全 文 ：大黄素对大鼠肝移植后肝细胞凋亡的影响
林胜璋，徐贤绸，荆　河，杨　潇
（温州医学院 附属第二医院 外科，浙江 温州 ３２５００３）
［摘要］　目的：探讨大黄素对大鼠肝移植后肝细胞凋亡的影响。方法：建立ＬＥＷ→ＢＮ大鼠肝移植动物模型，
随机分为Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ４组，每组６只动物，术后每天分别腹腔注射生理盐水０５ｍＬ·ｄ－１、环孢素Ａ（ＣｓＡ）１００ｍｇ·
ｋｇ－１·ｄ－１、大黄素５００ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１、大黄素５００ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１＋ＣｓＡ１００ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１，连续用药８ｄ，停
药７ｄ后处死动物取肝脏组织观察排斥活动指数（ＲＡＩ）和肝细胞凋亡指数（ＡＩ）。结果：Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ组 ＲＡＩ分别是
（７６７±０９８），（５１７±０４０），（５８３±０７５），（３８３±０７５），ＡＩ分别是（３５８３±２３２），（１５８３±１３３），（１６５０±
２３５），（１１５０±１０５）。Ｂ，Ｃ，Ｄ组的 ＲＡＩ，ＡＩ较 Ａ组均明显降低（Ｐ＜００１），而 Ｄ组较 Ｂ，Ｃ组也均有明显降低
（Ｐ＜００５），Ｂ，Ｃ组间差别均无意义。结论：大黄素能有效减少大鼠移植肝术后肝细胞凋亡，抑制排斥反应，且和
ＣｓＡ有协调作用。
［关键词］　大黄素；肝移植；移植物排斥；细胞凋亡
［中图分类号］Ｒ２８５．５　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１５３０２（２００８）０７０８０９０４
［收稿日期］　２００７１０１２
［基金项目］　国家自然科学基金项目（３０５７２３９５）
［通讯作者］　林胜璋，Ｅｍａｉｌ：ｗｚｆ２１ｓｚ＠１６３．ｃｏｍ
　　大黄素（ｅｍｏｄｉｎ）是一种蒽醌类化合物（１，３，８
三羟基６甲基蒽醌１，３，８ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ６ｍｅｔｈｙｌａｎｔｈｒａ
ｑｕｉｎｏｎｅ）。已通过研究证实了其能延长非同系大鼠
间原位肝移植的术后成活时间，降低移植肝的排斥
活动指数（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘ，ＲＡＩ），并和抗排斥
反应药物环孢素Ａ（ＣｓＡ）有一定的协同作用［１］。研
究表明，移植肝排斥反应和细胞凋亡具有密切的正
相关性，抗排斥反应药物可有效地降低移植肝的肝
细胞凋亡［２，３］。因此，为了进一步证实大黄素对肝
移植排斥反应的抑制作用，利用近交系大鼠原位肝
移植急性排斥模型，研究了大黄素对移植肝细胞凋
亡的影响。
１　材料和方法
１．１　动物
近交系Ｌｅｗｉｓ（简称 ＬＥＷ）大鼠作为供体，体重
２００～２５０ｇ，近交系ＢｒｏｗｎＮｏｒｗａｙ（简称ＢＮ）大鼠作
为受体，体重２２０～２８０ｇ。供受体均为雄性，购自北
京动物实验中心，合格证号 ＳＣＸＫ（京）２００７０００１，
供体体重略小于受体２０～３０ｇ，饲养条件为ＳＰＦ级。
１．２　药物和试剂
大黄素粉剂（西安华萃生物技术有限公司，批
号ＳＨ２００６０６１２）。细胞凋亡原位检测（Ｔｕｎｅｌ检测）
试剂盒及相关的染色试剂购自福建迈新公司。
１．３　方法
１．３．１　模型建立及分组　以Ｋａｍａｄａ［４］双套管法建
立ＬＥＷ→ＢＮ大鼠原位肝移植动物模型。随机分为
４组，以存活时间大于３ｄ作为移植成功的标准，最
终每组６只动物。
１．３．２　给药方法　模型大鼠分别设 Ａ组（排斥反
应组）、Ｂ组（ＣｓＡ组）、Ｃ组（大黄素组）、Ｄ组
（ＣｓＡ＋大黄素组）。每组术后每天腹腔给药，分别为
生理盐水０５ｍＬ·ｄ－１，ＣｓＡ１００ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１、
大黄素５００ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１、大黄素５００ｍｇ·ｋｇ－１
·ｄ－１＋ＣｓＡ１００ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１。连续用药８ｄ，
停药７ｄ后经麻醉处死各组大鼠，取肝脏组织行常
规石蜡包埋。
１．３．３　排斥程度组织学观察　将蜡块切片，ＨＥ染
色，观察各组大鼠移植肝组织病理学变化以确定急
性排斥反应（ａｃｕｔｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＡＣＲ）程度。
１．３．４　细胞凋亡指数（ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｅｘ，ＡＩ）观察　
将蜡块切片，按原位细胞凋亡检测试剂盒所示步骤
逐步操作，行凋亡细胞 Ｔｕｎｅｌ法（原位末端标记法）
染色，观察各组移植肝凋亡细胞比例以确定ＡＩ。
１．４　统计学处理
所得计量数据以 珋ｘ±ｓ表示，应用 ＳＰＳＳ１２０软
件包进行统计分析。
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２　结果
２．１　一般观察
各组存活超过３ｄ的大鼠均能活过８ｄ，但Ａ组
大鼠术后状态差，注药时反应渐迟钝，８ｄ内体重逐
渐下降无回升，解剖后见肝脏有肿胀、粘连。另３组
大鼠术后较 Ａ组明显活泼，注药时反应敏捷，第 ５
天起体重即开始回升，解剖后见肝脏基本正常。
２．２　排斥程度组织学观察
移植肝术后急性排斥反应程度采用 Ｂａｎｆ分级
方案，对汇管区炎症、胆管炎症、静脉内皮炎症依其
轻、中、重程度分别计为１，２，３分，最后三者相加确
定排斥活动指数（ＲＡＩ）。在 ＨＥ染色切片上看，Ａ
组大鼠肝组织排斥反应严重，汇管区大量炎性细胞
浸润，胆管内皮有坏死（图１）；Ｂ，Ｃ组大鼠排斥反应
明显减轻，汇管区有炎性细胞浸润，胆管内皮基本完
整（图２，３）；Ｄ组大鼠肝组织汇管区少有炎性细胞，
汇管区完整（图 ４）。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ组 ＲＡＩ分别是
７６７±０９８，５１７±０４０，５８３±０７５，３８３±０７５。
以各组ＲＡＩ的原始数据输入 ＳＰＳＳ软件行４个样本
均数两两比较的 ｑ检验，结果见表１。从统计结果
可知，Ａ组 ＲＡＩ值与 Ｂ，Ｃ，Ｄ比较差异有意义，Ｄ组
和Ｂ，Ｃ差异也有意义，而Ｂ，Ｃ组间差异无统计学意
义。
图１　Ａ组大鼠肝组织排斥反应（ＨＥ×１００）
图２　Ｂ组大鼠排斥反应（ＨＥ×１００）
２．３　移植肝细胞凋亡指数（ＡＩ）
图３　Ｃ组大鼠排斥反应（ＨＥ×１００）
图４　Ｄ组大鼠肝组织（ＨＥ×１００）
表１　４组ＲＡＩ均数两两比较的ｑ检验
（ＮｅｗｍａｎＫｅｕｌｓ法）结果
比较组别 ｑ Ｐ
Ａ与Ｂ ６８８２５ ＜００１
Ａ与Ｃ ５０４７１ ＜００１
Ａ与Ｄ １０５５３１ ＜００１
Ｂ与Ｃ １８３５３ ＞００５
Ｂ与Ｄ ３６７０７ ＜００５
Ｃ与Ｄ ５５０６０ ＜００１
　　高倍镜下随机选取视野清点４００个肝细胞，统
计其中凋亡细胞阳性率，即 ＡＩ。在 Ｔｕｎｅｌ染色片上
可以观察到 Ａ组大鼠的肝脏组织切片上凋亡细胞
大量存在（图５），而Ｂ，Ｃ组相对较少（图６，７），Ｄ组
仅少量分布（图８）。光镜下凋亡细胞（Ｔｕｎｅｌ阳性细
胞）判断依据是：细胞核呈蓝黑色显色，核多小于正
常肝细胞核，可伴有核周空晕（图８）。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ组
ＡＩ分别是 ３５８３±２３２，１５８３±１３３，１６５０±
２３５，１１５０±１０５。以各组 ＡＩ的原始数据输入
ＳＰＳＳ软件行４个样本均数两两比较的 ｑ检验，结果
见表２。从统计结果可知，Ａ组ＡＩ值与Ｂ，Ｃ，Ｄ比较
差异有意义，Ｄ组和 Ｂ，Ｃ差异也有意义，而 Ｂ，Ｃ组
间差异无统计学意义。
３　讨论
近交系大鼠具有遗传背景明确、生物学特性资
料详细等优点，实验时重复性好，实验所需的动物
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图５　Ａ组大鼠的肝脏组织切片上凋亡细胞大量存在
（Ｔｕｎｅｌ×４００）
图６　Ｃ组大鼠的肝脏组织切片上凋亡细胞数量和
Ｂ组相当（Ｔｕｎｅｌ×４００）
图７　Ｂ组大鼠的肝脏组织切片上凋亡细胞相对Ａ组
明显减少（Ｔｕｎｅｌ×４００）
图８　Ｄ组大鼠的肝脏组织切片上凋亡细胞仅少量
分布，圆内所示为典型凋亡细胞（Ｔｕｎｅｌ×４００）
数量也可相对减少，实验结果较封闭群大鼠如Ｗｉｓｔ
ａｒ→ＳＤ的可靠［５］。文献报道［６］，近交系大鼠 ＬＥＷ
→ＢＮ原位肝移植模型是较可靠的急性排斥模型，术
　　 表２　４组ＡＩ均数两两比较的ｑ检验
（ＮｅｗｍａｎＫｅｕｌｓ法）结果
比较组别 Ｑ Ｐ
Ａ与Ｂ ２６４３９２ ＜００１
Ａ与Ｃ ２５５５７９ ＜００１
Ａ与Ｄ ３２１６７６ ＜００１
Ｂ与Ｃ ０８８１３ ＞００５
Ｂ与Ｄ ５７２８５ ＜００１
Ｃ与Ｄ ６６０９８ ＜００１
后会出现明显的急性排斥反应，生存质量差，生存期
较短，移植肝病理观察可见典型的排斥反应表现。
本研究中Ａ组大鼠术后未经抗排斥药物处理，一般
状态和组织学观察结果如上所述，与文献报道的结
果相符。由于ＬＥＷ和ＢＮ大鼠在国内已有供应，所
以应常规作为肝移植急性排斥的模型应用。
Ｂａｎｆ分级方案是国际移植学会制订的肝移植
术后急性排斥反应组织病理学诊断标准［７］。该方
案设定ＲＡＩ总积分为９分，ＲＡＩ小于３分为非确定
型ＡＣＲ，３～５分为轻度 ＡＣＲ，５～７分为中度 ＡＣＲ，
７～９分为重度ＡＣＲ。本研究结果显示，在近交系大
鼠ＬＥＷ→ＢＮ肝移植模型上，Ａ组大鼠未经抗排斥
药物处理，其ＡＣＲ为重度，经大黄素及 ＣｓＡ处理的
Ｂ，Ｃ组ＡＣＲ为中度，二者合用的Ｄ组为轻度。统计
处理结果显示大黄素能有效降低移植肝的ＡＣＲ，合
用ＣｓＡ效果更明显，所以可认为大黄素有抗大鼠肝
移植排斥的作用，且和 ＣｓＡ有协同作用，与本课题
组先前在封闭群大鼠 Ｗｉｓｔａｒ→ＳＤ肝移植模型上得
到的结果相符［１］。
细胞凋亡是生物机体为了维持内环境的稳定，
由基因控制的细胞自主性的程序性死亡，在全身免
疫和器官移植中排斥反应起着重要的作用［８］。研
究证明，肝细胞凋亡是肝移植术后肝细胞死亡的一
种重要方式，肝移植术后的排斥程度和肝细胞凋亡
具有显著的相关性，排斥反应较重的移植肝的肝细
胞ＡＩ较高，经有效抗排斥药物如 ＣｓＡ处理的移植
肝排斥反应减轻，ＡＩ也降低［２，３］。本研究中，ＡＣＲ
最明显的Ａ组ＡＩ也最高。Ｂ，Ｃ组 ＡＣＲ为中度，其
ＡＩ较Ａ组明显降低，ＡＣＲ最轻的 Ｄ组 ＡＩ也最低。
所以，本研究也证实了排斥程度和肝细胞凋亡的相
关性。同时，本研究还观察到单独应用大黄素的 Ｃ
组肝细胞 ＡＩ为１６５０±２３５，较未经抗排斥药物处
理的Ａ组（３５８３±２３２）有明显的降低（Ｐ＜００１），
和ＣＳＡ处理的Ｂ组（１５８３±１３３）差别无统计学意
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