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Puerarin suppresses the proliferation of vscular smooth muscule cells and c-fos and bcl-2 protein expression

葛根素抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖及c-fos和bcl-2蛋白表达



全 文 :µ¨¦¨³·²µ¶¤±§ ¬¯ª¤±§¶q Χψτοκινε Γροωτη Φαχτορ Ρεϖ, usst otuktl }| q
≈y  许碧连 o吴 铁 o王 晖 q淫羊藿总黄酮药理作用的研究现
状 q中国临床药理学与治疗学 oussv o{ktl }ttx q
≈z  ¬½∏±² ‘o Œ¬±∏°¤  o פ±¤®¤ × o ετ αλ. ƒ¯ ¤√²±²¯ ª¯¼¦²¶¬§¨¶¬±
Επιµεδιυµ σπεχιεσ . Χηεµ Πηαρµ Βυλλot|{{ ovyk|l }vw{z q
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ussw ouzk{l }yus q
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中国骨质疏松杂志 oussx ottktl }|w q
Εφφεχτ οφ Ηερβα Επιµεδιι φλαϖονε ον τηε οστεοβλαστσ µεταβολισµ ιν ϖιτρο
Œ˜ ≠¬2«¨ ±ªt o‹„‘Š ‹¤¬2¼¬±ªu o„‘Š ‹²±ª2°¬±t o≤‹∞‘Š ∏±2¦«¤±ªt
(t1 ∆επαρτµεντ οφ Ορτηοπεδιχσ , Σεχονδ Ηοσπιταλ οφ Ξι. αν ϑιαοτονγ Υνιϖερσιτψ, Ξι. αν ztsssw , Χηινα ;
u1 ∆επαρτµεντ οφ Ανατοµψ, Μεδιχαλ Χολλεγε οφ Ξι. αν ϑιαοτονγ Υνιϖερσιτψ, Ξι. αν ztssyt , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ ¬¨³¯²µ¨ ·«¨ ©¨©¨¦·²© ‹ µ¨¥¤ ∞³¬° §¨¬¬©¯¤√²±¨ k‹∞ƒl ²±·«¨ ²¶·¨²¥¯¤¶·° ·¨¤¥²¯¬¶° ιν ϖιτρο q Μετηοδ : ’¶2
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[ Κεψ ωορδσ] ‹ µ¨¥¤ ∞³¬° §¨¬¬©¯¤√²±¨ ~²¶·¨²¥¯¤¶·~²¶·¨²³²µ²ª¨·¨µ¬±~µ¨¦¨µ·²µ¤¦·¬√¤·²µ±∏¦¯ ¤¨µ©¤¦·²µ®¤³³¤ … ¬¯ª¤±§~¦¨¯¯ ¦∏¯·∏µ¨
≈责任编辑 方文贤 
≈收稿日期  ussx2sv2u{
≈通讯作者  3许轶洲 oר¯ }ksxztl{zsyxzst o ∞2°¤¬¯}´´ ¼½¬∏ƒ
½­tyx1¦²°
葛根素抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖及
¦2©²¶和 ¥¦¯2u蛋白表达
许轶洲 3 o高 炎 o李佩璋 o王宁夫 o徐海鹰 o童国新
k杭州市第一人民医院 o浙江 杭州 vtsssyl
≈摘要  目的 }观察葛根素对血管平滑肌细胞k∂≥≤l增殖的影响及对 ¦2©²¶和 ¥¦¯2u蛋白的表达作用 o旨在认识
葛根素作用的分子机制 ∀方法 }建立凝血酶k×l诱导 ∂≥≤增殖的模型 o以细胞计数和流式细胞仪 ⁄‘„含量测定 !细
胞周期分析法观察 ×及葛根素对 ∂≥≤增殖和 ⁄‘„合成的影响 ∀ ×及葛根素等各处理因素作用 uw «后 o用免疫印迹
法k • ¶¨·¨µ± ¥¯²·l检测 ¦2©²¶蛋白和 ¥¦¯2u蛋白表达 ∀结果 }×对 ∂≥≤有明显促增殖作用 o促增殖效应在 uw «末达峰 o且
×在 s1t ∗ t1s ˜#pt有剂量依赖关系 ~葛根素呈剂量依赖性地抑制 ×诱导的细胞增殖 !⁄‘„合成以及 ∂≥≤ ¦2©²¶和
¥¦¯2u蛋白的表达 ∀结论 }葛根素能抑制 ×诱导的 ∂≥≤增殖 o这可能与其抑制 ¦2©²¶和 ¥¦¯2u蛋白表达有关 ∀
≈关键词  凝血酶 ~葛根素 ~血管平滑肌细胞 ~增殖
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussylsy2sw|s2sw
血管平滑肌细胞k∂≥≤l增殖在动脉粥样硬化 !
经皮冠状动脉腔内球囊成型术后再狭窄和高血压等
多种心血管疾病的发生发展过程中起关键作用≈t  o
因而寻求能够抑制 ∂≥≤增殖的手段具有重要的临
床意义 ∀葛根素k³∏¨µ¤µ¬±l是从豆科植物野葛干燥
根中提取的一种异黄酮类化合物 o具有降血脂 !抗动
脉硬化等作用≈u  o广泛应用于心脑血管疾病的治疗
中 ∀但有关葛根素治疗血管性疾病的作用靶点及分
子机制的研究 o目前还不多见 o其对冠心病的治疗作
#s|w#
第 vt卷第 y期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ y
¤µ¦«oussy
用可能与其抗 ∂≥≤ 增殖有关 ∀本实验中 o建立凝
血酶k×l诱导的 ∂≥≤增殖模型 o以葛根素作为干预
因素观察其对 × 诱导 ∂≥≤ 增殖的影响 o并进一步
观察葛根素对原癌基因 ¦2©²¶及 …¦¯2u表达的影响 o
探讨其可能存在的抑制 ∂≥≤ 增殖的分子机制 o从
而为葛根素药物的临床应用和深入开发提供实验依
据 ∀
1 材料和方法
111 主要试剂
胎牛血清kƒ…≥l和 ⁄∞ 培养液kŠ¬¥¦²公司产
品l o凝血酶k≥¬ª°¤公司产品l o葛根素注射液k浙江
康恩贝集团提供l o兔抗大鼠 ¦2©²¶多克隆抗体
k≥¤±·1≤µ∏½公司产品l o兔抗大鼠 …¦¯2u多克隆抗体
k≥¤±·1≤µ∏½公司产品l ∀
112 ∂≥≤体外培养及鉴定
组织贴块法培养 ∂≥≤ ∀无菌条件下分离 ≥⁄
大鼠胸主动脉 o剪碎后加入含 ts h ƒ…≥的 ⁄∞ 培
养液 ovz ε ox h ≤’u孵箱内静置培养 ∀实验用 w ∗ |
代细胞 ∀用光镜和免疫组化方法进行鉴定 ∀
113 细胞计数
w ∗ |代 ∂≥≤以每孔 tsx的密度种于 y孔培养
板 o培养至 zs h 汇合 o换成 s1x h 新生小牛血清
k‘…≥l n ⁄∞ 静息 w{ «o以不同剂量的 ×刺激 uw «
或 t ˜#°pt的 ×刺激不同时间或 t ˜#°pt的 ×和
不同浓度的葛根素刺激 uw «o然后将各孔细胞消化 o
再悬浮成为单细胞悬液 o置细胞计数板内计数 o每孔
重复 v次求平均值 ∀
114 流式细胞仪细胞周期分析
在上述各处理因素作用 uw «末 o制成单细胞悬
液 o预冷 °…≥漂洗 u次 ouss目滤网过滤 ozs h冷乙醇
固定 w ∗ uw «∀加 • ±¤¶¨kt ª#ptl每管 tss ˏovz ε
ts °¬±o再加入碘化丙啶染液kxs Λª#°ptl每管 {ss
ˏo置 w ε o反应 vs °¬±以上 ∀上流式细胞仪 o每个
样本检测 t万个细胞 o用计算机求细胞周期各时相
分布比率 o最后求得增殖指数 °Œ € ≈≥ n kŠurl r
≈kŠsrŠtl n ≥ n kŠurl  ∀
115 蛋白免疫印迹分析k • ¶¨·¨µ± ¥¯²·l
∂≥≤经上述各处理因素作用 uw «末 o以预冷
的 °…≥清洗 v次 o加入 t °细胞裂解液 w ε 裂解细
胞 t «ow ε tx sss ≅ γ 离心 x °¬±∀取上清以 ƒ²¯¬±
酚法测定蛋白质含量 ∀每个样本取总蛋白 ts Λªo沸
水浴 x °¬±变性 otu h ≥⁄≥2聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
蛋白 o将蛋白转至硝酸纤维素膜上ktss ∂ ot «l ∀转
印蛋白质后的硝酸纤维素膜以含 x h 脱脂奶粉的
ׅ≥×封闭 vs °¬±o与稀释于封闭液中的一抗ktΒuss
稀释l孵育 ow ε 过夜 o漂洗后 o与辣根过氧化物酶标
记的山羊抗兔二抗于室温下摇床孵育 u «o再用 ׅ2
≥×洗膜 t «o其间更换 ׅ≥× w次 o然后将膜于 ∞≤
试剂中准确温浴 t °¬±o÷ 片曝光显影后经激光吸光
度扫描仪测定信号条带的积分吸光度值 ∀
116 统计方法
所有实验重复 v次 o数据以 cξ ? σ表示 o以 ≥°≥≥
ts1s软件进行统计分析 o假设检验采用单因素方差
分析 oΠ s1sx为差异具有显著意义 ∀
2 结果
211 ×对 ∂≥≤增殖的影响
21111 凝血酶与 ∂≥≤¶增殖的量效关系 不同浓
度 ×培养 uw «对 ∂≥≤¶细胞计数的影响 }与对照组
相比 o以 s1t os1v ot1s ov1s ots ˜#pt的 ×处理 ∂≥≤
uw «o∂≥≤ 细胞计数分别增加了kus1xs ? u1zyl h o
kx|1u{ ? z1tul h oktt|1tu ? |1sul h ok{w1u{ ?
y1yvl h及kvv1sy ? w1t{l h k Π s1sxl ∀其中 × 在
s1t ∗ t1s ˜#pt有剂量依赖关系k表 tl ∀
表 t 不同凝血酶浓度 uw «对 ∂≥≤¶增殖的影响
分组 剂量r˜#pt 细胞计数r ≅ tsw#°pt
对照组 w qs{ ? s qsx
×组 s qt w q{u ? s qtttl
s qv y qvz ? s qs|tl
t qs { qz{ ? s qs{tl
v qs z qvz ? s qsztl
ts x qu{ ? s qtutl
注 }与对照组比较tl Π s qsxk表 u同l
21112 凝血酶刺激 ∂≥≤ 增殖与时相的关系 采
用 t ˜#pt的 ×刺激 ∂≥≤ s ∗ w{ « o进行细胞计数 ∀
实验组结果与对照组比较 o各时间段均有明显促增
值作用k Π s1sxl ouw «时细胞计数达到峰值 ∀
根据上述结果 o在后续实验中 o凝血酶诱导
∂≥≤增殖的模型 o均选用 × 为 t ˜#pt o作用时间
为 uw «∀
212 葛根素对 ×诱导的 ∂≥≤增殖的抑制作用
21211 葛根素对 ∂≥≤ 细胞数量的影响 × 比对
照组高ktt{1yv ? |1z{l h的细胞计数k Π s1sxl o这
种增殖作用在被各浓度的葛根素预处理 t «后显著
地抑制 o与 × 组相比 o在葛根素浓度分别为 t1x ≅
tsp x ot1x ≅ tsp w ot1x ≅ tsp v °²¯#pt时 o抑制率分别
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为kts1|| ? t1y{l h okvu1tz ? v1vwl h okwu1ys ?
x1u|l h k Π s1sxl ∀
21212 葛根素对 ∂≥≤的 ⁄‘„含量的影响 经流
式细胞仪细胞周期分析 o检测 ⁄‘„ 含量 o测定增殖
指数 °Œ∀与对照组相比 o× 引起了 ku{x1vv ?
tz1{|l h 的 ⁄‘„ 含量的增加k Π  s1sxl o这种促
⁄‘„复制合成的作用能被各浓度的葛根素所抑制 ∀
与 ×组相比 o在葛根素浓度分别为 t1x ≅ tsp x ot1x ≅
tsp w ot1x ≅ tsp v °²¯#pt时 o抑制率分别为kuu1{y ?
v1utl h okvu1ut ? x1zul h okx{1t{ ? z1|ul h k Π 
s1sxl ∀葛根素的抑制作用呈剂量依赖关系 ∀
213 葛根素及 ×对 ¦2©²¶蛋白的影响
以对照组为 tss h o×作用 uw «使 ∂≥≤中的¦2
©²¶蛋白增加了ktxy1ss ? tt1u{l h k Π s1sxl o该作
用被各浓度的葛根素预处理 t «后抑制 o与 × 组相
比 o葛根素浓度分别为 t1x ≅ tsp x °²¯ #pt ot1x ≅
tsp w °²¯#pt ot1x ≅ tsp v °²¯#pt时 o抑制率分别为
kus1zs ? u1tul h okvt1yw ? x1uvl h okww1xv ?
z1w|l h k Π s1sxl ∀
214 葛根素及 ×对 ¥¦¯2u蛋白的影响
表 u 凝血酶 t ˜#pt促 ∂≥≤增殖的时相关系kcξ ? σl
组别 细胞计数r ≅ ts
w#°pt
s « y « tu « uw « vy « w{ «
对照组 w qss ? s qsu w qts ? s qsx w quw ? s qs| w qus ? s qtt w quy ? s qs{ w qu| ? s qtv
凝血酶组 w qss ? s qsy w qz{ ? s qtstl y qvy ? s qs{tl { qyw ? s qtutl y q|u ? s qs|tl w q|{ ? s qsztl
以对照组为 tss h o×作用 uw «使 ∂≥≤的 ¥¦¯2u
蛋白增加了k|y1yz ? {1vul h k Π s1sxl o× 的促进
作用被各浓度的葛根素预处理 t «后抑制 o与 × 组
相比 o葛根素浓度分别为 t1x ≅ tsp x ot1x ≅ tsp w ot1x
≅ tsp v °²¯#pt时 o抑制率分别为kz1tt ? s1z{l h o
kt{1z{ ? t1utl h okv|1x| ? y1vzl h k Π s1sxl ∀
3 讨论
∂≥≤的异常增殖是内膜肌层和内皮损伤的重
要标志 o在高血压 !动脉粥样硬化等≈t 的形成中具有
重要的作用 ∀儿茶酚胺 !血管紧张素 !内皮素等许多
促 ∂≥≤增殖的因子可通过其促 ∂≥≤ 增殖的效应
而引起上述病变的形成 ∀凝血酶作为丝氨酸蛋白
酶 o除了具有直接促进凝血 o在动脉损伤后血管壁血
栓形成中起重要作用外 o还有其他细胞效应 ∀本研
究显示 × 明显促进细胞数增加 o且在 s1t ∗ t1s ˜#
pt有剂量依赖性 o更高浓度时则量效关系不明显 ∀
有研究表明 × 是通过使凝血酶受体kו l活化而刺
激体外培养的 ∂≥≤增殖的≈v  o可能当 ×含量在 t1s
˜#pt时已达到受体饱和 o更高的浓度不能进一步
刺激 ∂≥≤ 的增殖 ∀这与 Š«²¶®等≈w 的实验结果一
致 ∀本研究亦发现 × 具有迟缓的促细胞增殖作用 ∀
可能部分与其诱导 ∂≥≤自分泌碱性成纤维细胞生
长因子k¥ƒŠƒl和血小板源生长因子2„链k°⁄Šƒ2„l
有关≈x  ∀
葛根素主要有效成分为 w oz2二羟基 {2Β2∆葡萄
糖异黄酮 o具有扩张血管 !改善微循环作用 o并能降
低血浆中儿茶酚胺及内皮素的含量 ~调节一氧化氮
合酶活性 o升高体内 ‘’ 水平≈y  ∀这些研究提示葛
根素对心脑血管具有有益的作用 o但机制未明 ∀王
绿娅≈z 等研究发现葛根素在诱导兔 ∂≥≤ 凋亡的过
程中上调了葡萄糖调节蛋白 |w基因的表达 ∀除可
诱导 ∂≥≤凋亡外 o韩静≈{ 等发现葛根素可抑制人
脐动脉 ∂≥≤ 的增殖 o在 s1t ∗ ux Λ°²¯ #pt时有剂
量依赖关系 ∀本实验通过细胞计数及流式细胞仪
⁄‘„含量测定 o发现浓度范围 t1x ≅ tsp x ∗ t1x ≅
tsp v °²¯#pt的葛根素可抑制凝血酶诱导的大鼠主
动脉 ∂≥≤的增殖 o并具有量效关系 o与韩静等的研
究结果基本一致 o但葛根素有效浓度范围存在差异 o
可能是由于细胞增殖模型 !处理因素作用时间等的
不同所造成的 ∀
×对细胞增殖的促进作用由细胞表面 ו 介导 o
ו 与 Š蛋白耦联 o其活化使磷脂酶 ≤ 激活 oŒ°v增
加 o≤¤un内流 o蛋白激酶 ≤k°Ž≤l激活 o‘¤n2‹ n交换 o
¦2©²¶°• ‘„表达增加≈|  ∀原癌基因 ¦2©²¶编码 xx®⁄
的核内蛋白质 oƒ²¶蛋白与染色质 ⁄‘„结合 o其功能
涉及 ⁄‘„ 复制和转录的调节 o因此 ¦2©²¶基因的激
活是 ∂≥≤增殖的一个始动因素 ∀本实验显示 o各
浓度的葛根素可显著抑制 × 诱导的 ¦2©²¶蛋白表达
的增加 o提示葛根素对 ∂≥≤ 增殖的抑制作用与 ¦2
©²¶的表达下降有关 ∀
∂≥≤的凋亡与增殖同样是调节内膜厚度的重
要机制之一 ∀细胞凋亡和细胞增生活性成正比以保
持细胞总数不变 o即细胞死亡和增生始终处于动态
平衡≈ts  ∀在动脉粥样硬化等病变中 o可能这种平衡
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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破坏 o细胞凋亡受抑 o增殖活跃 ∀¥¦¯2u是调节细胞
凋亡的基因家族 ) ) ) ¥¦¯2u 家族的一员 ∀按功能 o
¥¦¯2u家族可分为抗凋亡基因k包括 ¥¦¯2u o¥¦¯2÷等l
和促凋亡基因 k包括 …¤¬o…¤® 等l两大亚族 ∀
…∏§¬±ª¨µ≈tt 等认为 o¥¦¯2u基因可抑制大部分类型凋
亡细胞的死亡 o将 ¥¦¯2u基因转入细胞株中过量表达
¥¦¯2u蛋白 o能使这些细胞在逆境下寿命延长 ∀康铁
朵≈tu 等发现 o葛根素促 ∂≥≤凋亡与 …¤¬表达增加 o
…¤¬r¥¦¯2÷比值上升有关 ∀本实验发现 o× 促进
∂≥≤中 ¥¦¯2u蛋白表达增加 o保护了细胞向凋亡的
方向发展 o从而有利于细胞增殖 ∀而各浓度葛根素
可使 ×诱导的 ¥¦¯2u蛋白表达显著下调 o故认为葛根
素抑制 ∂≥≤ 增殖的作用亦涉及到对 ¥¦¯2u蛋白家
族的调节 o这与康铁朵的研究结果较为一致 ∀
本研究提示葛根素具有抑制 ∂≥≤ 增殖的作
用 o提示了葛根素能在冠状动脉粥样硬化 !°×≤„后
再狭窄等的治疗中发挥一定的作用 ∀同时进一步发
现这种抑增殖作用与其抑制 ¦2©²¶蛋白及 ¥¦¯2u蛋白
的表达有关 ∀结合其他科研人员的研究 o可见在临
床上葛根素具有广泛的心脑血管益处 ~从其作用机
制来看 o葛根素亦有很多作用靶点 ∀本研究只是从
一个侧面揭示了葛根素的作用机制 o有关其抑制
∂≥≤ 增殖的全面的确切的机制 o还有待于今后继
续深入地研究 ∀
≈参考文献 
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胞增殖的影响 q中国病理生理杂志 oussv ot|ktl }tuv q
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µ¨ª∏¯¤·¨§¥¼ …¦¯2u ³µ²·¨¬±¶q ϑ Βιολ Χηεµ , ussu ouzzkt{l }txyxw q
≈tu  康铁朵 o吕树铮 q葛根素诱导血管平滑肌细胞凋亡的实验研
究 q中西医结合心脑血管病杂志 oussv otktul }zsv q
Πυεραριν συππρεσσεστηε προλιφερατιον οφ ϖσχυλαρ σµ οοτη µ υσχυλε χελλσ ανδ
χ2φοσ ανδ βχλ2u προτειν εξπρεσσιον
÷˜ ≠¬2½«²∏oŠ„’ ≠¤±oŒ °¨ ¬2½«¤±ªo • „‘Š ‘¬±ª2©∏o ÷˜ ‹¤¬2¼¬±ªoײ±ª Š∏²2¬¬±
( Τηε Φιρστ Πεοπλεπσ Ηοσπιταλ οφ Ηανγζηου , Ηανγζηου vtsssy , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ ²¥¶¨µ√¨·«¨ µ²¯¨²©³∏¨µ¤µ¬± ²±·«¨ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ²©√¤¶¦∏¯¤µ¶°²²·« °∏¶¦¯¨¦¨¯¯¶k∂≥≤l ¬±§∏¦¨§¥¼·«µ²°2
¥¬± k×l ¤±§·«¨ ©¨©¨¦·²©³∏¨µ¤µ¬±²±·«¨ ¦2©²¶¤±§¥¦¯2u ³µ²·¨¬± ¬¨³µ¨¶¶¬²±q Μετηοδ : ≤¨¯¯±∏°¥¨µ¤±§¦¨¯¯ ¦¼¦¯¨¤±¤¯¼¶¬¶∏¶¬±ª©¯²º ¦¼·²° ·¨µ¼
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³µ²·¨¬± ¤©·¨µuw «²©·µ¨¤·° ±¨·²©× ¤±§³∏¨µ¤µ¬±qΡεσυλτ : t1x ≅ tsp x ∗ t1x ≅ tsp v °²¯#pt ³∏¨µ¤µ¬±¦²∏¯§¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼¶∏³³µ¨¶¶·«¬¶¶·¬°∏¯¤2
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Χονχλυσιον : ³∏¨µ¤µ¬± ¦¤± ¶∏³³µ¨¶¶·«¨ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ¤±§⁄‘„ ¶¼±·«¨¶¬¶²© ∂≥≤ ³µ²°²·¨§¥¼ × q׫¬¶¬±«¬¥¬·²µ¼ ©¨©¨¦·¶²©³∏¨µ¤µ¬± ¤µ¨ ¦¯²¶¨ ¼¯
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[ Κεψ ωορδσ] ·«µ²°¥¬±~³∏¨µ¤µ¬±~√¤¶¦∏¯¤µ¶°²²·« °∏¶¦¯¨¦¨¯¯ ~³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ≈责任编辑 方文贤 
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第 vt卷第 y期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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