全 文 :Efectsofirrigationvolumeongrowth
andqualityofLonicerajaponica
XUYingchun1,2,ZHANGJiabao2,JIANGQiao1,2,ZHOULingyun2,XULinguo1
(1ColegeofHorticulture,NanjingAgricultureUniversity,Nanjing210095,China;
2InstituteofSoilScience,ChinaAcademySinica,Nanjing210008,China)
[Abstract] Objective:TostudytheefectsofirigationvolumeonthegrowthandqualityofLonicerajaponica.Method:Diferentvol
umeofirigationwaterwasappliedtothepotedL.japonicabeforethefirstflorescenceofhoneysuckleinordertokeeptherelativemoisture
contentofthesoilas100%,80%,50%,30%,andobservethegrowthanddevelopmentofshootandleaves,yieldandqualityofhoney
suckle.Result:Astheofirigationvolumewasreduced,theinternodalelongationofshootandtheincreaseoftheknotwererestrained,and
theyieldofhoneysuckledropped.Butthecontentofchlorogenacidinthebudstreatedby80%irigationvolumewasnotafected,whilethat
oftheothertreatmentaldecreased.Themoisturecontentsoftheleavestreatedby30%irigationvolumewassignificantlylowerthanthatof
theCK,whilethespecificleafweight(SLW)increasedsignificantlycomparingtotheCK.Thecontentofchlorophylintheleavesof50%and
30%increased,whiletheratioofchlorophylAandBfelsignificantly.Thecontentofdissolublesugerintheleavesof80%and50%iriga
tionvolumewasmuchhigherthanthatintheCK.Theresultsalsoshowedthat,thecontentofdissolubleproteinintheleavesof30%irigation
volumeincreasedcomparingwiththatin50%,andthecontentofprolineinleaveasof30%irigationvolumeincreasedsignificantly.Conclu
sion:Usinglessirigationvolume(keeping80% ofrelativemoisturecontentofthesoil)doesnotafectthequalityofhoneysuckle,butde
creaseddryweightofhoneysuckle.Itisnecessarytotakeirigationmanagementduringcultivationofhoneysuckle.
[Keywords] Lonicerajaponica;irigationquantity;shoot;leaves;qualityofhoneysuckle
[责任编辑 张宁宁]
[收稿日期] 20050426
[基金项目] 河北省自然科学基金资助项目(C2005000741)
[通讯作者] 张嫡群,Tel:(0311)86266335
虎杖野生植株及组织培养物中白藜芦醇
和虎杖苷含量的比较
于树宏,查建蓬,詹文红,张嫡群
(河北医科大学 药学院,河北 石家庄 050017)
[摘要] 目的:比较白藜芦醇和虎杖苷在不同来源的虎杖材料中含量积累的差异,以期筛选出适宜的培养材
料用于进一步的代谢调控研究。方法:采用反相高效液相色谱法对不同样品中白藜芦醇及虎杖苷的含量同时进行
检测。结果:在多年生野生植株和室内人工栽培幼苗中,白藜芦醇和虎杖苷均在植物根及根茎部特异性累积,其含
量要远远高于叶片和茎段。其中,以室内人工栽培3个月的幼苗中有效成分含量较高,虎杖苷的积累量为127%,
是野生植株的125倍,白藜芦醇含量(0401%)则接近野生植株水平。从虎杖的各种组织培养物中也可检测到白
藜芦醇和虎杖苷的存在,但是二者含量的高低与培养物的生长速度、生理状况及发育时期密切相关。在几种培养
物中,以毛状根的培养最具潜力,离体培养 30d后,其干重增长率为 829,分别是自然根和悬浮细胞的 84倍和
1928倍,而且还可积累一定量的虎杖苷(0037%)和白藜芦醇(0007%)。结论:所建立的分析检测方法,具有快
速、简便和准确的特点,尤其适于大批量生物样品的同时测定。在几种不同来源的虎杖材料中,毛状根是适宜大规
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模培养并可持续收获有效成分的培养物。
[关键词] 虎杖;白藜芦醇;虎杖苷;反相高效液相色谱法
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2006)08063705
白藜芦醇(resveratrol)及其糖苷———虎杖苷
(polydatin)均为植物体天然产生的二苯乙烯类化合
物,现代药理研究表明,二者对人体具有强心扩血
管、抑制血小板凝集、降血脂、抗病毒和增强机体免
疫力等作用[13],更为重要的是其特异性地针对癌细
胞具有杀伤力而不影响正常细胞[4]。
但受栽培地区的自然环境、土壤条件以及采收
季节等影响,不同产地的虎杖在白藜芦醇及虎杖苷
的含量上存在较大差别,严重制约着其在应用上的
数量和质量[58]。利用植物组织培养技术可迅速获
得不同的人工培养物,如愈伤组织、悬浮细胞系、毛
状根和组培苗等,但针对虎杖组织培养物中白藜芦
醇和虎杖苷的含量检测尚未见到相关报道。
白藜芦醇和虎杖苷在植物体内可以相互转
化[9],因此单独以醇或苷的含量作为药材质量评价
指标不够全面。在已报道的文献中即便能够对醇和
苷同时定量检测,也往往需要更换提取及色谱条
件[10],操作繁琐。本研究采用小体积1次超声提取
的方法,以甲醇水(50∶50)为色谱流动相,即可对白
藜芦醇及虎杖苷 2种成分同时进行快速定量检测,
特别适用于生物技术研究中对大量样品的含量动态
监测及代谢调控筛选工作。
1 材料与方法
11 材料
多年生虎杖植株采自河北师范大学生命科学学
院植物园内(以下简称野生植株),经该院植物学教
研室李敏讲师鉴定为虎杖 Polygonumcuspidatum
SiebetZucc,分别取其叶片、茎段、根及根茎等部
位;虎杖无菌组培苗分别培养在增殖培养基(MS+
TDZ005mg·L-1+NAA05mg·L-1)、生长培养基
(MS+CPPU01mg·L-1+NAA10mg·L-1)及生根
培养基(1/2MS+NAA10mg·L-1)中,生长30d后
不同部位取材;虎杖室内栽培植株为已生根的无菌
组培苗经炼苗后移栽于盛有蛭石的花盆中,在培养
室内生长 3m;虎杖愈伤组织由无菌苗茎段诱导获
得,置于不同培养基中,在光照或黑暗条件下生长;
虎杖细胞悬浮培养系由浅粉色疏松愈伤组织继代获
得;虎杖毛状根由发根农杆菌 ATCC15834感染无菌
苗叶片后获得(已经 PCR鉴定其转基因性质,结果
另文发表)。
12 仪器与试药
KNAUER高效液相色谱仪,K-2501型紫外检
测器(德国);BF-2002色谱工作站(北京北分瑞利
分析仪器集团有限公司);TGL-16G台式高速离心
机(上海安亭科学仪器厂);A&DGR-202型精密电
子天平(日本)。
白藜芦醇对照品购自中国药品生物制品检定所
(批号111535200301);虎杖苷对照品购自天津尖峰
天然产物研究开发有限公司(纯度98%);乙醇为化
学纯,甲醇为色谱纯,水为蒸馏水或亚沸蒸馏水。
TDZ(N苯基N′噻二唑5脲,纯度≥98%)和
CPPU[N苯基N′(4吡啶基)脲,纯度≥93%]均购
自四川省兰月科技开发公司。
13 白藜芦醇及虎杖苷的提取
将新鲜材料在45℃恒温干燥至恒重后,用研钵
研成细粉,过60目筛。精密称取05g样品细粉,置
5mL具塞离心管中,精密加入50%乙醇4mL,超声
提取 30min,3000r·min-1离心 15min,取上清液
045μm微孔滤膜过滤,续滤液避光保存待测。
14 色谱条件
色谱柱 InertsilODS3(46mm×250mm,5μm);
流动相甲醇水(50∶50);流速10mL·min-1;检测波
长300nm;进样量20μL;柱温为室温。
15 检测指标
干重增长率=(收获干重-接种干重)/接种干重
按外标峰面积法计算各样品中白藜芦醇及虎杖
苷的含量。
2 结果与讨论
21 白藜芦醇及虎杖苷含量检测方法的建立
211 不同材料样品的HPLC图谱比较 按13方
法分别制备各样品溶液,10μL进样分析,色谱图见
图1。经与对照品比对,确定在毛状根及愈伤组织
中含有白藜芦醇及虎杖苷成分,而与野生虎杖根部
样品的比较发现,保留时间在2~4min内的色谱峰
明显升高,推测会有极性较强的新化合物产生,需经
进一步的研究证实。
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图1 不同材料样品的HPLC图
A虎杖苷对照品;B白藜芦醇对照品;C野生虎杖根部;D毛状根;E愈伤组织;1虎杖苷;2白藜芦醇
212 标准曲线的制备 分别精密称取白藜芦醇
及虎杖苷对照品适量,用甲醇配成系列含量的对照
品溶液。按照上述色谱条件分别进样20μL,以浓度
为横坐标(X),峰面积值为纵坐标(Y)绘制标准曲
线。结果显示,白藜芦醇在62~310μg·mL
-1线性
关系良好,回归方程 Y=114×108X-1489×105
(r=0998);虎杖苷在 455~409μg·mL
-1线性关
系良好,回归方程为 Y=7597×107X+8155×102
(r=09993)。
213 精密度试验 取野生虎杖根部样品溶液连
续进样5次,测得白藜芦醇及虎杖苷的 RSD分别为
06%和05%,表明精密度良好。
214 稳定性试验 取样品溶液,每隔2h进样测定1
次,共测定5次,测得白藜芦醇及虎杖苷的RSD分别为
17%和14%,说明样品在8h内稳定性良好。
215 重复性试验 分别称取5份野生虎杖根部
样品粉末适量,处理后测定该样品中白藜芦醇的平
均含量为 0490%,RSD11%;虎杖苷平均含量为
455%,RSD20%,表明该测定方法重复性良好。
216 加样回收率试验 精密称取野生虎杖根部
样品粉末适量,分别加入一定量的白藜芦醇及虎杖
苷对照品溶液,按照上述方法处理并进样测定。白
藜芦醇和虎杖苷的平均回收率分别为 981%,
992%,RSD分别为25%,19%,测定次数分别为5
次。实验表明回收率符合要求。
217 提取方法的比较 精密称取野生虎杖根部
样品粉末适量,分别采用 50%乙醇索氏提取、回流
提取和超声提取,比较三者在白藜芦醇及虎杖苷提
取效率方面的差异。结果表明(表 1),超声提取的
效率能够达到索氏及回流提取水平的91%~93%,
因此从提高样品分析效率及减少试剂消耗等方面考
虑,本实验适宜采用快速简便的超声提取法。
22 多年生野生虎杖植株与室内人工栽培幼苗各
部位中白藜芦醇及虎杖苷含量的比较
利用上述建立的提取和分析方法,对多年生的
表1 索氏、回流及超声提取效率的比较(n=3)
方法
取样量
/g
时间
/h
体积
/mL
白藜芦醇 虎杖苷
含量/% RSD/% 含量/% RSD/%
索氏 0.4 8 75 0.526 2.4 5.01 1.0
回流 0.2 0.5 25 0.531 0.7 4.97 1.1
超声 0.2 0.5 4 0.490 1.1 4.55 2.0
野生虎杖植株与短期室内人工培养的虎杖幼苗各部
位中白藜芦醇和虎杖苷的含量进行了检测,结果表
明:白藜芦醇和虎杖苷的产生具有明显的器官特异
性,其在植株的根及根茎部大量合成,而在叶片及茎
段中含量甚微,这与传统用药部位相符。在培养室
内特定的温度、湿度、光照周期及营养条件下生长3
个月的虎杖幼苗,其根及根茎部虎杖苷的含量为
127%,是野生植株的 125倍,白藜芦醇的含量
(0401%)则接近野生植株水平。
23 虎杖组培苗不同发育时期、不同部位中白藜芦
醇和虎杖苷积累的动态变化
实验监测了虎杖组培苗在不定芽增殖、快速生
长及生根的不同发育阶段,其基部以及地上部分白
藜芦醇和虎杖苷的动态积累情况。结果表明,处于
增殖期培养时,地上部分的丛生芽中会积累较多的
虎杖苷 (019%),而基部白藜芦醇含量较高
(0079%)。幼苗快速生长时期,基部及幼苗中虎杖
苷的含量会明显下降,白藜芦醇几乎检测不到。转
入生根培养基后,不断萌生的白色幼根中虎杖苷的
积累达到最高值(056%),而此时幼苗中虎杖苷及
白藜芦醇的含量接近于丛生芽的水平。
24 不同虎杖愈伤组织中白藜芦醇及虎杖苷含量
的比较
来源于茎段的虎杖愈伤组织在不同的培养条件
下会形成颜色、质地、生长速度以及有效成分含量等
不同的培养物。实验发现,在无激素 SH培养基
(SH0)上培养的愈伤组织极易褐化且生长缓慢,其中
白藜芦醇的含量较高,但不利于虎杖苷的积累。采
用一定含量的 TDZ(005mg·L-1)处理可有效刺激
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愈伤组织的增殖生长及虎杖苷的合成,但在生长最
快的粉红色愈伤组织中白藜芦醇和虎杖苷的含量均
较低,见表 2。不同颜色的愈伤组织按照白藜芦醇
含量高低排序依次为:红褐色>浅褐色>浅粉色>
绿色>灰白色>粉红色;按照虎杖苷含量高低排序
为:绿色>浅粉色>灰白色>浅褐色>粉红色>红
褐色,其中,较适宜用作建立细胞悬浮培养系的起始
材料是浅粉色疏松愈伤组织。
表2 不同培养条件下虎杖愈伤组织中
白藜芦醇及虎杖苷含量的比较
培养基
培养
条件
颜色 质地
生长
速度
白藜芦醇
/%
虎杖苷
/%
SH0 光照 红褐色 硬实 最慢 0.039 0.012
黑暗 浅褐色 疏松 慢 0.028 0.033
SH+TDZ0.05光照 粉红色 疏松 最快 0.002 0.023
绿色 硬实 较快 0.012 0.111
黑暗 浅粉色 疏松 快 0.019 0.110
灰白色 疏松 快 0.006 0.087
25 虎杖毛状根、自然根及悬培细胞在生长速率及
有效成分积累方面的比较
虎杖毛状根由于转入了发根农杆菌 Ri质粒,因
此具有不依赖激素的自主生长特性,在无激素 MS
液体培养基中连续黑暗振荡培养30d后,始终保持
较高的生长活力,其干重增长率为 829,分别是自
然根和悬培细胞的 84倍和 1928倍(图 2)。自然
根和悬培细胞由于缺乏激素的维持,生长一段时间
后逐渐褐化死亡。
图2 虎杖毛状根、自然根及悬培细胞干
重增长率的比较
培养30d后,虎杖毛状根、自然根及悬培细胞
在白藜芦醇及虎杖苷的总积累量上差异不大,但是
在醇和苷的组成比例上有较大的不同。在生长停
滞、衰老褐化的自然根及悬培细胞中均含有较多的
白藜芦醇(0011%~0017%),而在生长旺盛的毛
状根中白藜芦醇含量较低(0007%),但虎杖苷的积
累量却大幅提高,可达到0037%。
3 结论与讨论
31 本实验采用 RPHPLC首次对虎杖野生植株及
其组织培养物中白藜芦醇和虎杖苷的含量进行了比
较,并通过精密度、稳定性、重复性及加样回收率等
实验,证明该检测方法准确可靠。
32 通过对索氏、回流及超声提取效率的比较,证
明本实验采用的小体积1次超声提取的方法具有提
取效率较高、杂质干扰少以及简便快速等优点,特别
适于大批量生物样品的分析。
33 在虎杖愈伤组织、毛状根等培养物中检测到白
藜芦醇和虎杖苷成分,说明其具有与原植物药相同
的代谢能力。此外,与野生虎杖植株根部样品色谱
图比较的结果表明,在这些培养物中还可能出现了
新的化合物,对于这些新物质的化学结构及生物活
性还有待进一步研究。
34 白藜芦醇和虎杖苷在植物的根及根茎部特异
性合成,其存在状态和含量高低还与植物材料所处
的发育时期、生理状况及生长速度等因素有关,在生
长缓慢、褐化衰老的组织培养物中往往会积累较高
含量的白藜芦醇,而在增殖旺盛的器官中虎杖苷的
含量则较高。
35 利用组织培养手段获得的虎杖无菌组培苗虽
然具有繁殖率高、生长速度快等优点,但由于生长环
境相对单一而稳定,导致“逆境物质”白藜芦醇和虎
杖苷合成能力下降。组培苗在室内经过一段时间的
人工培养后,又能够迅速“恢复”其代谢能力,有效成
分的含量接近甚至超过多年生野生植株的水平,这
一现象为充分发挥组织培养技术在药用植物资源开
发和研究中的优势作用开启了思路。
36 毛状根作为一种独特的转基因产物,具有其他
组织培养物不可比拟的生长优势。虽然在其生长过
程中积累的白藜芦醇和虎杖苷含量较低,但是通过
定向诱导的代谢调控技术有望得到进一步的提高。
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Contentscomparisonofresveratrolandpolydatininthewild
Polygonumcuspidatumplantanditstissuecultures
YUShuhong,ZHAJianpeng,ZHANWenhong,ZHANGDiqun
(ColegeofPharmacy,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)
[Abstract] Objective:TocomparethecontentsofresveratrolandpolydatininsomematerialsofPolygonumcuspidatumfromvarious
sources,sotoscreenandobtainthesuitableculturesforthefolowingmetabolismregulationstudy.Method:RPHPLCmethodwasappliedto
simultaneouslyassayresveratrolandpolydatinindiferentsamples.Result:Bythemodifiedmethodsofextractionanddetermination,large
amountofmaterialswerescreened.Theresultsindicatedthatthecontentsofresveratrolandpolydatininrootandrhizomewereevidentlyhigher
thanthoseintheleaveandstems.Thecontentofpolydatinintheseedlingsculturedindoorforthreemonthswas127%andshoweda125
timeincresethanthatinthewildplants,whilethecontentofresveratrol(0401%)approachedthatinthewildplants.Bothofresveratroland
polydatincouldbeexaminedfromdiferenttissueculturesofP.cuspidatum,suchasthesterileseedlings,calus,suspendedcelsandhairy
roots,andthelevelsofthemwerecloselyrelatedtothegrowthspeed,physiologicalstatusanddevelopmentalphase.Hairyrootshadthehigh
estpotentialityinseveraltestedculturesandtheincreaserateofdryweightwas829whenculturedinvitrofor30days,andshoweda84fold
anda1928foldincreasecomparedwiththoseofnaturalrootsandsuspendedcels,respectively.Thecontentofpolydatininthehairyroots
wasupto0037%andthatofresveratrolwas0007%Conclusion:Theestablishedanalysismethodisrapid,simpleandaccurate,especial
lyadaptedtothesimultaneousdeterminationofresveratrolandpolydatininmassivebiologicalsamples.Hairyrootcultureshavethesuperiority
amongthetestedmaterialsofP.cuspidatumandaresuitableforthelargescalebiomassandconsistentproductionofeficientconstituents.
[Keywords] Polygonumcuspidatum;resveratrol;polydatin;RPHPLC
[责任编辑 张宁宁]
封面图片简介
茄科植物莨菪 HyoscyamusnigerL.。一年或二年生草本,高可达1米,全体被有黏性腺毛和柔毛;基生叶常丛生成莲座状,
茎生叶互生,基部半抱茎,叶片长圆形,边缘羽状深裂或浅裂;花单生叶腋,常于茎端密集,花冠漏斗状,黄绿色,具紫色脉纹,雄
蕊5,不等长,花药深紫色;蒴果藏于宿萼内,卵球形,成熟时盖裂;种子细小,扁卵形或扁肾形,表面具细密隆起的网状纹理。
花期6~7月,果期8~9月。莨菪常生于林边、田野、路旁等处,有少量栽培。主要分布于河北、河南、内蒙古及东北、西北诸省
区。
莨菪种子入药为中药天仙子,始载于《神农本草经》,原名莨菪子,列入下品。李时珍释其名谓:“其子服之,令人狂狼放宕,
故名”。天仙子味苦、辛,性温,有大毒。功能解痉止痛、安神定喘,用于胃痉挛疼痛、喘咳、癫狂。天仙子主要含茛菪碱和东茛
菪碱,均系抗胆碱药。 (北京大学药学院 陈虎彪)
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