µµ²º ~³µ²·¨²°¬¦¶
≈责任编辑 刘  
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第 vt卷第 tw期
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