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Research on optimization system on tissue culture and rapid propagationof Pueraria mirifica

泰国葛组织培养和快速繁殖体系优化研究



全 文 :泰国葛组织培养和快速繁殖体系优化研究
黄宁珍,唐凤鸾,何金祥,付传明,何成新,郭伦发,王新桂
(广西壮族自治区中国科学院 广西植物研究所,广西 桂林 541006)
[摘要] 目的:研究泰国葛的组织培养与快速繁殖技术。方法:以嫩枝为外植体,通过调整基本培养基、生长
调节剂种类和配比、以及向培养基中添加特殊化合物,以期选择出适合的诱导、继代增殖和生根培养基配方。结
果:MS+IBA005mg·L-1+BA05mg·L-1利于诱导出芽,可用于初代培养;MS+IBA002mg·L-1+BA02
mg·L-1和MS+BA01mg·L-1可用于增殖和继代培养,25d繁殖系数30;1/2MS+IBA01mg·L-1+IAA02
mg·L-1+C(特殊化合物)10mg·L-1适于诱导生根获得再生植株,生根率769%。生根苗春、夏季移栽,成活率
810%。结论:本方法可用于泰国葛种苗的快速繁殖。
[关键词] 泰国葛;组织培养;快速繁殖
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)19217505
[收稿日期] 20071126
[基金项目] 广西科技攻关项目(桂科攻03220881A)
[通讯作者] 王新桂,Tel:13978322000,Email:wxg@gxib.cn
  泰国葛Puerariamirifica产于泰国,属豆科葛属
植物,生长在泰国北部的原始森林中,为泰国的珍稀
保护植物,其根块生长在地下2m深处,含有丰富的
女性荷尔蒙诱导素和春量素醇诱导素,可促进人体
自然分泌丰乳所必需的女性荷尔蒙及春量素醇。研
究发现,在泰国野葛的块根中含有多种高活性的异
黄酮,其活性比一般黄豆类制品中的异黄酮高100
多倍,是迄今为止所发现的活性最高的异黄酮类化
合物[1],其具有调节动物体内促性腺激素水平[2],
促进成年动物性器官再生和提高生育能力[3],延缓
衰老[4]和防骨质疏松[5]等症。目前为止,泰国葛的
组织培养和快速繁殖技术研究未见报道。
1 材料
从泰国引进泰国葛种子,本所研究员李光照鉴
定。栽种于桂林植物园中,从植株上剪下新稍为外
植体。
2 方法
2.1 外植体的选择和消毒
选择泰国葛嫩枝,在自来水下冲洗干净,在无菌
工作台上摘除叶及叶鞘,剪成3~5cm长节段,用
75%的乙醇处理30~50s;再用01%的 HgCl2浸泡
3,5,7min,或 10%的 NaClO浸泡 10,20min,或
20%的NaClO浸泡10min;无菌水浸洗5次,吸水纸
吸干表面水分,剪除两端切口,接种于备好的诱导培
养基中。
2.2 培养基的制备
以MS,N68,B5,ER,N6,1/2MS,1/2N68为基本
培养基,根据不同阶段的培养目的和要求,添加不同
种类和质量浓度的植物激素类物质及特殊化合物,
包括6BA(6benzylaminopurine),2ip[N6(delta2
isopentenyl)adenine],NAA(naphthalene acetic
acid),IBA(indol3butyricacid),BR(2,4epibrassin
olide),2,4D(2,4dichlorophenoxyaceticacid)及特
殊化合物A,B,C等,并附加30%蔗糖、06%的琼
脂,pH58。分装后,于温度121℃、压力为105Pa
的条件下灭菌25min。
2.3 培养条件
材料接种后,在平均光密度为40μmol·m-2·
s-1的光照下培养;光照时间12h·d-1;温度(28±
3)℃。
2.4 离体培养过程
主要包括3个过程:①初代培养,将经表面消毒
的外植体接入诱导出芽的培养基上,一般约20~30
d的培养,形成绿色新芽或胚状体;②继代培养,将
新形成的小芽或胚状体接入继代增殖培养基中,经
25d左右的培养,形成丛生芽,将丛生芽分割并剪
成1cm长的带节小段,接入继代增殖培养基中培
养,每瓶接种外植体3~5个,继代的次数和量根据
需要而定;③生根培养,当继代增殖的芽苗长到 3
cm高、具2~4片真叶时,将芽苗从基部剪下,整枝
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接入生根培养基中,每瓶接种3~5株,培养25d左
右,小苗根系长成。
2.5 生根苗移栽
将长好根的试管小苗在4~10月间于室温下炼
苗1~2d,洗净根际培养基,以灼烧过的草皮土为移
栽基质,移栽后在70%荫蔽度的大棚中培养,注意
保持湿度。
3 结果
3.1 外植体采集及消毒
泰国葛属热带植物,在合适的温度条件下抽
梢快,营养生长旺盛,因此每年的4~10月均可采
样。由于枝条剪下后有白色浆液从伤口泌出,影
响材料的消毒效果,加上泰国葛对 HgCl2及 NaClO
等消毒剂比较敏感,消毒过程中死亡率比较高。
综合处理时间、杀菌效果及材料的死亡率等因素,
适合消毒方法为01% HgCl2处理3min,消毒成功
率为33%。
3.2 初代培养中外源激素对初代芽形成的影响
在初代培养中,以 MS为基本培养基,按 10∶1
的比例添加植物细胞分裂素(BA:02,05,10mg
·L-1)和生长素(IBA:002,005,01mg·L-1),
根据不同的质量浓度水平共设置3种不同的培养
基。结果表明,低质量浓度的外源激素(BA02mg
·L-1,IBA002mg·L-1),培养材料出芽率低,生
长速度慢;中等质量浓度的外源激素(BA05mg·
L-1,IBA005mg·L-1),材料出芽率稍高,并形成
少量胚状体,培养后期材料轻微玻璃化;高质量浓度
(BA10mg·L-1,IBA01mg·L-1)的外源激素,
材料形成胚状体的频率稍高,但培养后期材料玻璃
化比较严重。通过综合比较,培养基 MS+BA05
mg·L-1+IBA005mg·L-1适用于泰国葛的初代
培养,一般培养3周左右,可将新形成的小芽或胚状
体接入继代增殖培养基中。
3.3 继代培养
3.3.1 不同基本培养基对泰国葛继代增殖的影响
 在继代培养中,培养基中的激素质量浓度不变
(BA01mg·L-1),调整基本培养基成分,结果表
明,在所试的 7种基本培养基中,B5,ER,N6,1/2
MS,1/2N685种培养基上的培养材料均不能正常生
长;在培养效果较好的 MS和 N682种培养基中,MS
培养基上材料的增殖倍数、生长速度以及小苗的外
部形态稍优于 N68。因此,泰国葛继代增殖的基本
培养基应为MS。
3.3.2 外源激素种类和组合对泰国葛继代增殖的
影响 初步的继代培养发现,泰国葛离体材料即使
在较低的外源激素水平下也很容易玻璃化,因此,
采用低质量浓度的 BA(005~02mg·L-1),IBA
(0~002mg·L-1)和不易导致培养材料玻璃化的
2ip(05~20mg·L-1)为外源激素,进行继代培
养基筛选(表1)。结果表明,芽苗高度、繁殖系数
并未随BA,IBA或2ip质量浓度的变化而呈现有
规律性的变化;材料的玻璃化与BA和IBA两者质
量浓度的加和有关,即当两者均达到一定的水平时
才导致玻璃化的产生;培养基中添加2ip,导致材
料产生较多的愈伤组织,2ip质量浓度较高(20mg
·L-1)时并未出现玻璃化(表1)。比较适合的继代
培养基为:MS+BA01mg·L-1和MS+BA02mg
·L-1+IBA002mg·L-1。使用上述2个培养基
对泰国葛离体材料重复继代,结果发现,2种培养
基交替使用比1种重复使用效果更好,25d的繁殖
系数为30~35倍。由于在继代培养中较容易产
生无效的白色絮状的愈伤组织,这种愈伤组织阻隔
在培养基和培养材料之间,切断植株吸收营养的路
径,在培养后期容易使植株因营养不良而逐渐衰
亡,因此,继代周期,以20~25d为宜。
3.4 生根培养
3.4.1 生长素类激素种类和质量浓度对泰国葛生
根的影响 以1/2MS为基本培养基,通过初步的生
根培养发现,泰国葛在添加 NAA,IAA,IBA,2,4D,
BR5种生长素类物质的生根培养基上生根效果不
同(表2)。BR和2,4D在所试的范围内诱导的生
根率为0;其中,BR导致培养材料黄化、不能正常生
长;2,4D则导致形成较多的愈伤组织,且随着2,4
D的增加褐化加深。IAA,IBA,NAA对促进生根有
一定的效果,但诱导的生根率较低,最高仅为
300%,其中 IAA,IBA诱导生根效果稍优于 NAA。
通过观测还发现,葛根正常生长所需的外源生长素
类物质质量浓度较低,高质量浓度容易导致叶片黄
化、愈伤过多并且褐化等负面效应,影响植株生长发
育;在相同质量浓度下,不同生长素类物质对培养材
料产生负面效应为BR>2,4D>NAA>IBA=IAA。
IAA和 IBA诱导生根的最适质量浓度 005~02
mg·L-1。
3.4.2 IAA和IBA配合使用对泰国葛生根的影响
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表1 不同激素质量浓度及组合对泰国葛继代生长的影响
No.
培养基
/mg·L-1
芽高
/cm
长芽数
/个
25d繁殖系数
/倍
愈伤数量及形态 植株形态
1 MS+BA01 35 20 30 中等,白色疏松 小苗绿,中等粗壮,生长正常
2 MS+BA005+IBA0005 20 20 25 多,白色疏松 小苗绿,偏细,生长正常
3 MS+BA01+IBA0005 15 20 20 多,白色疏松 小苗绿,中等粗壮,生长正常
4 MS+BA01+IBA001 20 20 24 较多,白色疏松 小苗绿,中等粗壮,生长正常
5 MS+BA02+IBA001 10 25 25 多,白色疏松 小苗矮,细弱,生长稍差
6 MS+BA01+IBA002 15 20 20 多,白色疏松 小苗矮,细弱,长势稍差
7 MS+BA02+IBA002 25 25 30 多,白色疏松 小苗较壮,部分材料玻璃化
8 MS+2ip05+IBA0005 25 20 30 多,白色疏松 小苗绿,中等粗壮,生长正常
9 MS+2ip10+IBA0005 15 20 20 多,白色疏松 小苗矮,细弱,部分植株叶发黄凋落
10 MS+2ip05+IBA001 05 10 10 很多,白色疏松 小苗矮、弱,部分植株叶发黄凋落
11 MS+2ip10+IBA001 13 20 20 多,白色疏松 小苗矮、细弱,部分植株叶发黄凋落
12 MS+2ip20+IBA001 05 20 20 多,白色疏松 小苗矮、弱,部分植株叶发黄凋落
  注:每个处理5瓶,每瓶5株,培养20d后观测
表2 不同种类生长素及质量浓度对泰国葛生根的影响
No.
培养基
/mg·L-1
培养时间
/d
观测数
/株
生根率
/%
培养材料形态
愈伤 根 叶 植株
1 1/2MS+NAA005 32 25 120 中等 细、长,有须根 正常 良好
2 1/2MS+NAA01 32 25 120 中等,轻微褐化 细、长,有须根 正常 良好
3 1/2MS+NAA02 32 25 120 中等,褐化 细、长,有须根 正常 正常
4 1/2MS+NAA05 32 25 80 大,褐化 粗、长,须根少 黄化 黄化
5 1/2MS+NAA10 32 25 40 大,褐化 粗、短,无须根 黄化 黄化
6 1/2MS+IAA005 25 30 300 中等 中、长,有须根 黄叶少 良好
7 1/2MS+IAA01 25 30 201 中偏小 中、长,有须根 黄叶少 正常
8 1/2MS+IAA02 25 30 300 中等 中、长,有须根 黄叶稍多 正常
9 1/2MS+IAA05 25 28 213 中偏大,轻微褐化 中、长,有须根 黄叶稍多 正常
10 1/2MS+IAA10 25 30 300 中偏大,轻微褐化 中、长,有须根 黄叶稍多 稍差
11 1/2MS+IBA005 25 24 126 小 中、长,有须根 黄叶少 正常
12 1/2MS+IBA01 25 25 240 中等 中、长,有须根 黄叶少 正常
13 1/2MS+IBA02 25 24 126 中等 中、长,有须根 黄叶少 正常
14 1/2MS+IBA05 25 28 213 中等,轻微褐化 中、长,有须根 黄叶稍多 稍差
15 1/2MS+IBA10 25 30 300 中偏大,褐化 中、长,有须根 黄叶稍多 稍差
16 1/2MS+2,4D005~02 32 30 0 中偏大,褐化 - 黄叶少 正常
17 1/2MS+2,4D05~10 32 30 0 大,深度褐化 - 黄叶稍多 稍差
18 1/2MS+BR0005~05 32 30 0 - - 叶黄 较差
IAA,IBA配合使用均能有效提高生根率,而且可以
在一定程度上消除单种生长素高质量浓度下使用所
产生的负面效果(叶片黄化脱落、愈伤褐化等)。根
据实验结果,以组合 IBA01mg·L-1 +IAA
02~04mg·L-1诱导的生根率最高,为 668%,
因此,泰国葛生根较好的激素组合为 IBA01mg·
L-1+IAA02mg·L-1(表3)。
3.4.3 特殊有机添加物对泰国葛生根的影响 
IAA和IBA配合使用虽然能有效提高泰国葛的生根
率,但最高生根率也仅达到668%。因此在此基础
上,向培养基中加入特殊成分的化合物以提高生根
率十分必要。对3种特殊化合物A,B,C(添加质量
浓度均为5,10,20,40mg·L-1)的实验结果表明,
10mg·L-1的化合物 C对促进泰国葛的生根效果
最好,生根率比仅添加IBA01mg·L-1和IAA02
mg·L-1提高了101%,达769%(表3)。
3.5 移栽和炼苗
组培苗生根培养 25d后,将长好根的瓶苗开
盖炼苗1~2d,洗净根际培养基,移栽在装有相应
移栽基质的营养杯中,于阴蔽度为 70%的连栋大
棚中培养,移栽开始7d内每天早晚各喷1次水,7
d后隔2~3d淋水 1次,45d后观测,成活率为
810%。
4 讨论
在葛根类植物的组织培养研究中,已有的研究
主要围绕野葛 P.lobata(Wild.)Ohwi、三裂叶葛
P.phaseoloides(Roxb.)Benth和粉葛 P.thomsoni
Benth3种植物进行[69]。
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表3 IAA,IBA和特殊有机添加物配合使用对泰国葛生根的影响
No.
培养基
/mg·L-1
培养时间
/d
观测数
/株
生根率
/%
培养材料形态
愈伤 根 叶 植株
1 1/2MS+IBA01+IAA005 23 30 300 中等 中等粗,有须根 绿,无黄叶 正常
2 1/2MS+IBA01+IAA01 23 30 201 中等 中等粗,有须根 绿,无黄叶 正常
3 1/2MS+IBA01+IAA02 23 24 668 中等 中等粗,有须根 绿,无黄叶 正常
4 1/2MS+IBA01+IAA04 23 30 668 中偏大 中等粗,有须根 绿,无黄叶 正常
5 1/2MS+IBA02+IAA005 23 28 222 中等 中等粗,有须根 绿,无黄叶 正常
6 1/2MS+IBA02+IAA01 23 30 300 中等 中等粗,有须根 绿,无黄叶 正常
7 1/2MS+IBA02+IAA02 23 27 259 中等 中等粗,有须根 绿,无黄叶 正常
8 1/2MS+IBA02+IAA04 23 30 200 中等 中等粗,有须根 绿,黄叶少 稍差
9 1/2MS+IBA04+IAA005 23 30 230 中等 中等粗,有须根 绿,无黄叶 正常
10 1/2MS+IBA04+IAA01 23 30 200 中等 中等粗,有须根 绿,黄叶少 稍差
11 1/2MS+IBA04+IAA02 23 30 167 中等 中等粗,须根偏少 绿,黄叶少 较差
12 1/2MS+IBA04+IAA04 23 26 192 偏大 中等粗,须根少 黄叶稍多 较差
13 1/2MS+IBA01+IAA02+有机添加物C10 28 29 769 中等 中等粗,有须根 绿,无黄叶 正常
  在继代培养中,根据已有的文献报道[69],野葛、
三裂叶葛和粉葛3种植物所用的BA质量浓度较高,
其中三裂叶葛增殖和分化的 BA最高,达30mg·
L-1;粉葛较低,为03~06mg·L-1。而研究结果表
明,泰国葛继代增殖所用的BA质量浓度和上述3种
葛类植物相差很大,主要原因是泰国葛对BA比较敏
感,高质量浓度使用易导致玻璃化,因此,增殖和继代
培养的最适质量浓度仅为01~02mg·L-1,当BA
大于02mg·L-1时,培养材料随着BA质量浓度的
增大出现不同程度的玻璃化,但玻璃化材料在低浓度
BA培养基上可以恢复正常;而且,泰国葛在继代培养
中很容易形成白色絮状的无效愈伤组织,愈伤组织的
量随着外源生长素类物质的增高而增多,随着培养时
间的延长,愈伤块可能在营养上和芽苗竞争,或阻断
芽苗吸收营养的通路,导致植株生长停止,叶片发黄
脱落,最后逐渐死亡。因此,继代培养中除了注意调
低激素类物质的用量外,继代时间间隔也不能过长。
在生根培养中,泰国葛和其他葛类植物不同,是一种
比较难生根的物种。根据相关文献[67],诱导野葛、
三裂叶葛和粉葛 3种植物生根的外源激素均为
NAA,最适质量浓度分别为10,01,02mg·L-1。
而对于泰国葛而言,NAA诱导的生根效果不如 IAA
和IBA理想,多种激素配合使用以及添加特殊有机
物可有效提高泰国葛的生根率。刘传飞[10]对野葛
的试验结果与本研究部分结果有类似之处,他研究
发现,IBA是诱导野葛产生不定根最有效的生长素
类物质,在相同质量浓度条件下,几种生长素类物质
对培养材料的褐化效应为 NAA>IBA>IAA。对泰
国葛的研究结果也表明,IAA和 IBA生根效果相对
较好;对培养材料的负面效应(叶黄化和愈伤褐化
等)BR>2,4D>NAA>IBA=IAA。然而,对于泰
国葛而言,由于单种生长素类物质诱导的生根率偏
低,因此,必须将多种生长素类物质配合使用,同时
添加特殊的有机物,才能获得理想的生根效果。
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第33卷第19期
2008年10月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 19
 October,2008
Researchonoptimizationsystemontissuecultureandrapidpropagation
ofPuerariamirifica
HUANGNingzhen,TANGFengluan,HEJinxiang,FUChuanming,HEChengxin,GUOLunfan,WANGXingui
(GuangxiinstituteofBotany,GuangxiZhuangzuAutonomousRegionandAcademiaSinica,Guilin541006,China)
[Abstract] Objective:TostudythetissuecultureandrapidproliferationtechniquesofPuerariamirifica.Method:Thetender
branchwereusedasexplantsandcultivatedindiferentmedia.Theoptimummediaforinducingbuds,proliferationandrootingwere
selectedbyadjustingthekindsanddosesofplanthormonesandspecialcompounds.Result:ThemediumofMS+IBA0.05mg·
L-1+BA0.5mg·L-1wassuitableforbuds'inducingandcouldbeusedinthefirstgenerationcultivation;MS+IBA0.02
mg·L-1+BA0.2mg·L-1andMS+BA0.1mg·L-1wereemployedbyturnsinsubculture,25dayspropagationcoeficientwas
30;andthemediumof1/2MS+IBA0.1mg·L-1+IAA0.2mg·L-1+C(specialcompound)10mg·L-1wasusedforrootsin
ducing,therootingratewas76.9%.Rootingplantletsweretransplantedinspringandsummer;thesurvivingratewas81.0%.Con
clusion:ThistechniquesystemcouldbeemployedforrapidpropagationofP.mirifica.
[Keywords] Puerariamirifica;tissueculture;rapidpropagation
[责任编辑 吕冬梅]
[收稿日期] 20071228
[基金项目] 科技部社会公益研究专项资金项目(109)
[通讯作者] 黄璐琦,Tel:(010)640144112955,Email:huan
gluqi@263.net
荒漠肉苁蓉变异类型的探讨
陈 敏,崔光红,肖苏萍,林淑芳,吴志刚,黄璐琦
(中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:通过药材性状和结构以及有效成分含量等方面的比较研究,进行荒漠肉苁蓉中“油苁蓉”作为
变异类型的探讨。方法:药材性状和结构直接观察肉苁蓉新鲜及晒干或阴干的表面颜色和质地,以及横切面颜色、
质地、中心髓部大小及维管束排列等;高效液相色谱法测定药材有效成分松果菊苷及毛蕊花糖苷的含量;紫外分光
光度法测定药材粗多糖含量。结果:“油苁蓉”与一般荒漠肉苁蓉在新鲜茎的颜色、药材表面颜色和质地以及横切
面颜色、质地、中心隧部大小及维管束排列存在明显的不同;“油苁蓉”药材松果菊苷含量是一般荒漠肉苁蓉的25
倍,毛蕊花糖苷含量是38倍;多糖得率是16倍,多糖含量是2倍。结论:根据药材性状和结构以及有效成分含量
的分析,“油苁蓉”和一般肉苁蓉差异明显,“油苁蓉”是荒漠肉苁蓉一种稳定的变异类型,与生态环境条件和地理
分布无关。
[关键词] 荒漠肉苁蓉;药材性状和结构;有效成分;变异类型
[中图分类号]R282.5,R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)19217903
  荒漠肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma为列
当科肉苁蓉属多年生寄生肉质草本,是常用中药材,
内蒙古为荒漠肉苁蓉的地道产区之一,主产于阿拉
善盟、巴彦淖尔盟、伊克昭盟及乌兰察布盟;以阿拉
善盟产量最大,当地人常将肉苁蓉酒炙,用于暖胃、
壮阳健身、强壮筋骨等,有很好的疗效,俗称“沙漠
人参”。作者在内蒙古实地调查中发现荒漠肉苁蓉
中存在着新鲜茎为淡紫色,阴干后药材质地柔软,外
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第33卷第19期
2008年10月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 19
 October,2008