全 文 ：绞股蓝属植物及其混淆品乌蔹莓的
ＰＣＲＲＦＬＰ鉴别研究
王 罛，张媛媛，杨 娟，蒋玲燕，李苗苗，赵桂仿
（西北大学 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西 西安 ７１００６９）
［摘要］ 目的：寻找简便、可重复的分子标记方法对绞股蓝属Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ植物及其混淆品乌蔹莓Ｃａｙｒａｔｉａｊａ
ｐｏｎｉｃａ进行鉴别。方法：对７种常见药用绞股蓝属植物及其混淆品乌蔹莓的６个ｃｐＤＮＡ片段进行ＰＣＲ扩增，再利
用ＴａｑⅠ，ＨｐａⅡ，ＥｃｏＲⅠ，ＲｓａⅠ，ＨｈａⅠ，ＨｉｎｄⅢ等６种限制性内切酶分别对扩增片段进行消化。结果：３６种ＤＮＡ片
段／内切酶组合中，ｔｒｎＫ１ｆｔｒｎＫ２ｒ片段与ＲｓａⅠ组合可将乌蔹莓从绞股蓝属植物中区分出来，产物清晰、结果稳定。
结论：ＰＣＲＲＦＬＰ分析方法可有效区分常见绞股蓝属植物与其混淆品乌蔹莓。
［关键词］ 绞股蓝属；乌蔹莓；ＰＣＲＲＦＬＰ；分子鉴别
［中图分类号］Ｒ２８２．７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１９２１６７０４
［收稿日期］ ２００７１２０９
［基金项目］ 长江学者及创新团队发展计划
［通讯作者］ 赵桂仿，Ｔｅｌ：（０２９）８８３０５２０７，Ｆａｘ：（０２９）
８８３０３５７２，Ｅｍａｉｌ：ｇｕｉｆａｎｇ＠ｎｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
绞股蓝属ＧｙｎｏｓｔｅｍｍａＢＬ．包括１６种２变种，主
要分布于我国秦岭长江以南地区［１］。绞股蓝 Ｇ．
ｐｅｎｔａｐｈｙｌｕｍ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｍａｋｉｎｏ为该属广布种，作为
传统中草药，具有悠久的应用历史，现代药理学研究
证明绞股蓝含有８４种皂苷［２］，具有抑制肿瘤、降低
血脂、提高免疫力等作用［３４］。随着绞股蓝资源的开
发，该属狭域种疏花绞股蓝 Ｇ．ｌａｘｉｆｌｏｒｕｍ，喙果绞股
蓝Ｇ．ｙｉｘｉｎｇｅｎｓｅ，长梗绞股蓝 Ｇ．ｌｏｎｇｉｐｅｓ，五柱绞股
蓝Ｇ．ｐｅｎｔａｇｙｎｕｍ，广西绞股蓝 Ｇ．ｇｕａｎｇｘｉｅｎｓｅ等相
继被证实含有与广布种相似的生药特征与皂苷类
型［５］，扩充为药用植物资源。市场上绞股蓝属药材
资源来源复杂，质量差异显著，常见的混淆品主要包
括乌蔹莓、雪胆、崖爬藤等［６７］，其中乌蔹莓 Ｃａｙｒａｔｉａ
ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｇａｇｎｅｐ最为常见，该物种隶属于
葡萄科乌蔹莓属，具有解毒消肿、活血散瘀、利尿止
血等作用［８］，由于该种植物具有与绞股蓝属十分相
似的生境与形态特征，易造成药材采收的混乱。
ＰＣＲＲＦＬＰ标记技术将ＰＣＲ与ＤＮＡ序列分析相
结合，首先通过ＰＣＲ扩增获得目的片段，接着寻找合
适的限制性内切酶位点对目的片段进行ＲＦＬＰ分析，
从而产生特定点限制性酶切图谱，该方法已广泛应用
于药用植物的鉴定工作［９１１］。本研究将我国常见的７
种绞股蓝属植物与乌蔹莓进行ＰＣＲＲＦＬＰ区分鉴定，
以期为野生绞股蓝药材的分子鉴定提供依据。
１ 材料
共选用绞股蓝属７个物种及葡萄科乌蔹莓属乌
蔹莓（表１），绞股蓝属样品标本由中国科学院昆明
植物研究所陈书坤研究员与中国西北农林科技大学
陈彦生研究员鉴定。
２ 方法
２．１ 基因组ＤＮＡ的提取 采用ＣＴＡＢ法提取材料
基因组ＤＮＡ［１２］。
２．２ 叶绿体 ＤＮＡ的 ＰＣＲ扩增 选用６对叶绿体
ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）通用扩增引物用于本研究（表２）。所
用引物由上海生工生物工程公司合成。ＰＣＲ反应
体系为２５μＬ，包括 ２０ｍｍｏＬ·Ｌ－１Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰｓ
各２００μｍｏＬ·Ｌ－１，相应的引物各０２μｍｏｌ·Ｌ－１，
５０ｎｇ模板ＤＮＡ，１０ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶。扩增反应
在ＰＴＣ２００ＴＭ型ＰＣＲ仪上进行，反应程序为：９４℃
预变性５ｍｉｎ；９４℃变性９０ｓ，４５～７７℃退火４５ｓ，
７２℃延伸１５０ｓ，进行３５个循环；最后７２℃延伸７
ｍｉｎ，以ｄｄＨ２Ｏ代替模版作空白对照。
２．３ 酶切反应 实验选用６种限制性内切酶包括：
ＴａｑⅠ，ＨｐａⅡ，ＥｃｏＲⅠ，ＲｓａⅠ，ＨｈａⅠ，ＨｉｎｄⅢ 。反应
体积２０μＬ，包括１０×ＰＣＲｂｕｆｅｒ２０μＬ，限制性内
切酶２０Ｕ，ＰＣＲ产物８μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足至２０μＬ；
３７℃恒温水浴酶切３ｈ。
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表１ 绞股蓝属植物及其混淆品来源及数量
Ｎｏ． 材料名称 拉丁学名 来源 数量
１ 绞股蓝 Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａｐｅｎｔａｐｈｙｌｕｍ 江苏南京 １０
２ 五柱绞股蓝 Ｇ．ｐｅｎｔａｇｙｎｕｍ 湖南湘西保靖县 １０
３ 心籽绞股蓝 Ｇ．ｃａｒｄｉｏｓｐｅｒｍｕｍ 贵州铜仁梵净山 １０
４ 长梗绞股蓝 Ｇ．ｌｏｎｇｉｐｅｓ 陕西安康镇坪县 １０
５ 喙果绞股蓝 Ｇ．ｙｉｘｉｎｇｅｎｓｅ 安徽铜陵钟鸣 １０
６ 疏花绞股蓝 Ｇ．ｌａｘｉｆｌｏｒｕｍ 安徽铜陵钟鸣 １０
７ 广西绞股蓝 Ｇ．ｇｕａｎｇｘｉｅｎｓｅ 贵州贵阳 １０
８ 乌蔹莓 Ｃａｙｒａｔｉａｊａｐｏｎｉｃａ 陕西汉中 １０
表２ 叶绿体引物序列及来源
ＤＮＡ片段 引物序列 扩增区域
退火温度
／℃
片段长度
／ｋｂｐ
ｒｐｌ１６Ｆ７１Ｓｍａｌｒｐｌ１６Ｒ１６６１［１３］ ５′ＧＣＴＡＴＧＣＴＴＡＧＴＧＴＧＴＧＡＣＴ３′ 基因，编码核蛋白体大亚基多肽Ｌ１６ ５５ １２
５′ＣＧＴＡＣＣＣＡＴＡＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣ３′
ｒｐｌ２０Ｈａｍｉｌｔｏｎ５′ｒｐｓ１２Ｈａｍｉｌｔｏｎ［１４］ ５′ＴＴＴＧＴＴＣＴＡＣＧＴＣＴＣＣＧＡＧＣ３′ 基因及基因间区 ５６ ０８
５′ＧＴＣＧＡＧＧＡＡＣＡＴＧＴＡＣＴＡＧＧ３′
ｔｒｎＨｆｔｒｎＫ１ｒ［１５］ ５′ＡＣＧＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＣＣＧＣＧＣＡ３′ 基因及基因间区，含ｐｓｂＡ基因 ６２ １８
５′ＣＣＧＡＣＴＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡ３′
ｔｒｎＫ１ｆｔｒｎＫ２ｒ［１５］ ５′ＧＧＧＴＴＧＣＣＣＧＧＧＡＣＴＣＧＡＡＣ３′ 基因及基因间区，含ＭａｔＫ基因 ６２ ２６
５′ＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＴＡＣＴＣＧＧＣＴＴＴＴＡ３′
ｔｒｎＫ１ｔｒｎＫ２［１６］ ５′ＡＡＣＣＣＧＧＡＡＣＴＡＧＴＣＧＧＡＴＧ３′ 基因及基因间区，含ＭａｔＫ基因 ５７ ２６
５′ＧＧＴＴＧＣＴＡＡＣＴＣＡＡＣＧＧＴＡＧ３′
ｔｒｎＳＭＭＭｐｓｂＣｆ［１５］ ５′ＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣ３′ 基因及基因间区 ６０ １８
５′ＧＧＴＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣ３′
２．４ 酶切产物的检测 酶切反应结束后，加入１０×
Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｅｒ２０μＬ以终止反应，酶切产物在含有
０５ｍｇ·Ｌ－１ＥＢ的１５％琼脂糖凝胶中电泳分离，
在紫外光投射仪下检测，通过ＧｅｌＤｏｃＸＲ凝胶成像
系统（ＢｉｏＲａｄＣｏｍｐａｎｙ）照相记录，并通过 Ｑｕａｎｔｉｔｙ
Ｏｎｅ一维凝胶分析软件进行ＤＮＡ定量分析。
３ 结果
３．１ ＰＣＲＲＦＬＰ分析 采用１３对叶绿体 ＤＮＡ标
记对８个物种进行ＰＣＲＲＦＬＰ分析，其中，有６对能
够获得清晰稳定的扩增条带，且扩增产物电泳均无
多态性，可用于供试材料的检测（表２）。扩增产物
经ＴａｑⅠ，ＨｐａⅡ，ＥｃｏＲⅠ，ＲｓａⅠ，ＨｈａⅠ，ＨｉｎｄⅢ等６
种限制性内切酶进行消化，在所用的 ３６种 ＰＣＲ
ＲＦＬＰ标记／酶组合中，共有５种组合能检测出样品
８与其他样品的差异（图１），其余３１种标记不能将
混淆品与其余样品完全区分（图２）。
３．２ 绞股蓝属与其混淆品的 ＰＣＲＲＦＬＰ分子鉴定
对８种材料的 ｔｒｎＫ１ｆｔｒｎＫ２ｒ片段进行 ＰＣＲ扩增，
乌蔹莓扩增产物约为２６００ｂｐ，绞股蓝属扩增产物
约为２２００ｂｐ，在绞股蓝属内长度变异不明显。利
用限制性内切酶ＲｓａⅠ对扩增产物进行消化，酶切
Ｍ．ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１～８编号同表１（图２同）
图１ 限制性内切酶ＲｓａⅠ对绞股蓝属及其混淆品
ｃｐＤＮＡｔｒｎＫ１ｆｔｒｎＫ２ｒ基因的ＰＣＲＲＦＬＰ分析
图２ 限制性内切酶ＨｐａⅡ对绞股蓝属及其混淆品
ｃｐＤＮＡｒｐ１２０５ｒｐｓ１２基因的ＰＣＲＲＦＬＰ分析
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识别序列为ＧＴ↓ＡＣ，绞股蓝、疏花绞股蓝、喙果绞
股蓝、广西绞股蓝、心籽绞股蓝、长梗绞股蓝等６个
物种在该位点无变异，得到的酶切图谱一致，酶切后
得到４条谱带，分别是１０００，８２０，４８０，３２０ｂｐ，五柱
绞股蓝在该位点存在变异，在６３０ｂｐ处出现其特征
性谱带，乌蔹莓经酶切后产生 ４条谱带，分别是
８４０，６８７，４９５，３０７ｂｐ，与绞股蓝属植物比对，在
１０００ｂｐ处无谱带的出现，同时６８７ｂｐ处出现其特
征性谱带，由此可将乌蔹莓与绞股蓝属进行明显区
分（图１）。
３．３ 个体差异的研究 为检测种内不同个体间的
差异，选择ｔｒｎＫ１ｆｔｒｎＫ２ｒ和ＲｓａⅠ的组合对收集的乌
蔹莓Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ１０个不同个体进行 ＰＣＲＲＦＬＰ检
测，结果显示混淆品的个体差异不会影响 ＰＣＲ
ＲＦＬＰ鉴别结果。
４ 讨论
关于绞股蓝属与乌蔹莓的区分研究，前人主要
集中于广布种绞股蓝 Ｇ．ｐｅｎｔａｐｈｙｌｕｍ与乌蔹莓的
区别，常用的方法包括形态鉴别与理化鉴别［１７１８］，
２００３年王太霞报道通过石蜡切片的方法分析两者
在茎叶解剖结构上的差异［１９］，程存归等采用傅立叶
变换红外光谱法对两者进行区分［２０］，近年来，随着
绞股蓝药材市场需求的提高，除广布种绞股蓝外，该
属其他物种也相继扩充为药用植物资源，在药材市
场中占有一定比例，绞股蓝属内在形态结构［１］，皂
苷含量［２１］，黄酮含量［２２］显微结构［２３］等方面均存在
差异，因此，选择适当的方法准确、快速地区分绞股
蓝属植物与乌蔹莓对保证绞股蓝药材来源具有实际
意义。
本研究曾尝试采用 ＩＳＳＲ方法对乌蔹莓与绞股
蓝属植物进行区分鉴定，但由于该种标记提供的信
息位点丰富，属内多态性高，不易清晰地将混淆种与
该属植物区别。
本研究所采用的 ｔｒｎＫ基因编码高等植物叶绿
体基因组中的赖氨酸 ｔＲＮＡ，具有较强的保守性，可
避免种内差异的影响，适合于种间鉴别研究，前人已
根据ｔｒｎＫ基因序列变异，通过 ＰＣＲＲＦＬＰ方法对白
术属及川产姜黄属植物进行种间分子鉴定［２４２５］。
本实验将ＰＣＲＲＦＬＰ方法引入绞股蓝属植物与混淆
品的区分鉴定，ＲｓａⅠ和ｔｒｎＫ１ｆｔｒｎＫ２ｒ的组合可将混
淆种清晰地区分出来，实验表明，该技术具有操作简
便，结果稳定，重复性好等特点，能有效快速地鉴别
绞股蓝属植物及其混淆品。
该方法对样品质量要求较低，可以为新鲜或干
燥茎叶，酶切结果稳定、重复性好，种内差异对结果
影响不明显，然而市场上的商品绞股蓝大多经历一
系列高温处理，制成干品后，ＤＮＡ破坏严重，为其分
子鉴定带来较大难度，寻找商品绞股蓝快速ＤＮＡ提
取方法并进行分子鉴定是下一步需要解决的问题。
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ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｙｎｏｓｔｅｍｍａｆｒｏｍｔｈｅｉｒａｄｕｌｔｅｒａｎｔＣａｙｒａｔｉａｊａｐｏｎｉｃａ
ｂｙＰＣＲ－ＲＦＬＰ
ＷＡＮＧＣｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＹｕａｎｙｕａｎ，ＹＡＮＧＪｕａｎ，ＪＩＡＮＧＬｉｎｇｙａｎ，ＬＩＭｉａｏｍｉａｏ，ＺＨＡＯＧｕｉｆａｎｇ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＷｅｓｔｅｒｎＣｈｉｎａ（ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），
ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｘｉ＇ａｎ７１００６９，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄｅｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｙｎｏｓｔｅｍｍａａｎｄＣａｙｒａｔｉａｊａｐｏｎｉ
ｃａ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｅｉｇｈｔｓｐｅｃｉｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＧｙｎｏｓｔｅｍｍｐｅｎｔａｐｈｙｌｕｍ，Ｇ．ｐｅｎｔａｇｙｎｕｍ，Ｇ．ｃａｒｄｉｏｓｐｅｒｍｕｍ，Ｇ．ｌｏｎｇｉｐｅ，Ｇ．ｙｉｘｉｎｇｅｎｓｅ，Ｇ．
ｌａｘｉｆｌｏｒｕｍ，Ｇ．ｇｕａｎｇｘｉｅｎｓｅａｎｄＣ．ｊａｐｏｎｉｃａｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈＰＣＲ－ＲＦＬＰｏｆｓｉｘｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅｓｉｘｇｅｎｅ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｓｉｘｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＴａｑⅠ，ＨｐａⅡ，ＥｃｏＲⅠ，ＲｓａⅠ，ＨｈａⅠ，ＨｉｎｄⅢ．Ｒｅ
ｓｕｌｔ：ＳｅｖｅｎｓｐｅｃｉｅｓｏｆＧｙｎｏｓｔｅｍｍａａｎｄｔｈｅｉｒａｄｕｌｔｅｒａｎｔｃｏｕｌｄｂｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｔｒｎＫ１ｆｔｒｎＫ２ｒａｎｄＲｓａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＰＣＲ－ＲＦＬＰｐｒｏ
ｖｉｄｅｓａｑｕｉｃｋ，ｒｅｌｉａｂｌｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｙｎｏｓｔｅｍｍａａｎｄｔｈｅｉｒａｄｕｌｔｅｒａｎｔＣａｙｒａｔｉａｊａｐｏｎｉｃａ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ；Ｃａｙｒａｔｉａｊａｐｏｎｉｃａ；ＰＣＲＲＦＬＰ；ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
［责任编辑 吕冬梅］
［收稿日期］ ２００７１２１２
［基金项目］ 国家农业成果转化资金重点项目（０５ＥＦＮ２１３４００１２４）；淮北市重大专项（０６０８５）
［通讯作者］ 薛建平，Ｔｅｌ：（０５６１）３８０２０２５，Ｅｍａｉｌ：ｘｕｅｊｐ２０００＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
半夏试管块茎银染 ｍＲＮＡ差异显示条件的
建立及优化
薛建平１，黄月琴１，２，徐有明２，田振东２
（１．淮北煤炭师范学院 生命科学学院 资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北 ２３５０００；
２．华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉 ４３００７０）
［摘要］ 目的：建立半夏试管小块茎ＤＤＲＴＰＣＲ反应最佳体系，为进一步研究半夏试管小块茎相关基因表达
提供技术参考。方法：以半夏试管苗的叶柄
试管小块茎为材料，利用正交试验设计，研究模板。Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰｓ，引
物和ＤＮＡ聚合酶等因素，对ＤＤＲＴＰＣＲ反应体系的影响。结果与结论：２０μＬ的反应体系中含有 ｄＮＴＰｓ１５０μｍｏｌ
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第３３卷第１９期
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