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Forecast on shelf life of Chinese Angelica based on its chemical components variation

基于化学成分变化的当归药材保质期预测



全 文 :基于化学成分变化的当归药材保质期预测
谢京晶1,赵 静2,李绍平1,3
(1.澳门大学 中华医药研究院,澳门;
2.中国药科大学 生药教研室 暨教育部现代中药重点实验室,江苏 南京 210038;
3.南京中医药大学 江苏省方剂重点实验室,江苏 南京 210046)
[摘要] 目的:以常用中药材当归为例,依据其所含活性成分变化规律,预测当归药材的保质期,并提出中药
材亟需建立保质期的问题。方法:经典恒温法对当归药材进行加速实验并预测其保质期,利用高效液相色谱法测
定其中的主要化学成分含量。结果:阿魏酸松柏酯和 Z藁本内酯的化学动力学方程分别为:lgk=-51521/T+
13811(r=09985)和lgk=-40646/T+104(r=09997),由此推算出室温下的温度常数 k25℃,进而计算出各
自含量下降10%时间t09分别约为13,7d,与验证实验结果基本一致。结论:该方法为当归药材保质期的建立提供
了参考依据,说明了建立中药材保质期的必要性。
[关键词] 中药材;保质期;当归;经典恒温法;化学成分
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)16199705
[收稿日期] 20071017
[基金项目] 江苏省方剂研究重点实验室开放课题基金
(022021014003)
[通讯作者] 李绍平,Tel:(853)3974692,Fax:(853)28841358,E
mail:spli@umac.mo
  “药材好,药才好”,好药必须用好的药材制造,
中药材本身质量既是保证中药安全有效的重要前
提,也是中药走向国际化的关键之一。如何保证中
药质量、建立科学合理的控制标准,是中药质量控制
研究的一项重要内容。中药的质量控制是一个动态
控制的过程,只有中药材的育种、栽培、贮存、运输等
每一个环节的质量都有合理的控制,才能得到治疗
效果好、质量高的中药材,这些环节环环相扣,缺一
不可。目前,我国对中药材及药材饮片的贮存管理
还没有相关的国家标准,也没有保质期的要求,这就
使得很多保存年限过久的药材依然在市场上广泛流
通和应用,成为影响中药安全性和有效性的一大隐
患[1],长远来看,这种情况也会影响中药在国内外
市场的声誉。
众所周知,中药材的贮藏环境、时间和条件等都
会影响其内在质量[23]。因此,在强调中药制剂的保
质期的同时,有必要重视中药材及饮片的保质期,在
多数药效成分尚不完全清楚的情况下,只有中药材
的质量得到保证,中药制剂的保质期才有意义。本
研究以素有“妇科圣药”之称,并且在中医临床和中
药制剂中被广泛应用的常用中药材当归为例,探讨
中药材建立保质期的问题。
目前,对当归药材的化学成分研究已经很多,阿
魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯(Z型和 E型)和3
丁烯基苯酞(Z型和 E型)等被认为是当归主要药
理作用的物质基础[46]。因此,作者采用经典恒温法
进行加速实验,以化学动力学理论为基础,通过高效
液相色谱法(HPLC)测定当归药材中各主要活性成
分的含量变化,考察当归药材的稳定性并对其保质
期进行初步预测。
1 仪器与试药
Agilent1100HPLCDAD系统(AgilentTechnol
ogies,USA),包括在线真空脱气机、高压四元梯度
泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器
(DAD)和 Agilent化学工作站;BRANSON8510E-
DTH超声仪(美国BRANSON公司);LHH-150GSP
型药品综合稳定性实验箱(上海蓝豹公司),C24KC
型振动培养箱(美国 EDISON公司)。甲醇、乙腈、
甲酸、醋酸(Merck,Germany);MiliQ水(Milipore,
Bedford,MA,USA)。
当归药材来源于甘肃岷县,经澳门大学李绍平
副教授鉴定为伞形科植物当归 Angelicasinensis
(Oliv.)Diels的干燥根;Z藁本内酯(批号121805,
ChromaDex公司),阿魏酸(批号07739910,中国药
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    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
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August,2008
品生物制品检定所),3正丁烯基苯酞(Z型为
893%,E型为107%,Sigma公司),阿魏酸松柏酯
为实验室自制,结构经MS,1HNMR,13CNMR确证,
纯度经HPLC分析在95%以上。
2 含量测定方法
2.1 色谱条件
ZorbaxODSC18色谱柱(46mm×250mm,5
μm)和ZorbaxODSC18预柱(46mm×125mm,5
μm);流动相为1%的醋酸水溶液(A)乙腈(B),梯
度洗脱(0~7min,10% ~33%B;7~55min,33%
B);流速10mL·min-1;柱温25℃;阿魏酸、阿魏
酸松柏酯和 Z/E藁本内酯的检测波长为 324nm,
Z/E3丁烯基苯酞的检测波长为260nm;进样量10
μL。在上述色谱条件下,阿魏酸、阿魏酸松柏酯、Z
藁本内酯、E型和Z型3丁烯基苯酞的保留时间分
别约为86,260,387,413,446min,而保留时间
为355min的色谱峰经 LCMS分析,与文献[78]
核对质谱数据确定为E藁本内酯,见图1。
1.阿魏酸;2.阿魏酸松柏酯;3.E3丁烯基苯酞;
4.Z藁本内酯;5.Z3丁烯基苯酞;6.E藁本内酯
图1 混合对照品(A)和当归样品(B)的HPLC图
2.2 系统适用性及方法学考察
用该方法对阿魏酸,阿魏酸松柏酯,Z藁本内酯
和E/Z正丁烯基苯酞建立了标准曲线,进行了系统
适用性的考察,日内和日间精密度、稳定性、重复性
以及加样回收率,各项都符合含量测定要求的标
准[9]。该方法准确、简便,具有良好的重复性和稳
定性,可对当归药材中6种主要成分进行含量测定。
3 经典恒温法及结果
3.1 样品处理
通过预实验确定反应温度为35,45,55,65℃。
每个温度下选择6个时间点进行检测。称取过20
目筛(09mm)的干燥当归粗粉10g,放入15mL
离心管中,密闭,尽量减少挥发性成分因挥发逸出带
来的影响。放入药品综合稳定性实验箱,避光,干
燥,以避免其他因素带来的干扰。定时取出药材(3
份/组),迅速放入-20℃冰箱以终止反应。精密称
取反应前后的药材05g置于50mL磨口具塞锥形
瓶中,加入25mL甲酸甲醇(5∶95)溶液,因为是粗
粉,为保证提取完全,超声提取60min,用甲酸甲醇
(5∶95)溶液补足失重,045μm微孔滤膜滤过,取
续滤液进样,按照2.1项下色谱条件进行分析。
结果各恒温条件下含量随时间变化最明显的是
阿魏酸、阿魏酸松柏酯和 Z藁本内酯。其中,阿魏
酸含量随阿魏酸松柏酯含量的减少呈现上升的趋
势,Z藁本内酯的含量也是降低。因此,稳定性预测
以阿魏酸松柏酯和Z藁本内酯为依据进行。
3.2 阿魏酸松柏酯稳定性预测
3.2.1 反应级数的确定 根据表1中各恒温条件
下加热时间与阿魏酸松柏酯含量变化的数据,以
lgC对时间t做图,结果显示皆为直线,说明阿魏酸
松柏酯的变化过程符合一级反应。
3.2.2 反应速率常数k值的计算 根据表2各恒温
条件下不同加热时间与相对浓度对数的数据,进行线
形回归,求得各直线的斜率,再按 lgC=(-k/2303)
t+lgC0,求得相应反应速率常数k,结果见表2。
3.2.3 室温(25℃)时k值的计算及室温时保质期
的推算 根据表3所得的各温度下的反应速率常数
k值,得到表3中数据,以 lgk对1/T数据进行线性
回归,得回归方程 lgk=-51521/T+138(r=
09985)。由此可得该反应的活化能 E=986kJ。
通过lgk1/T的回归曲线推算出常温(25℃)下的反
应速率常数k25℃ =333×10
-4。由此可以进一步计
算出25℃时阿魏酸松柏酯的含量下降 10%时间
t09=011/k25℃ =31558h≈13d。
3.3 Z藁本内酯稳定性预测
3.3.1 反应级数的确定 根据表4中各恒温条件
下加热时间与 Z藁本内酯含量变化的数据,以 lgC
对时间t做图,结果显示皆为直线,说明Z藁本内酯
的变化过程基本符合一级反应。
3.3.2 反应速率常数k值的计算 根据表4各恒温
条件下不同加热时间与相对浓度对数的数据,进行线
性回归,求得各直线的斜率,再按 lgC=(-k/2303)
t+lgC0,求得相应反应速率常数k,结果见表5。
3.3.3 室温(25℃)时k值的计算及室温时保质期
的推算 根据表5所得的各温度下的反应速率常数
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  表1 不同恒温条件下阿魏酸松柏酯的含量变化
温度
/℃

/h
质量分数A
/mg·g-1
相对质量分数C
/%
lgC
35 0 1296 10000 200
  24 1256 9692 199
  48 1224 9450 198
  72 1193 9205 196
  96 1158 8942 195
  120 1121 8651 194
45 0 1296 10000 200
  12 1233 9514 198
  24 1173 9054 196
  36 1098 8476 193
  48 1054 8132 191
  60 995 7679 189
55 0 1296 10000 200
  6 1196 9230 197
  12 1117 8624 194
  18 1026 7923 190
  24 956 7376 187
  30 879 6782 183
65 0 1296 10000 200
  3 1130 8724 194
  6 1026 7923 190
  9 888 6852 184
  12 858 6624 182
  15 743 5737 176
表2 各恒温条件下阿魏酸松柏酯所测数据
线性回归结果及k值
温度
/℃
回归方程 R2 k
35 Y=-00005X+19999 09982 00012
45 Y=-00019X+20008 09978 00044
55 Y=-00056X+20002 09993 00129
65 Y=-00155X+19922 09845 00357
表3 阿魏酸松柏酯在各温度下的反应速率常数
温度/℃ 1/T×10-3/K lgk
35 32468 -29387
45 31447 -23590
55 30488 -18895
65 29586 -14474
k值,得到表6中数据,以 lgk对1/T数据进行线性
回归,得回归方程 lgk=-40646/T+104(r=
09997)。由此可得该反应的活化能 E=778kJ。
通过lgk1/T的回归曲线推算出常温(25℃)下的反
应速率常数k25℃ =591×10
-4。由此可以进一步计
算出 25℃时 Z藁本内酯的含量下降 10%时间
t09=011/k25℃=17774h≈7d。
4 验证性实验及结果
表4 不同恒温条件下Z藁本内酯的含量变化
温度
/℃

/h
质量分数A
/mg·g-1
相对质量分数C
/%
lgC
35 0 599 10000 200
  24 575 9601 198
  48 548 9150 196
  72 516 8604 193
  96 506 8439 193
  120 504 8405 192
45 0 599 10000 200
  12 551 9202 196
  24 510 8514 193
  36 487 8128 191
  48 475 7924 190
  60 454 7574 188
55 0 599 10000 200
  6 535 8927 195
  12 502 8379 192
  18 475 7924 190
  24 457 7629 188
  30 430 7176 186
65 0 599 10000 200
  3 526 8773 194
  6 497 8299 192
  9 457 7628 188
  12 434 7236 186
  15 413 6887 184
表5 各恒温条件下所测Z藁本内酯数据
线性回归结果及k值
温度
/℃
回归方程 R2 k
35 Y=-00007X+19957 09396 00016
45 Y=-00019X+19888 09586 00044
55 Y=-00045X+19863 09682 00104
65 Y=-00105X+19854 09710 00242
表6 Z藁本内酯在各温度下的反应速率常数
温度/℃ 1/T×10-3/K lgk
35 32468 -27926
45 31447 -23590
55 30488 -19845
65 29586 -16165
  为了确定上述预测的准确性,对其进行验证性
实验。取同样的药材粉10g放入15mL离心管
密闭保存,放入25℃恒温培养箱,避光分别放置7d
和13d,观察阿魏酸松柏酯和Z藁本内酯的降解情
况,按照3.1项下的方法进行样品制备,按照2.1项
下的方法进行分析,结果如表7所示。
结果表明:阿魏酸松柏酯25℃放置13d,含量
下降约15%,而Z藁本内酯含量7d下降约8%,两
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   表7 验证性实验结果(25℃,n=3)
t/d CF/mg 含量下降/% Zlig/mg 含量下降/%
0 648 0 291 0
7 615 504 268 793
13 548 1539 233 1979
者结果均与预测值基本一致。
5 讨论
5.1 提取溶剂的选择
甲醇为最常用的提取溶剂,本实验采用甲酸甲
醇(5∶95)为提取溶剂[9]。2005年版《中国药典》对
当归含量测定中“供试品溶液的制备”用70%甲醇
加热回流30min的方法来测定样品中阿魏酸的含
量,这种条件下测得的并不是当归中实际的阿魏酸
含量,而是阿魏酸松柏酯分解后阿魏酸的含量。
5.2 样品的选择
在进行稳定性实验时,采用的是新采收的当归
粗粉而没有选择饮片,是为了保证样本的均一性。
当归药材粉碎成粗粉后,比表面积增大,会使成分降
解速率增加,因此当归药材的贮存期应大于当归粉,
但本实验结果可为全当归的保存期限提出一个参
考。
5.3 阿魏酸含量变化
由阿魏酸在各个恒温条件下含量随时间变化的
趋势图可以看出,随着时间的增加,阿魏酸的含量基
本上都呈直线增加,除了65℃温度下,阿魏酸的含
量在最初的3h增加明显,后面变化要趋缓。且温
度越高,阿魏酸增加的越快。由此可说明阿魏酸松
柏酯可能对热很敏感,是热不稳定的成分。在验证
性实验中,当归25℃保存13d,随着阿魏酸松柏酯
含量的降低,阿魏酸的含量则增加了 366%,从
009mg·g-1增加至012mg·g-1。
5.4 阿魏酸与阿魏酸松柏酯含量变化关系
实验中还发现,当归样品放于60℃稳定性实验
箱中6d,每间隔24h取样1次,每组3份样品,用同
样超声方法处理后从峰面积的变化中可以看到阿魏
酸与阿魏酸松柏酯的变化都由一开始的剧烈逐渐趋
于平缓,说明因为阿魏酸含量的增加,阿魏酸松柏酯
的分解有可能存在一个平衡点。随着阿魏酸在药材
中含量的不断增加,可能有抑制阿魏酸松柏酯进一步
分解的作用,相当于化学反应达到了一个平衡状态。
5.5 Z藁本内酯方法适用性的讨论
作为一个挥发性成分,Z藁本内酯其实并不适
用这个方法,但因为密闭保存,而且 Z藁本内酯也
是热不稳定成分[10],因此,该方法对于 Z藁本内酯
稳定性的预测结果从验证实验看还是比较准确的,
但这是在尽量避免挥发的情况下得到的结果,仅可
作为以Z藁本内酯为指标的当归保质期参考。
5.6 对验证性实验结果的思考
从验证实验结果可以看出,阿魏酸松柏酯实际
降解速度快于预测值(13d实际降解约15%),而
Z藁本内酯的实际降解速度则慢于预测值(7d实
际降解约8%)。出现前一种现象可能的原因是药
材中另外还有可以降解阿魏酸松柏酯的酶存在,且
在高温时酶失活,使得阿魏酸松柏酯的降解主要受
温度影响而慢于室温。出现后一种现象可能是因为
藁本内酯在高温下的挥发影响更明显,因而表现为
常温时降解稍慢。
5.7 对保质期的确定
中药材保质期是指可以保证临床用药安全、有
效的最长贮存期限,其可以通过考察药材中活性成
分(毒性成分和有效成分)的变化进行判断。中药
材成分复杂,不能像西药那样单纯以某一活性成分
降解10%作为判断是否合格的标准,且中药材及其
饮片一般只有其成分含量下限的规定,没有供保质
期预测计算的含量起点标准,因此,如何制定中药保
质期尚值得深入探讨。
此外,当归中因存在阿魏酸松柏酯向阿魏酸的
转化,因此,随着保存时间的延长,阿魏酸松柏酯的
含量虽在降低,阿魏酸的含量却在增加。2005年版
《中国药典》仅以阿魏酸的含量控制当归质量,且样
品的制备过程中又具有使当归中阿魏酸松柏酯转化
为阿魏酸的条件,因此,测定结果难以真正评价当归
药材的质量。值得注意的是,2005年版《中国药典》
要求当归中阿魏酸含量不得低于0.050%,但新采
集的当归中游离阿魏酸的真实含量远达不到这一要
求,即使在试验室中密封保存于-20℃冰箱中1年
的当归,虽然阿魏酸松柏酯和藁本内酯的含量都已
有明显下降,但游离阿魏酸的含量仍然未达到2005
年版《中国药典》标准。也就是说药典评价这两种
状态的当归药材可能均符合规定,但实际的药材品
质却已大不相同。由此可见,在活性成分尚不完全
清楚的情况下,为保证临床治疗效果,开展中药材保
质期研究是非常必要的。
因此,中药材保质期研究应结合药效评价和临
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床应用实际,从评价依据和判断指标两方面进行深
入研究,制定出科学合理的中药材保质期,以保证临
床用药的安全有效。
[参考文献]
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黑龙江中医药,2005(5):56.
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ForecastonshelflifeofChineseAngelicabasedonits
chemicalcomponentsvariation
XIEJingjing1,ZHAOJing2,LIShaoping1,3
(1.InstituteofChineseMedicalSciences,UniversityofMacau,MacaoSAR,China;
2.KeyLaboratoryofModernChineseMedicinesandDepartmentofPharmacognosy,ChinaPharmaceuticalUniversity,
Nanjing210038,China;3.JiangsuKeyLaboratoryforTCMFormulationResearch,NanjingUniversityof
TraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China)
[Abstract] Objective:TopredicttheshelflifeofChineseAngelicabyinvestigatingthestabilityofitsactivecomponents.
Method:Theclassichomeothermiamethodwasusedforforecasttheshelflife,andHPLCwasappliedforquantitativedeterminationof
chemicalcompoundsinChineseAngelica.Result:Thecorelationequations,thermalconstantatambienttemperature(k25℃)and
shelflife(t09)forconiferylferulateandZLigustilidewerelgk=-51521/T+138(r=09985),333×10
-4,13dandlgk=
-40646/T+104(r=09997),591×10-4,7d,respectively.Conclusion:TheshelflifeofChineseAngelicahasbeenestab
lished,whichsuggeststhatitisveryimportantforensuringthesafetyandeficacyofChinesecrudedrug.
[Keywords] chinesecrudedrug;shelflife;ChineseAngelica;classichomeothermiamethod;chemicalcomponents
[责任编辑 王亚君]
《中国中药杂志》荣获中国科协精品科技期刊工程B类项目资助
《中国中药杂志》在2006,2007连续两年获得中国科协C类项目资助基础上,2008年更上一层楼,荣获中国科协精品科技
期刊工程B类项目资助。
《中国中药杂志》是我国中医药学术期刊中唯一的半月刊,由肖培根、王永炎、姚新生、李连达、张伯礼、陈香美等院士领衔
组成权威性的国内药学领域专家编委会。被美国Scifinder数据库(包括Medline,CA),以及Scopus数据库,IPA,WHO西太平
洋地区医学索引(WPRIM)等国际权威数据库收录。是中国自然科学核心期刊、中国中文核心期刊、中国科技核心期刊。据中
国学术期刊2006年综合引证报告,本刊影响因子0.959;据中国学术期刊文献评价统计分析,本刊2005~2007总下载频次达
45万,浏览频次50万,访问频次95万。
本刊已经全面实现了投稿、审稿、退修等编辑系统网络化办公,并建立了期刊独立网站(htp://www.cjcmm.com.cn),提
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第33卷第16期
2008年8月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 16
August,2008