免费文献传递   相关文献

Study of liquorice processing fructus

甘草制吴茱萸炮制研究



全 文 :甘草制吴茱萸炮制研究
洪玉梅,王维皓,王智民,王金华
(中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:通过正交设计建立甘草制吴茱萸的炮制工艺,并进行质量标准研究、毒理研究和药效学研究。
方法:以吴茱萸胺、吴茱萸次碱为指标进行炮制工艺的优化,以RPHPLC测定吴茱萸胺和吴茱萸次碱的含量,并进
行吴茱萸生品和甘草制品小鼠的急性毒性实验和药效学试验。结果:甘草制吴茱萸的炮制工艺,甘草汁用量以6
倍于药材的甘草溶液进行闷润,以低于230℃炒制至干。毒性及药效研究:吴茱萸生品和甘草制品以40(g饮片)
·(kg体重)-1,b.w给小鼠一次性灌胃给药后观察7d,各给药组的动物均未见明显异常;给小鼠灌胃给予06g生
药·kg-1(临床等效剂量)的吴茱萸饮片产品(生品、甘草制品)后,均可明显升高小鼠热板痛阈值;明显减少由冰醋
酸诱导的小鼠腹膜刺激性扭体反应次数,对小鼠扭体反应次数,对小鼠扭体反应的潜伏期也有一定延长作用。结
论:生品吴茱萸和甘草制吴茱萸的毒性较低,甘草制吴茱萸具有镇痛作用。
[关键词] 甘草制吴茱萸;炮制工艺;质量标准;毒性;药效
[中图分类号]R283 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)08088405
[收稿日期] 20071225
[基金项目] 国家“十五”科技攻关项目(2001BA701A5520)
[通讯作者] 王智民,Tel:(010)84014128,Email:zhmw123
@263.net
  吴茱萸为芸香科植物吴茱萸 Evodiarutaecarpa
(Juss.)Benth.石虎 E.rutaecarpa(Juss.)Benth.
var.oficinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸 E.ru
taecarpa(Juss.) Benth.var.bodinieri(Dode)
Huangd的干燥近成熟果实。为传统中药,具有散
寒、止痛、助阳、止泻,降逆止呕之功,能散寒止痛,降
逆止呕,助阳止泻。临床用于厥阴头痛,寒疝腹痛,
寒湿脚气,经行吞酸,五更泄泻;外治口疮、高血压等
症。经本草考证:历代文献关于吴茱萸的炮制方法
很多,有酒炒、醋炒、童便炒、黄连制、黑豆汁制,但未
见甘草汁制,而历版药典中均记载了甘草制吴茱萸。
经文献查阅,其具体炮制工艺、质量、炮制前后的毒
性和药效等方面研究未见报道。为揭示该炮制品的
科学性,作者选吴茱萸 E.rutaecarpa为主要研究对
象,在质量研究的基础上,对炮制工艺经行了优选,
并进行了药效学和毒性的比较研究。
1 甘草制吴茱萸的炮制工艺研究
甘草制吴茱萸非古法,是近代才开始采用的炮
制方法,其目的为解毒和降低燥性。现代文献及各
地炮制规范记载的制法为:“取甘草煮汁,将甘草汁
与净吴茱萸拌均,闷润吸尽后,置锅中文火炒至微
干,取出,晾干”。但上述方法中详细技术细节均未
说明,作者参照炮制规范,用单因素考察法,以吴茱
萸胺和吴茱萸次碱为主要指标成分,确定具体的炮
制工艺参数。
1.1 炮制辅料甘草汁的制备 规格的确定:全国和
各省炮制规范中有2种规格:①将甘草捣碎后煮汁;
②取甘草片煮汁,甘草片的规格大小没有具体规定。
因此作者考察了2种规格的甘草煮制后的出膏率,
见表1。结果表明:甘草捣碎的出膏率较高。本研
究选用的甘草规格为甘草片。
表1 不同规格的甘草出膏率(n=2)
甘草规格
加水倍数
(1煎,2煎)
煮制时间
(1煎,2煎)/min
出膏率
/%
 甘草片(ф08~10cm, 8,6 30,20 2029
厚1~2mm)      
甘草捣碎 8,6 30,20 2698
  用量的确定:根据全国和各省市的炮制规范,以
多数的用量作为标准,从表2可知,多数地区炮制吴
茱萸100kg,用甘草6kg,因此作为辅料用甘草的用
量以每100kg吴茱萸用甘草6kg为宜。
  甘草汁的制备:多数地区的制备方法是“取甘
草,加适量水,煎煮2次,合并煎液”。1988年全国
炮制规范“加水(1∶5)煎煮2次,去渣”;北京药品标
准规定“加水煮2次,第1次煎2h,第2次煎1h,合
·488·
第33卷第8期
2008年4月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 8
April,2008
表2 不同地区炮制100kg吴茱萸甘草
辅料的用量
甘草用量/kg 地区或规范
6  1988年全国炮制规范、甘肃、辽宁、江西、陕西、
  河南、河北、山东、2000年、2005年版药典
7 北京
65 江苏、安徽、1977年版药典
625 上海
3 青海
并煎液”。作者将甘草加水煎煮2次,煎煮时间定
为第1次煎2h,第2次煎1h,考察了不同加水倍数
对甘草出膏率的影响,见表3。结果方法1的出膏
率较高,选择该法。
表3 不同加水倍数甘草的出膏率(n=2)
No.
加水倍数
(1煎,2煎)
煮制时间
(1煎,2煎)/h
出膏率
/%
1 10,5 2,1 2206
2 8,5 2,1 2005
3 6,5 2,1 1819
1.2 甘草汁量和闷润时间的确定 称取北京吴茱
萸生品100g,平行称定3份,分别置500mL烧杯
  
内。另称取甘草片6g,平行称定3份,按甘草汁的
制备方法煮制,浓缩(或稀释)至甘草的 5,6,7倍
量,分别趁热将甘草汁拌入吴茱萸药材内,并搅拌均
匀,每隔1h搅拌1次,闷润至透心,观察闷润程度
及闷润时间。
结果稀释5倍甘草汁溶液的闷润效果不均匀;6
倍拌入药材后,药材底部有少量溶液积存,闷润3h
后,已将药材闷透至心,底部没有甘草汁积存,但药
材表面较湿,继续闷润至6h后,药材表面较干爽,
手抓不黏,置锅中炒制不粘锅;7倍甘草溶液量偏
多,闷润6h后较湿润,不利于炒制。因此,甘草汁
以制成6倍量的甘草溶液进行闷润较合理。
1.3 炒制火候的确定 全国各地炮制规范中没有
规定具体的炒制温度,均用文火将吴茱萸药材炒至
有香气,发泡鼓起,表面较原色稍深。以中试规模进
行炮制温度的确定(北京首创大地,10批中试的平
均收率为966%)。炒制设备为自动炒药机,炮制
温度指炒锅内温度。见表4。
表4 不同炒制温度的甘草制吴茱萸中吴茱萸胺和吴茱萸次碱的含量(n=2)
样品 炒制温度/℃ 炒制时间/min 外观特征 含水量/% 吴茱萸胺/mg·g-1 吴茱萸次碱/mg·g-1
生品       417 321 176
制品 165±5 11 鼓起,深棕褐色,无焦化 252 373 221
  195±5 9 鼓起,暗褐色,无焦化 145 376 287
  230±5 8 鼓起,焦褐色,部分焦化 354 278 520
1.4 小结 从表4的含量测定结果可以看出,不同
炒制程度的制品对2种成分的含量影响很大,且具
有明显的规律性。随着炒制火候的加大,2种成分
含量的总和有增大的趋势,文火炒制品与生品中的
含量没有显著性差异,而中火与武火炒制品中若有
焦化现象发生时,则2种成分含量变化较明显,吴茱
萸胺的含量减小,而吴茱萸次碱的含量明显增加。
推测可能是当药材焦化时吴茱萸胺母核上的甲
基脱落转变成吴茱萸次碱,羟基吴茱萸胺脱水变成
吴茱萸次碱。因此,炒制吴茱萸时要控制好“火
候”,焦化为炒制成功与否的临界点,这说明前人炮
制经验的合理性。
2 含量测定
2.1 色谱条件 AltimaODSC18色谱柱(46mm×
250mm,5μm);流动相乙腈水四氢呋喃磷酸(51∶
48∶1∶005);柱温25℃;流速08mL·min-1;检测
波长225nm;系统适用性:吴茱萸胺和吴茱萸次碱
理论踏板数均不低于12000。
供试品溶液:取吴茱萸及炮制品样品粉碎,过
40目筛,精密称取05g,置50mL量瓶中,移液管
吸取50mL甲醇置量瓶中,超声提取45min,超声前
后称重补失,静置过夜,吸取上清液少量过045μm
微孔滤膜,弃去初滤液,留取续滤液备用。
2.2 线性考察 精密吸取吴茱萸胺和吴茱萸次碱标
准溶液各2,4,6,8,10μL进样,自动计算峰面积积分
值,以峰面积积分值对进样量进行回归处理,分别得
到回归方程为Y=7427196X+191928,r=09999;
Y=3190769X+164174,r=09999;结果表明吴茱
萸胺在0025~0125μg呈良好的线性关系;吴茱萸
次碱在0036~018μg呈良好的线性关系。
2.3 提取条件考察 文献[1]和2000年版药典均
采用甲醇提取,因此仅对提取时间及溶剂体积进行
考察。
取样品粉碎,过60目筛,精密称取05g,共6
份,置25mL或50mL量瓶中,分别加甲醇至刻度超
声提取15,30,45min。结果在甲醇样品(100∶1)时
超声45min提取较充分。
2.4 精密度试验 取湖南甘草制吴茱萸(批号
·588·
第33卷第8期
2008年4月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 8
April,2008
G0409011)样品溶液在1d内重复进样6次,结果吴
茱萸胺峰面积平均值6849808,RSD062%。吴茱
萸次碱峰面积平均值2250835,RSD062%。
2.5 重复性试验 取湖南甘草制吴茱萸(批号
Y0409011)粉末05g,精密称定,平行操作5份,按
样品制备方法处理并测定。以外标一点法计算含
量,吴茱萸胺质量分数平均值为176mg·g-1,RSD
068%。吴茱萸次碱质量分数平均值为122mg·
g-1,RSD059%。
2.6 回收率试验 取湖南甘草制吴茱萸(批号
G0409011)样品粉末025g,5份,分别精密加入吴
茱萸胺和吴茱萸次碱对照品一定量,按样品制备方
法处理并测定,计算回收率,见表5。
表5 甘草制吴茱萸中吴茱萸胺和吴茱萸次碱加样回收率
测定成分
药材中含量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
吴茱萸胺1)  0441 0875 9874    
  0440 0883 10078    
  0440 0876 9916 9975 096
  0441 0883 10076    
  0439 0876 9932    
吴茱萸次碱2) 0308 0606 9727    
  0306 0617 10103    
  0306 0611 9901 10039 222
  0307 0623 10274    
  0306 0620 10189    
  注:1)加入量均为0440mg,2)加入量均为0308mg
2.7 样品测定 结果见表6。
表6 吴茱萸生品、甘草制品及市售品中2种成分的含量 mg·g-1 
品名 (购)产地
生品
吴茱萸胺/mg·g-1 吴茱萸次碱/mg·g-1
批号
制品
吴茱萸胺/mg·g-1 吴茱萸次碱/mg·g-1
吴茱萸 安徽亳州(湖南) 179 125 G0409011 191 117
        G0409012 194 124
        G0409013 190 118
        G0409021 186 129
  安徽亳州(江西) 183 124 G0409022 189 119
        G0409023 187 120
        G0409031 199 119
  安徽亳州(浙江) 198 123 G0409032 197 110
        G0409033 187 110
        G0409034 192 109
吴茱萸 湖南      016 036   016 035
  河南郑州    132 115   133 129
  扬州(四川泸州) 161 135   097 092
  浙江(磐安)   169 132   109 117
  陕西咸阳    1515 1083   618 643
  广州(广西)   193 123   188 126
  北京首创(湖南) 308 169   387 226
  贵州遵义    368 285   513 433
石虎 北京卫仁(云南) 192 258   617 733
  四川犍为    1528 472   1317 480
2.8 小结 甘草制吴茱萸中次碱含量与生品比较
变化不大,而吴茱萸胺含量比生品增加。中试品随
产地不同但制品中生物碱差异不大;市售品不同产
地的生品和炮制品中次碱和胺的变化无明显规律
性,说明产地和炮制方法都会在很大程度上影响其
质量。四川、云南、陕西市售品中生物碱含量较高,
可能是云贵为其道地产区的缘故。
3 急性毒性研究
3.1 药物 吴茱萸生品(批号 040902,出膏率
214%)、甘 草 制 品 (批 号 G040902,出 膏 率
2243%)。
3.2 动物 ICR小鼠,体重(204±11)g,雌雄各
半。由北京维通利华试验动物技术有限公司提供。
二级饲养,合格证号 SCXK000008,动物饲养于
SPF级的动物室内,温度22~24℃,湿度40~70%,
人工照明,12h明暗周期,6~10次/h。动物的饲料
为军事医学科学院提供的灭菌小鼠颗粒饲料。
3.3 方法 预试验:先选用20~22g体重的小鼠
84只,分21组,雌雄各半,吴茱萸饮片的不同剂量
组分别为雌、雄各2只动物。将动物禁食16h后,
·688·
第33卷第8期
2008年4月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 8
April,2008
每个样品均分3个浓度梯度进行毒性预试验,大剂
量均采用50g·kg-1(饮片/体重,下同)、中剂量35
g·kg-1、小剂量245g·kg-1进行1日内1次灌胃
给药预试验。结果表明生品、甘草制品的大剂量组
各有1只雄性的小鼠出现死亡,其他药物的各组动
物均未出现死亡。
最大耐受量测定:根据预试验结果,吴茱萸生品
40g·kg-1b.w,剂量为临床剂量(以60kg人计算)
的533倍。试验前动物禁食16h,自由饮水,将动物
按体重均匀分为 7组,每组 20只,雌、雄各 10只。
各药物均采用1次性灌胃给药,给药后连续观察7
d,观察动物的一般情况、活动、神态、排泄物、饮食情
况,记录动物有无死亡,隔日称1次体重。结果:以
40g·kg-1b.w,各给药组的动物均未见明显的异
常。动物的行为活动、饮食均未见异常,体重于对照
组比较,除生品组的雄性动物的体重明显低于对照
组外,制品组与对照组比较均未见显著性差异。因
药物已配成最大给药浓度,给药体积也为最大,故而
确定吴茱萸饮片对小鼠的最大耐受剂量为40g·
kg-1。
表7 吴茱萸生品及饮片对小鼠最大耐受量
组别
剂量
/g·kg-1
性别 动物数
药前体重
/g
药后体重检测时间/d
3 5 7
对照组        ♂ 10 198±09 241±06 263±06 2917±09
    ♀ 10 193±08 237±05 258±12 266±14
吴茱萸生品汤剂  40 ♂ 10 198±09 220±111) 228±192) 237±182)
    ♀ 10 193±08 240±13 247±13 254±13
甘草制吴茱萸汤剂 40 ♂ 10 198±09 213±18 242±08 271±14
    ♀ 10 193±08 234±11 242±14 252±10
  注:与正常对照组比较1)P<005,2)P<001
4 药效学试验研究
吴茱萸具有散寒止痛,降逆止呕,助阳止泄的作
用。临床上主要用于治疗厥阴头痛,寒疝腹痛,行径
腹痛,脘腹胀痛等痛证。根据其主治功能,拟采用热
刺激性疼痛和冰醋酸诱导的小鼠扭体反应模型,试
验比较其镇痛作用。结果表明,给小鼠灌胃给予
06g·kg-1(临床等效剂量)的产品(生品、甘草制
品)后,均可明显延长小鼠的热板痛阈值;明显减少
由冰醋酸诱导的小鼠腹膜刺激性扭体反应次数,对
小鼠扭体反应的潜伏期也有一定延长作用。
4.1 对小鼠热刺激性疼痛的影响 生品和制品配
制为06g·kg-1的浓度(为体表面积临床等效剂
量)。小鼠同3.2。热板仪:HSS-1B数字式超级恒
温水浴槽,成都仪器厂生产。阳性对照药索米痛
01g·kg-1。
将热板温度调节至(55±01)℃,小鼠单只放
入热板测定仪,以放入小鼠后至小鼠出现舔后足动
作之间的时间为痛阈值。痛阈值低于6s者和超过
30s或跳跃者予以淘汰。将筛选后的按痛阈值分入
各组,开始给药。于药后1,2h测定痛阈值。各组
试验数据均已 珋x±s表示。各给药组和阳性对照药
组分别与对照组进行比较,各药物组之间进行比较。
结果用t检验进行统计分析。
结果表明,给小鼠灌胃给予吴茱萸饮片各不同
工艺制品06g·kg-1后2h,与模型对照组比较各
给药组均可明显延长小鼠的热板痛阈值,表明生品
和炮制品对温热刺激诱导的疼痛具有明显的镇痛作
用。结果见表8。
表8 吴茱萸生品及炮制品对小鼠热板痛阈的影响
(珋x±s,n=10)
组别
剂量
(g生药/kg)
痛阈值/s
药后1h 药后2h
对照组    - 206±474 183±620
阳性药    01 283±5662) 238±538
吴茱萸生品  06 242±565 280±11351)
甘草制吴茱萸 06 233±502 257±7951)
  注:与模型对照组比较1)P<005,2)P<001
4.2 对冰醋酸诱导的小鼠化学性腹膜刺激性疼痛
的影响 受试药物以及剂量、动物的分组、给药方法
等均同前。
各组动物给药后 1h,给每只小鼠腹腔注射
06%冰醋酸02mL,随后立即观察每只小鼠出现
扭体的潜伏期和15min内的扭体次数。各组试验
数据均已 珋x±s表示。各给药组和阳性对照药组分
别与对照组进行比较,各药物组之间进行平行比较。
结果用t检验进行统计分析。
结果表明,给小鼠灌胃给予生品及甘草制品06
·788·
第33卷第8期
2008年4月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 8
April,2008
g·kg-1后1h,与对照组比较,各组均可明显减少由
冰醋酸诱导的小鼠腹膜刺激性扭体反应次数(P<
005),对小鼠出现扭体反应的潜伏期也有一定的延
长作用,但未见显著性差异。表明吴茱萸对化学刺激
性疼痛具有明显的镇痛作用,但生品、制品间比较,未
见显著性差异。结果见表9。
表9 吴茱萸饮片及其各配方颗粒冰醋酸诱导的小鼠
扭体反应的影响(珋x±s,n=10)
组别
剂量
/g·kg-1
扭体潜伏期
/min
扭体次数
对照     - 32820±12770 2050±1181
阳性     01 900±02)   02)
吴茱萸生品  06 41370±22261 1070±6341)
甘草制吴茱萸 06 47890±21567 950±6791)
  注:与模型对照组比较1)P<005,2)P<001
5 结论
选择吴茱萸胺和吴茱萸次碱为指标进行了甘草
制吴茱萸的炮制工艺研究,结果表明炮制温度会对
吴茱萸胺的含量造成影响,随着炒制温度的升高,其
含量下降,吴茱萸次碱含量增高。
本草记载吴茱萸生品有小毒,具有温热苦燥辛香
走窜之副作用,《本草通玄》中有“陈久者良”的说法,
经炮制后辛香之气大为减少,口尝口味也有减弱,实
验证明其挥发油总量按生品、醋制品、甘草制品、盐制
品收率依次下降,盐制品仅及生品的一半,据此有人
认为炮制后对降低其用药的临床副作用、减轻毒副作
用发挥了有利的作用[3]。现代应用习惯认为:吴茱萸
经甘草制后能降低毒性和燥性,更好的发挥效用。本
试验确证了生品和甘草制品的毒性较小。
药效学结果表明:吴茱萸生品和甘草制品均有
明显的镇痛作用。
[参考文献]
[1] 庄燕黎,晁若冰.高效液相色谱法测定吴茱萸药材及其制剂中
吴茱萸胺和吴茱萸次碱的含量[J].药物分析杂志,1997,17
(3):174.
[2] 陈 奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,
1993:361.
[3] 张 韬,张世臣,魏璐雪.中药吴茱萸炮制前后挥发油成分分
析[J].中国中药杂志,1994,19(6):341.
Studyofliquoriceprocessingfructus
HONGYumei,WANGWeihao,WANGZhimin,WANGJinhua
(InstituteofChineseMateriaMedicaChina,AcademyofChineseMedicalScience,Beijing100700,China)
[Abstract] Objective:Toestablishtheprocessingmethodoffructusevodiaeanditsstandardforqualitycontrol,toxicityas
pectsandpharmacodynamicswerecariedoutatthesametime.Method:Inthestudiesofprocessingtechniques,theoptimizedtech
nicalparametersweredeterminedbythecontentsofevodiamineandevodine.Andtheacutetoxicityandpharmacodynamicswerestud
iedbyrats.Result:Theprocesswasthattheliquoriceprocessedfructusevodiaewaswetedbyliquoricedecoctionbysixthofrawfruc
tusevodiae(V/W)andfriedbelow230℃.ThemethodofdetectingthecontentsofevodiamineandevodinewasthatAltimaODSC18
(46mm×250mm,5μm);mobilephaseacetonitrilewatertetrahydrofuranphosphoricacid(51∶48∶1∶005);columntemperature
25℃;mobilerate08mL·min-1;wavelength225nm.Thetoxicityexperimentationshowthatratsdidn'tshowanynotablechanges
afterafusedtherawmaterialandtheprocessedfructusevodiae'sdecotion40g·kg-1b.w.atonetimesevendaysconstantly.Thean
algesicefectwasobservedafter06g(material)·kg-1(weight)b.w.Conclusion:Thetoxicityoftherawmaterialandthepro
cessedonewerelowandtheliquoriceprocessedfructusevodiaanalgesicefectwasgood.
[Keywords] liquoriceprocessedfructusevodiae;processingmethod;standardforqualitycontrol;acutetoxicity;pharmaco
dynamics
[责任编辑 鲍 雷]
·888·
第33卷第8期
2008年4月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 8
April,2008