全 文 ：ｏｎＨ．ｐｙｌｏｒｉＬＰＳｉｎｄｕｃｅｄｇａｓｔｒｉｃｌｅｓｉｏｎｉｎｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｈ．ｐｙｌｏｒｉｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｒａｔｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｌｙｆｏｒ４ｄａｙｓｔｏ
ｉｎｄｕｃｅａｐａｔｅｒｎｏｆｍｕｃｏｓａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇｔｈａｔｏｆａｃｕｔｅｇａｓｔｒｉｔｉｓＡｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ５０，１００，２００ｍｇ·ｋｇ－１ＴＡ，ｗｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ
ｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｎｇａｓｔｒｉｃｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃＮＯＳａｎｄＮＯＳ２，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＴＮＦαａｎｄｔｈｅｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｕｓ
ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｈ．ｐｙｌｏｒｉＬＰＳｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｄｕｃｅｔｈｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｕｓ，ｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＯＳ２ａｎｄｄｅｃｌｉｎｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃＮＯＳ，ａｎｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＴＮＦαｉｎｓｅｒｕｍ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ５０，１００，２００
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ｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｒｎｅｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｍａｙｂｅｒｅｌａｌｅｄｔｏｉｔｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄｔｈｅｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｔｏｔａｌａｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＣｏｐｔｉｓ；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ａｃｕｔｅｇａｓｔｒｉｔｉｓ；ｃＮＯＳ；ＮＯＳ２；ＴＮＦα
［责任编辑 古云侠］
远志皂苷对 β淀粉样蛋白１４０诱导的体外培养
皮层神经细胞损伤的保护作用
陈 勤，李磊珂
（安徽大学 生命科学学院 安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 ２３００３９）
［摘要］ 目的：研究远志皂苷（ＴＥＮ）对β淀粉样蛋白１４０（Ａβ１４０）诱导的原代培养神经细胞损伤的保护作用。
方法：以原代培养大鼠皮层神经细胞，用２５μｍｏｌ·Ｌ－１聚集状的Ａβ１４０建立神经细胞损伤模型。将培养的神经细胞
分为Ａβ１４０模型组和Ａβ１４０＋远志皂苷（５０，１００，２００μｍｏｌ·Ｌ
－１）处理的低、中、高剂量组，同时设立正常组。在倒置
显微镜下观察远志皂苷给药前后神经细胞的形态学变化，用ＭＴＴ比色法检测神经细胞活性，采用ＬＤＨ比色法检测
神经细胞膜的损伤程度。结果：与正常组相比，２５μｍｏｌ·Ｌ－１Ａβ１４０处理２４ｈ，可使神经细胞的形态发生改变和活力
显著下降，在显微镜下可见神经元失去贴壁能力或易脱落，突起变短。远志皂苷中、高剂量组均能显著降低神经细
胞的坏死百分率，减少ＬＤＨ的释放，明显提高神经细胞的存活率。结论：凝聚态Ａβ１４０对培养的皮层神经细胞有一
定的毒性效应，而远志皂苷对Ａβ１４０引起的神经细胞毒性有明显的保护作用。
［关键词］ 远志皂苷；β淀粉样蛋白；皮层神经细胞
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００７）１３１３３６０４
［收稿日期］ ２００６０６２６
［基金项目］ 安徽省教育厅自然科学基金（ＫＪ０２８）
［通讯作者］ 陈勤，Ｔｅｌ：（０５５１）５１０８１４３８００６，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｑ
ｉｎ１６９＠１６３．ｃｏｍ
远志皂苷（ｔｅｎｕｉｇｅｎｉｎ，ＴＥＮ）系远志科植物远志
ＰｏｌｙｇａｌａｔｅｎｕｉｆｏｌｉａＷｉｌｄ．或宽叶远志 Ｐ．ｓｉｂｉｒｉｃａＬ．
的主要有效成分之一。前期研究表明［１，２］，远志皂
苷能明显提高拟痴呆大鼠的学习记忆能力，可显著
升高脑内Ｍ受体密度和增强胆碱乙酰转移酶活性，
能有效地抑制脑胆碱酯酶活性，对 Ａβ引起的神经
细胞的超微结构有明显的保护作用。本研究采用体
外原代神经细胞培养方法来观察ＴＥＮ对Ａβ１４０诱导
的大脑皮层神经细胞损伤的保护作用。
１ 材料
１．１ 药品与试剂 ＴＥＮ远志皂苷（批号０１０３２６），
由本室自制，含远志皂苷甲素，远志皂苷乙素等成
分，经高效液相色谱法测定，其中远志皂苷甲素含量
为７２％。Ａβ１４０（ａｍｙｌｏｉｄｂｅｔａｐｒｏｔｅｉｎ１４０），Ｓｉｇｍａ公
司产品，临用前精密称取适量干粉，以无菌生理盐水
溶解成１２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１溶液，分装并贮存于 －２０
℃，用时融化，稀释。将１２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ａβ１４０溶液
于 ３７℃，５％ＣＯ２培养箱中孵育１周，并不时小心搅
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拌，使其变为聚集状态的 Ａβ［３］。多聚赖氨酸（ＰＬＬ，
相对分子质量为 １５万 ～３０万）、四甲基偶氮唑蓝
（ＭＴＴ）、阿糖胞苷（Ａｒａｃ）为 Ｓｉｇｍａ公司产品；
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，为 Ｇｉｂｃｏ公司产品；胰蛋白酶
（１∶２５０）、谷氨酰胺；胎牛血清，杭州四季青生物工
程公司产品；乳酸脱氢酶检测试剂盒，南京建成生物
工程有限公司产品，其余试剂均为国产分析纯。
１．２ 动物 ＳＤ大鼠，体重２６０～２８０ｇ，孕期１８ｄ，
由安徽医科大学动物实验中心提供，合格证号为皖
医动准字０３号。
１．３ 仪器 超净工作台（苏州净化设备有限公
司），２１２３－２型 ＳＨＥＬＬＡＢＣＯ２培养箱（美国 ＳＨＥＬ
ＤＯＮ公司），ＩＭＴ－２倒置显微镜（日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公
司），４５０型酶标仪（美国 ＢＩＯＲＡＤ公司），Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ
３１００紫外分光光度计（瑞典 Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司），２４
孔、９６孔培养板（美国Ｃｏｒｎｉｎｇ公司）。
２ 方法
２．１ 神经细胞培养 取孕１８ｄ的 ＳＤ大鼠经腹腔
麻醉，在无菌条件下取出胎鼠，解剖显微镜下分离大
脑皮层，置于盛有 ＤＨａｎｋ液中洗净，剪成约１ｍｍ３
的小块。经０１２５％胰蛋白酶溶液于３７℃水浴中
消化１５～２０ｍｉｎ，用含有１５％胎牛血清的 ＤＭＥＭ／
Ｆ１２培养基终止消化。经悬浮、离心、过滤等步骤收
集细胞，０４％台盼蓝拒染法计数活细胞后，用含有
１５％胎牛血清的 ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基制成细胞密度
为 ５×１０５个／ｍＬ的细胞悬液，接种于预先铺有
００１％多聚赖氨酸的９６孔或２４孔培养板内的盖玻
片（０８ｃｍ×０８ｃｍ）上，置于３７℃，５％ＣＯ２培养箱
中培养。细胞贴壁后换无血清的 ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养
基。离体培养３～５ｄ后加入含阿糖胞苷（终浓度为
３～５ｍｇ·Ｌ－１）的 ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，以抑制非神
经细胞的过度增殖，每隔３～４ｄ换一次新鲜培养
基。
２．２ 细胞分组及药物干预 神经细胞培养至７ｄ，
分为４组：①正常组，不加任何处理因素，换上同体
积的新鲜的无血清 ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基；②模型组，
在培养液中加入终浓度为２５μｍｏｌ·Ｌ－１的 Ａβ１４０；
③ＴＥＮ低、中、高剂量组，在培养液中，加入终浓度
为２５μｍｏｌ·Ｌ－１的Ａβ１４０和不同终浓度的ＴＥＮ（５０，
１００，２００μｍｏｌ·Ｌ－１）。置于３７℃，５％ＣＯ２培养箱
中培养。９６孔培养板内的神经细胞培养２４ｈ，２４孔
培养板内的神经细胞培养４ｄ，用于观察神经细胞的
形态。
２．３ 神经细胞形态学观察和定量分析 接种７２ｈ
的神经细胞分别经 Ａβ１４０单独孵育或 Ａβ１４０＋ＴＥＮ
共同孵育处理２４ｈ后，在倒置显微镜下观察其存活
情况和形态（×４００），以胞体呈明显晕光、突起明显
的神经元为记录对象，随机选取 ２０个视野（０１７
ｍｍ２／视野），记录每个视野内有突起的细胞数和突
起总数，同时用目镜测微尺测量２０个神经元突起的
长度。
２．４ ＭＴＴ检测细胞活性 终止培养前４ｈ，向９６孔
板的每孔加入１０μＬＭＴＴ（３ｍｇ·ｍＬ－１ＤＭＥＭ）继续
培养，４ｈ后吸弃上清，加入 １００μＬ二甲基亚矾
（ＤＭＳＯ），充分振荡至晶体完全溶解，于酶标仪５７０
ｎｍ波长下测各孔吸光度值（Ａ）。每个浓度设２个
复孔，计算其平均值，同时设不加细胞的空白孔。
２．５ 乳酸脱氢酶（ｌａｃｔｉｃｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ）释放量
的测定 按ＬＤＨ试剂盒说明书进行标准曲线的绘制
及标本的测定。终止培养前４ｈ，每孔取细胞培养上
清液１５μＬ，依次加入０２５ｍＬ基质缓冲液、５０μＬ辅
酶Ⅰ和０２５ｍＬ２，４二硝基苯肼溶液，混匀，室温放置
３ｍｉｎ，于紫外分光光度计４４０ｎｍ处测定ＬＤＨ的释放
量。细胞培养液中ＬＤＨ活力按以下公式计算：
ＬＤＨ活力＝（Ａ测定管 －Ａ测定空白管）／（Ａ标准管 －Ａ标准空白管）
２．６ 统计学处理 所有数据均以 珋ｘ±ｓ表示，采用
ＳＰＳＳ１００统计软件包分析，ｔ检验进行组间差异显
著性分析。
３ 结果
３．１ 对Ａβ１４０诱导的皮层神经细胞形态学改变的影
响 正常组神经细胞在培养６ｈ后，部分细胞开始
贴壁，贴壁细胞呈圆形，直径７～１２μｍ。４８～７２ｈ
后，贴壁细胞渐多，个别细胞开始伸出突起，且大部
分细胞已贴壁，可见光滑的突起，胞体小，折光性较
低，周围有光晕，有些细胞发生重聚现象。４ｄ后神
经元胞体增大，每个细胞有２～３个突起，有的突起
延长并出现分枝，形成局部神经网络，神经元以多极
神经元为主，胞体呈三角形或椭圆形，胞体发亮，周
边有光晕。７ｄ后，即可见胞体呈梭形或三角形，突
起进一步增多增长，可见神经细胞的突起互为交织
成网状结构。Ａβ１４０模型组在加入 Ａβ１４０５ｈ后，即
可见到部分神经细胞出现胞体缩小，细胞周围晕光
不强。细胞突起消失或明显减少、缩短，细胞碎片增
多。有的神经元内出现折光性下降，胞体变大，即将
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脱壁，呈死亡细胞形态。有的神经元突起发生断裂
成断线状，散落于细胞周围，有的细胞胞膜已破裂，
表明Ａβ１４０有较大的细胞毒性。ＴＥＮ低剂量组神经
细胞生长较差，多数细胞突起变短、消失，细胞碎片
较多。经细胞计数和显微测定发现，其突起的细胞
数、神经元突起数目、长度与 Ａβ１４０模型组相比均无
显著性差异。ＴＥＮ中剂量组神经细胞生长状态稍
好，少部分仍存活，但突起很短，有较多的圆形及飘
浮细胞，其突起的细胞数、神经元突起数目、长度与
Ａβ１４０模型组相比有显著的差异（Ｐ＜００５，Ｐ＜
００１，Ｐ＜００５）。ＴＥＮ高剂量组细胞形态明显改
善，存活的神经细胞较多，主要表现为贴壁良好，圆
形及飘浮细胞减少，突起伸展，其突起的细胞数、神
经元突起数目、长度与 Ａβ１４０模型组相比有显著的
差异（均Ｐ＜００１），但细胞生长状态仍不如正常对
照组旺盛，见表１。
表１ ＴＥＮ对Ａβ１４０（２５μｍｏｌ·Ｌ
－１）诱导的皮层神经细胞形态学改变的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝２０）
组别 剂量／μｍｏｌ·Ｌ－１ 神经元数／个 神经元突起数／个 神经元突起长度／μｍ
正常 － １１９０±２５６２） １９７０±４６７２） ３３３０±６１５２）
模型 － ４３０±２００ ４８０±１６２ １１６０±２９５
ＴＥＮ ５０ ５１０±２２８ ５２０±２７４ １１９０±３６３
１００ ７４０±２２７２） ７５０±３０６１） １７８０±４０２２）
２００ ９００±２７１２） １２１０±３２１２） ２４７０±４９７２）
注：与Ａβ模型组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１（表２同）
３．２ 对Ａβ１４０诱导损伤后皮层神经细胞存活的影响
ＭＴＴ测定结果显示，Ａβ１４０处理２４ｈ后，Ａβ１４０模型
组ＭＴＴ的Ａ值为０２７４±００９８，正常组 ＭＴＴ的 Ａ
值为１４４０±０２５９，两者相比有显著性差异（Ｐ＜
００１），表明 Ａβ１４０毒性会导致细胞损伤，而加入
ＴＥＮ后，中、高剂量组ＭＴＴ的Ａ值均显著升高，提示
ＴＥＮ对神经细胞的生存有保护作用（均 Ｐ＜００１），
见表２。
表２ ＴＥＮ对Ａβ１４０（２５μｍｏｌ·Ｌ
－１）诱导的
皮层神经细胞（Ａ）及ＬＤＨ活性的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝２０）
组别
剂量
／μｍｏｌ·Ｌ－１
ＭＴＴ
ＬＤＨ
／Ｕ·ｍＬ－１
正常 － １４４０±０２５９２） ０３９３±０２４０２）
模型 － ０２７４±００９８ ２１２０±００８３
ＴＥＮ ５０ ０３０２±０１１５ ２０２４±０３０９
１００ ０６６８±０１７５２） １２２１±０１６２２）
２００ １２６９±０１５５２） ０８６７±０２２６２）
３．３ 对Ａβ１４０引起的培养神经细胞ＬＤＨ漏出率的影
响 ＬＤＨ活性测定结果显示，Ａβ１４０处理２４ｈ后，ＬＤＨ
活性与正常组相比明显升高，表明Ａβ１４０毒性会导致
细胞损伤，致使 ＬＤＨ渗漏增加（Ｐ＜００１），而加入
ＴＥＮ后，除低剂量组与Ａβ１４０模型组相比无明显差异
外，中、高剂量组ＬＤＨ活性均显著得到抑制，ＬＤＨ渗
漏量明显减少（均Ｐ＜００１），见表２。
４ 讨论
阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一
种以进行性痴呆为特征的原发性神经退行性疾病，
其临床主要表现为进行性记忆、学习和认知能力的
丧失，主要病理特征为神经元胞外老年斑（ｓｅｎｉｌｅ
ｐｌａｑｕｅ，ＳＰ）沉积，胞内神经原纤维缠结（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌ
ｌａｒｙｔａｎｇｌｅ，ＮＦＴｓ）和大量神经元的丧失等。现已证
实，ＳＰ中的主要成分是由３９～４３个氨基酸组成的β
淀粉样蛋白（ａｍｙｌｏｉｄｂｅｔａｐｒｏｔｅｉｎ，Ａβ）。当可溶性
Ａβ一旦形成聚集状 Ａβ时就会易沉积在脑内形成
老年斑，一方面它能直接对神经元产生毒性，另一方
面它还能加强神经元对自由基、神经毒素、兴奋性氨
基酸等有害因子的易感性，可诱导神经元凋亡或坏
死，轴突营养性不良和突触丢失，进而破坏细胞膜的
完整性，引起线粒体功能障碍，ＡＴＰ耗竭、胞内 Ｃａ２＋
超载、ＤＮＡ断裂、脂质过氧化及蛋白质交联变性等
级联反应［４７］。因此目前大多数学者认为 Ａβ在脑
内的沉积和毒性是造成ＡＤ发病的重要原因。
Ａβ在体外对原代培养神经元的毒性作用，最先
是由１９９０年 Ｙａｎｎｅｒ等发现的［８］，随后的许多研究
均证实了 Ａβ具有明显的直接神经细胞毒性［９１３］。
例如Ｌｏｏ等［１０］和Ｗａｔ等［１１］证明在培养的小鼠皮层
神经元中Ａβ能诱导细胞凋亡，可出现轴突营养不
良，神经细胞膜空泡化，染色体固缩，ＤＮＡ断裂，凋
亡小体生成等细胞凋亡的典型形态学特征。本研究
观察了远志皂苷对 Ａβ１４０诱导的体外培养神经细胞
损伤的保护效应，发现培养的皮层神经细胞暴露于
聚集状Ａβ１４０２４ｈ后，细胞形态结构明显异常，细胞
的存活率显著下降，ＬＤＨ释放量显著升高，具体表
现为：神经细胞胞体缩小，细胞周围晕光不强；细胞
突起明显缩短或消失，细胞数目明显减少，细胞碎片
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增多。而远志皂苷可显著拮抗 Ａβ１４０对神经细胞的
毒性作用。它能基本维持细胞的贴壁状态，使飘浮
细胞减少，突起伸展，细胞的存活数目较多，ＬＤＨ释
放量减少，与正常组细胞相比，其突起的细胞数、神
经元突起数目、长度无明显的差异。提示远志皂苷
对Ａβ１４０诱导的神经细胞损伤具有较好的保护作
用，其作用机制有待进一步研究。
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ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆβａｍｙｌｏｉｄｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅｈｉｐｐ
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Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｏｆｔｅｎｕｉｇｅｎｉｎｏｎｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆ
ｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｍｙｌｏｉｄｂｅｔａｐｒｏｔｅｉｎ１４０（Ａβ１４０）
ＣＨＥＮＱｉｎ，ＬＩＬｅｉｋｅ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｎｈｕｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲ＆ＤｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｆｅｉ２３００３９，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆｔｅｎｕｉｇｅｎｉｎ（ＴＥＮ）ｏｎａｇｇｒｅｇａｔｅｄａｍｙｌｏｉｄｂｅｔａｐｒｏｔｅｉｎ１４０（Ａβ１４０）ｉｎｄｕｃｅｄ
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Ａβ１４０
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｔｅｎｕｉｇｅｎｉｎ；ａｍｙｌｏｉｄｂｅｔａｐｒｏｔｅｉｎ（Ａβ）；ｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓ；ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔ
［责任编辑 古云侠］
·９３３１·
第３２卷第１３期
２００７年７月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ １３
Ｊｕｌｙ，２００７