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Research on isolation and purification of total iridoid glycosides from herbal Lamiophlomis rotata

大孔树脂富集纯化藏药独一味总环烯醚萜苷



全 文 :Studiesonextractionandpurificationofactivepartsof
ferulicacidfromLigusticunchuanxiong
HONGYanlong,XUDesheng,FENGYi,YUANYing
(1.ShuguangHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China;
2.SchoolofPharmacy,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)
[Abstract] Objective:TostudyontheprocessofextractionandpurificationofactivepartsfromLigusticunchuanxiong.Meth
od:Theprocessesofextractionandpurificationofactivepartsofferulicacidwereoptimizedbydirectcomparisonandorthogonalde
sign.Result:Extractrateofactivepartsofferulicacidwas167% andthecontentofferulicacidwas582%.Conclusion:Active
partsofferulicacidfromL.chuanxiongwereextractedandpurifiedefectively.
[Keywords] Ligusticunchuanxiong;ferulicacid;extraction;purification
[责任编辑 鲍 雷]
[收稿日期] 20060928
[基金项目] 全军中医药研发推广项目(2006032001);甘肃省
科技攻关项目(2GS054A4301414)
[通讯作者] 贾正平,Tel:(0931)8975884,Email:lm730530xing
@yahoo.com.cn
大孔树脂富集纯化藏药独一味总环烯醚萜苷
李茂星1,2,贾正平1,胡之德2,张汝学1,任晓玲1,王 娟1,胡 静1
(1.兰州军区兰州总医院 药材科,甘肃 兰州 730050;
2.兰州大学 化学化工学院,甘肃 兰州 730000)
[摘要] 目的:进行藏药独一味止血活性成分总环烯醚萜苷的富集纯化。方法:以一阶导数分光光度法检测,
以总环烯醚萜苷含量为跟踪指标,比较10种不同厂家、不同型号的大孔树脂对独一味水提取物中环烯醚萜苷类成
分的吸附与解吸附条件,优选最佳的纯化工艺。结果:富集后总环烯醚萜苷的含量达到6753%。结论:XDA-1型
大孔吸附树脂对独一味水提取物中环烯醚萜苷类成分有较好的吸附能力,50%乙醇溶液解吸附快速有效。树脂重
复利用度高。
[关键词] 独一味;总环烯醚萜苷;大孔树脂;工艺
[中图分类号]R283 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2007)17174305
  藏药独一味为唇形科独一味属植物独一味
Lamiophlomisrotata(Benth.)Kudo的全草或根,具
有止血、镇痛消肿、活血化瘀、补髓、行气、续筋接骨
之功效[1]。张承忠[2]、易进海[3]等从独一味中分得
过大量的环烯醚萜类和黄酮类化合物。作者的前期
工作首次证明独一味水提物中的总环烯醚萜类成分
具有很好的止血、促凝血作用,是其中的止血活性成
分[46]。大孔吸附树脂用于环烯醚萜苷类成分的分
离富集已有文献报道[7,8]。作者以一阶导数分光光
度法为检测方法,以总环烯醚萜苷含量为跟踪指标,
优选了10种不同厂家、不同型号的大孔树脂对独一
味水提取物中环烯醚萜苷类成分的吸附与解吸附能
力,并考察了各项工艺参数。
1 仪器与材料
HP8453二级管阵列紫外可见分光光度计(惠
普公司,美国);BP210S电子分析天平(赛多利斯有
限公司,德国);SK7200H超声波清洗器(上海科导
超声仪器公司),XDA-1,XDA-16型大孔吸附树
脂(西安蓝晓科技有限公司);D101型大孔吸附树
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脂(天津海光科技有限公司);YWD03D,YWD03F4,
YWD09D,YWD07D型大孔吸附树脂(河北沧州远威
化工有限公司);HPD100,HPD400型大孔吸附树脂
(河北沧州宝恩化工有限公司);D101-A型大孔吸
附树脂(天津友昌工贸有限公司)。独一味水提物
(20040515),实验室自制,得率为235%,原药材于
2004年5月购自甘肃省玛曲县药材公司,经兰州大
学药学系赵汝能教授鉴定;8乙酰氧基山栀苷甲酯
(8acetylshanzhisidemethylester)对照品(由本研究
室分离纯化并鉴定结构,HPLC归一化法测定含量
为975%)。
2 方法和结果
2.1 样品中总环烯醚萜苷含量的一阶导数分光光
度法测定
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定从独一味中
分离得到的8乙酰氧基山栀子苷甲酯对照品204
mg,于100mL量瓶中,纯化水定容,得对照品溶液
(2040μg·mL-1)。
2.1.2 聚酰胺预柱对环烯醚萜苷类成分的吸附性
考察 取10g聚酰胺于30mL的玻璃柱中,用95%
乙醇充分洗去上面的杂质,用纯化水洗至无醇味。
从上面缓缓加入10mL对照品溶液,流速控制在3
mL·min-1纯化水洗脱至流出液达到50mL为止。
另取上述对照品溶液2mL稀释到10mL。对样品
溶液和对照品溶液进行紫外扫描,结果表明,对照品
溶液经过聚酰胺柱后其紫外吸收图谱与原对照品溶
液基本一致,最大吸收峰仍然为237nm(一阶导数
图中为252nm),同时一阶导数中 A252nm没有改变,
说明经过聚酰胺柱后,环烯醚萜苷类成分不会发生
结构性的改变,聚酰胺对其不吸附。因此选择聚酰
胺柱除去黄酮类成分,减少干扰是可行的。
2.1.3 测定方法及波长的选择 取独一味水提取
液,聚酰胺处理后的样品溶液,对照品溶液进行
190~450nm扫描,并作一阶导数处理,见图1,2。
图1 不同样品紫外光谱扫描图
1.对照品;2.独一味水提取液;3.样品(图2同)
图2 不同样品一阶导数紫外扫描图
  由图1可知,在200~500nm,独一味水提取液
没有明显的紫外吸收峰,但在235,350nm处有较大
吸收,样品溶液和对照品溶液在232,237nm处有最
大吸收,但样品溶液受其他杂质存在的影响,最大吸
收波长与对照品相差较大。对吸收曲线作一阶导数
处理(图 2),可以发现样品溶液,对照品溶液在
250~252nm处有最大吸收,峰型较好。因此考虑
用聚酰胺柱净化后一阶导数分光光度法测定样品中
的总环烯醚萜苷。
2.1.4 标准曲线的制备 取对照品溶液05,10,
15,20,25,30,35mL于10mL量瓶中,纯化水
定容,测定 A252nm。以浓度和吸收度作回归方程
A252nm =-0001C-00004,R
2 =09999。在
102~714μg·mL-1线性关系良好。
2.1.5 精密度试验 取对照品溶液20mL6份于
10mL量瓶中,纯化水定容,测定A252nm,测得吸光度
值分别为 -0040597,-0040755,-0040603,
-0040843,-0040725,平均值为 -004075,
RSD0258%。
2.1.6 加样回收率试验 取已知含量的水提取物
(3807mg·g-1)01g10份,置于10个25mL量
瓶中,前5份加入50mL对照品溶液(4080μg·
mL-1),后5份加入100mL对照品溶液,纯化水定
容,按2.1.2项用聚酰胺柱净化后测定A252nm。计算
回收率,平均回收率为(9861±121)%,RSD
122%。
2.2 工艺参数考察
2.2.1 样品溶液的制备 独一味水提取物粉碎,精
密称定2000g用500mL纯化水溶解,静止过滤,
滤液上已处理的聚酰胺柱,吸附除去黄酮类化合物,
定容至2000mL,即得样品溶液。其中总环烯醚萜
苷含量为1248mg·mL-1。
2.2.2 静态吸附能力的考察 按使用说明预处理大
孔吸附树脂,取10种已处理好的树脂各5mL,加入
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100mL的小口瓶中,每瓶加入100mL样品液(1248
mg·mL-1)静置18h,期间振摇5次,取上清液1mL
于100mL量瓶中,纯化水定容,一阶导数分光光度法
直接测定各样品中未被树脂吸附的总环烯醚萜苷含
量,并计算各树脂的吸附能力,结果见表1。
表1 10种大孔吸附树脂静态吸附量的考察
No
树脂
型号
母液中未
吸附量/mg
被吸附
量/mg
静态吸附能力
/mg·mL-1
排序
1 D101A 5831 6650 1330 5
2 D101 6149 6331 1266 7
3 YWD03D 5662 6818 1364 4
4 YWD03F4 5609 6872 1374 3
5 YWD07D 9421 3059 612 10
6 YWD09D 5888 6592 1318 6
7 XDA-1 4007 8473 1695 1
8 XDA-16 4292 8188 1638 2
9 HPD-100 6452 6073 1206 9
10 HPD-400 6407 6028 1215 8
  注:加入量均为12480mg
结果表明,各种型号的大孔树脂对独一味水提
物中环烯醚萜苷类成分都有不同程度的吸附,其中
XDA-1,XDA-16型大孔吸附树脂的静态吸附性
能最好,YWD07D最差,其他几种树脂吸附能力差
别不大。
2.2.3 动态吸附能力的考察 取10种已处理好的
树脂各 10mL,加入玻璃层析柱中,(21cm×23
cm),150mL样品液(12077mg·mL-1)以3mL·
min-1的速度上样,用150mL纯化水洗脱各大孔树
脂柱,收集上样流出母液和纯化水洗脱液,测定其中
未被树脂吸附的总环烯醚萜苷含量。用95%乙醇
50mL洗脱各柱,蒸干,称重乙醇洗脱固体物重,并
测定其中的总环烯醚萜苷含量。计算树脂的动态吸
附能力,即吸附比(mg·mL-1),洗脱固体物中总环
烯醚萜苷的含量(%),洗脱回收率(%)等各项参数
结果见表2。
结果表明,各种型号的大孔树脂对独一味水提
物中环烯醚萜苷类成分都有不同程度的动态吸附,
其中XDA-1,XDA-16型大孔吸附树脂的动态吸
附性能最好,YWD07D最差,这与静态吸附性能考
察结果一致,同时各树脂的动态吸。附比均比静态
吸附比略有下降,提示上样速度不宜太快。
表2 10种大孔吸附树脂动态吸附考察
No 树脂型号 未被吸附量/mg 被吸附量/mg 吸附比/mg·mL-1 吸附比排序
1 D101A 9067 9050 905 9
2 D101 8414 9703 970 6
3 YWD03D 7035 11082 1108 3
4 YWD03F4 7657 10460 1046 5
5 YWD07D 14584 3533 353 10
6 YWD09D 7461 10656 1066 4
7 XDA-1 2935 15182 1518 1
8 XDA-16 2991 15126 1513 2
9 HPD-100 8510 9607 961 7
10 HPD-400 8600 9517 952 8
No 环烯醚萜苷量/mg 被吸附量/mg 洗脱得率/% 固体物重/mg 环烯醚萜苷/% 树脂排序
1 7221 9050 7979 11480 6290 9
2 8064 9703 8311 12050 6692 7
3 10041 11082 9061 14680 6840 4
4 8968 10460 8573 11060 8108 1
5 2976 3533 8422 5710 5211 10
6 8479 10656 7957 12400 6838 5
7 13422 15182 8840 20400 6579 8
8 13536 15126 8949 19810 6836 6
9 8220 9607 8556 10870 7562 2
10 7786 9517 8181 11290 6896 3
  注:上样总量均为18117mg
  由95%乙醇洗脱物中环烯醚萜苷的含量测定 结果可知,各种树脂吸附后,总环烯醚萜苷的含量均
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能大于50%,符合实验要求。考虑到XDA-1,XDA
-16树脂的动、静态吸附能力是所有树脂中最强
的,所以初步选定这2种树脂作进一步的研究。
2.2.4 动态解吸附性能的影响 由动、静态吸附能
力考察结果可知,在10种大孔吸附树脂中,XDA-
1,XDA-16树脂对独一味环烯醚萜苷的吸附能力
最强,且两者的吸附比相当。精密称取8g独一味
水提物(环烯醚萜苷为 09984g)2份,依法制成
800mL上样溶液,分别上80mLXDA-1和XDA-
16大孔吸附树脂柱,依次用纯化水、10%乙醇、30%
乙醇、50%乙醇、95%乙醇各800mL梯度洗脱。计
算各洗脱部位固体物质量以及其中的环烯醚萜苷含
量,结果见表3。
表3 洗脱剂浓度对XDA-1,XDA-16树脂动态
解吸附性能的影响
树脂类型
洗脱液乙醇
体积分数/%
固体物
净重/mg
环烯醚萜苷
质量/mg
洗脱物中环烯
醚萜苷含量/%
XDA-1 10 27743 18097 6523
  30 91636 62468 6817
  50 13162 8312 6315
  95 2075 1043 5027
XDA-16 10 29153 19527 6698
  30 92906 63046 6786
  50 3119 2214 6476
  95 642 310 4831
  结果显示,用XDA-1作吸附剂,大部分环烯醚
萜苷集中在10%和30%乙醇洗脱液中,但仍然有一
部分需要用 50%乙醇才能洗脱下来,综合 10%,
30%和50%乙醇洗脱结果可知,共可以洗脱下环烯
醚萜苷88877mg,占洗脱总量的9884%(环烯醚
萜苷含量超过50%),总回收率为9006%,水洗脱
物检测无环烯醚萜苷。用XDA-16作吸附剂,同样
大部分环烯醚萜苷集中在10%和30%乙醇洗脱液
中,但仍然有一部分需要用 50%乙醇才能洗脱下
来,综合10%,30%和50%乙醇洗脱结果可知,共可
以洗脱下环烯醚萜苷 84787mg,占洗脱总量的
9964%(环烯醚萜苷含量超过50%),总回收率为
8523%,但水脱物中检测有环烯醚萜苷。
综合考虑,乙醇水体系对于XDA型大孔吸附树
脂吸附的环烯醚萜苷具有很好的解吸附能力,浓度达
50%时,基本解吸附完全。对于XDA-1和XDA-16
型树脂来说,XDA-1型吸附能力更强一些,且不被
水洗脱,这样就可以用较大量的水尽量除去无机盐、
蛋白质、糖等杂质,从而提高目标物的含量。所以最
终选定XDA-1型大孔吸附树脂为吸附载体。
2.2.5 最佳解吸附条件下的洗脱曲线及富集结果
 取8g独一味水提物(环烯醚萜苷为09984g),
依法制得上样溶液,用XDA-1作吸附剂,按上述条
件上样,大量纯化水洗脱至溶液无色,以50%乙醇
为洗脱剂,洗脱速率为05mL·min-1,100mL/份,
分段收集,得洗脱曲线,最后合并50%乙醇洗脱液,
减压回收乙醇,干燥至恒重。按含量测定方法测定
上柱前和上柱后总固物中环烯醚萜苷的含量,结果
见表4,图3。结果显示,以 XDA-1型大孔吸附树
脂柱前后的总固物和环烯醚萜苷含量为指标,大孔
吸附树脂法可以有效的去除杂质,使环烯醚萜苷的
含量大幅度提高,而且环烯醚萜苷的回收率达到
90%以上。
表4 XDA-1大孔树脂对总环烯醚萜苷的富集程度
项目
总固物
/g
环烯醚萜苷量
/mg
环烯醚萜苷含量
/%
上柱前 800 9984 1248
上柱后 1332 8992 6753
水洗脱物 652 0 0
环烯醚萜苷保留率% - 9006 -
图3 环烯醚萜苷的洗脱曲线
2.2.6 大孔树脂的重复利用 树脂及聚酰胺使用
一次后,一般用95%的乙醇洗脱至无色时,即已再
生,然后以大量水洗去乙醇,即可进行下一次的分
离。经反复使用后,吸附树脂和聚酰胺颜色变深,吸
附效果下降时,可用 001~1mol·L-lNaOH(或
HCl)洗涤或浸泡适当时间,至树脂接近原颜色为
宜,继续用水洗至中性即可再用。量取100mL独一
味水溶液,上样于20mL已处理好的 XDA-1型大
孔树脂柱上,依次用纯化水、50%乙醇,95%乙醇梯
度洗脱,收集50%乙醇洗脱部分,测定其中的环烯
醚萜苷含量。后用纯化水冲洗树脂柱至无醇味,再
依照上述方法重复上样洗脱8次,记录各次的总环
烯醚萜苷含量见表5。表5显示,XDA-1型大孔树
脂吸附独一味中环烯醚萜苷有很好的重复利用性。
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表5 XDA-1型大孔树脂的重复利用结果
上样次数
环烯醚萜苷
洗脱量/mg
环烯醚萜苷
得率/%
总固物中环烯醚
萜苷含量/%
1 1137 9114 6823
2 1130 9056 6801
3 1127 9027 6789
4 1116 8945 6732
5 1112 8910 6215
6 1093 8756 6202
7 1080 8652 6158
8 1059 8489 6154
  注:环烯醚萜苷上样量均为1248mg
3 讨论
近年来,有关独一味镇痛止血有效部位的研究
越来越受到人们的关注,第四军医大学和第二军医
大学的科研人员对其镇痛有效成分进行了深入的研
究[9,10],而作者首次证明了总环烯醚萜苷类成分是
其止血有效成分,且含量较高。为此作者对该类成
分进行了大孔树脂富集工艺的研究。
有关独一味中总环烯醚萜苷成分含量的测定方
法未见文献报道,本实验首次以8-乙酰氧基山栀
苷甲酯为对照品,采用一阶导数减少干扰,实现水提
取物中总环烯醚萜苷成分含量的快速测定,方法简
便、快速、稳定,为后续的工艺筛选提供了很好的检
测方法。
本实验研究了10种不同厂家,不同型号的大孔
树脂对独一味水提取物中环烯醚萜苷类成分的动、
静态吸附与解吸附能力。结果表明XDA-1型树脂
的吸附能力最好,YWD07D最差;50%乙醇溶液可
作为解吸附溶剂,洗脱物中的总环烯醚萜苷含量达
到6753%,大孔吸附树脂重复使用8次,其洗脱物
中总环烯醚萜苷的含量仍达到60%左右,重复利用
度高。
[参考文献]
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Researchonisolationandpurificationoftotaliridoidglycosidesfrom
herbalLamiophlomisrotata
LIMaoxing1,2,JIAZhengping1,HUZhide2,ZHANGRuxue1,RENXiaoling1,WANGJuan1,HUJing1
(1.DepartmentofPharmacy,LanzhouGeneralHospitalofPLA,Lanzhou730050,China;
2.DepartmentofChemistry,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)
[Abstract] Objective:EnrichingthehemostaticactiveparttotaliridoidglycosidesfromtheaqueousextractofherbalLamio
phlomisrotata.Method:Firstderivativespectrophotometrywasusedasthedetectionmethodandthecontentoftotaliridoidglycosides
wasusedastrackingtarget.Theabilitiesofabsorptionandantiabsorptionoftendiferenttypesofmacroreticularresinwerecompared,
afterbeingusedtoabsorbtheiridoidglycosidesfromaqueousextractofherbalL.rotata.Thebestpurificationprocesswasoptimized.
Result:Withtheoptimizedpurificationprocess,thecontentoftotaliridoidglycosideswas6753%.Conclusion:XDA1macroreticu
larresinhasgoodabilityofabsorptionandantiabsorptionforiridoidglycosidesand50% ethanolwasthebestsolventforantiabsorp
tion.Themacroreticularresincouldbereused.
[Keywords] Lamiophlomisrotata;totaliridoidglycoside;macroreticularresin;technology
[责任编辑 鲍 雷]
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第32卷第17期
2007年9月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.32,Issue 17
September,2007