全 文 :甘草制吴茱萸炮制研究
洪玉梅,王维皓,王智民,王金华
(中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:通过正交设计建立甘草制吴茱萸的炮制工艺,并进行质量标准研究、毒理研究和药效学研究。
方法:以吴茱萸胺、吴茱萸次碱为指标进行炮制工艺的优化,以RPHPLC测定吴茱萸胺和吴茱萸次碱的含量,并进
行吴茱萸生品和甘草制品小鼠的急性毒性实验和药效学试验。结果:甘草制吴茱萸的炮制工艺,甘草汁用量以6
倍于药材的甘草溶液进行闷润,以低于230℃炒制至干。毒性及药效研究:吴茱萸生品和甘草制品以40(g饮片)
·(kg体重)-1,b.w给小鼠一次性灌胃给药后观察7d,各给药组的动物均未见明显异常;给小鼠灌胃给予06g生
药·kg-1(临床等效剂量)的吴茱萸饮片产品(生品、甘草制品)后,均可明显升高小鼠热板痛阈值;明显减少由冰醋
酸诱导的小鼠腹膜刺激性扭体反应次数,对小鼠扭体反应次数,对小鼠扭体反应的潜伏期也有一定延长作用。结
论:生品吴茱萸和甘草制吴茱萸的毒性较低,甘草制吴茱萸具有镇痛作用。
[关键词] 甘草制吴茱萸;炮制工艺;质量标准;毒性;药效
[中图分类号]R283 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)08088405
[收稿日期] 20071225
[基金项目] 国家“十五”科技攻关项目(2001BA701A5520)
[通讯作者] 王智民,Tel:(010)84014128,Email:zhmw123
@263.net
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸 Evodiarutaecarpa
(Juss.)Benth.石虎 E.rutaecarpa(Juss.)Benth.
var.oficinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸 E.ru
taecarpa(Juss.) Benth.var.bodinieri(Dode)
Huangd的干燥近成熟果实。为传统中药,具有散
寒、止痛、助阳、止泻,降逆止呕之功,能散寒止痛,降
逆止呕,助阳止泻。临床用于厥阴头痛,寒疝腹痛,
寒湿脚气,经行吞酸,五更泄泻;外治口疮、高血压等
症。经本草考证:历代文献关于吴茱萸的炮制方法
很多,有酒炒、醋炒、童便炒、黄连制、黑豆汁制,但未
见甘草汁制,而历版药典中均记载了甘草制吴茱萸。
经文献查阅,其具体炮制工艺、质量、炮制前后的毒
性和药效等方面研究未见报道。为揭示该炮制品的
科学性,作者选吴茱萸 E.rutaecarpa为主要研究对
象,在质量研究的基础上,对炮制工艺经行了优选,
并进行了药效学和毒性的比较研究。
1 甘草制吴茱萸的炮制工艺研究
甘草制吴茱萸非古法,是近代才开始采用的炮
制方法,其目的为解毒和降低燥性。现代文献及各
地炮制规范记载的制法为:“取甘草煮汁,将甘草汁
与净吴茱萸拌均,闷润吸尽后,置锅中文火炒至微
干,取出,晾干”。但上述方法中详细技术细节均未
说明,作者参照炮制规范,用单因素考察法,以吴茱
萸胺和吴茱萸次碱为主要指标成分,确定具体的炮
制工艺参数。
1.1 炮制辅料甘草汁的制备 规格的确定:全国和
各省炮制规范中有2种规格:①将甘草捣碎后煮汁;
②取甘草片煮汁,甘草片的规格大小没有具体规定。
因此作者考察了2种规格的甘草煮制后的出膏率,
见表1。结果表明:甘草捣碎的出膏率较高。本研
究选用的甘草规格为甘草片。
表1 不同规格的甘草出膏率(n=2)
甘草规格
加水倍数
(1煎,2煎)
煮制时间
(1煎,2煎)/min
出膏率
/%
甘草片(ф08~10cm, 8,6 30,20 2029
厚1~2mm)
甘草捣碎 8,6 30,20 2698
用量的确定:根据全国和各省市的炮制规范,以
多数的用量作为标准,从表2可知,多数地区炮制吴
茱萸100kg,用甘草6kg,因此作为辅料用甘草的用
量以每100kg吴茱萸用甘草6kg为宜。
甘草汁的制备:多数地区的制备方法是“取甘
草,加适量水,煎煮2次,合并煎液”。1988年全国
炮制规范“加水(1∶5)煎煮2次,去渣”;北京药品标
准规定“加水煮2次,第1次煎2h,第2次煎1h,合
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表2 不同地区炮制100kg吴茱萸甘草
辅料的用量
甘草用量/kg 地区或规范
6 1988年全国炮制规范、甘肃、辽宁、江西、陕西、
河南、河北、山东、2000年、2005年版药典
7 北京
65 江苏、安徽、1977年版药典
625 上海
3 青海
并煎液”。作者将甘草加水煎煮2次,煎煮时间定
为第1次煎2h,第2次煎1h,考察了不同加水倍数
对甘草出膏率的影响,见表3。结果方法1的出膏
率较高,选择该法。
表3 不同加水倍数甘草的出膏率(n=2)
No.
加水倍数
(1煎,2煎)
煮制时间
(1煎,2煎)/h
出膏率
/%
1 10,5 2,1 2206
2 8,5 2,1 2005
3 6,5 2,1 1819
1.2 甘草汁量和闷润时间的确定 称取北京吴茱
萸生品100g,平行称定3份,分别置500mL烧杯
内。另称取甘草片6g,平行称定3份,按甘草汁的
制备方法煮制,浓缩(或稀释)至甘草的 5,6,7倍
量,分别趁热将甘草汁拌入吴茱萸药材内,并搅拌均
匀,每隔1h搅拌1次,闷润至透心,观察闷润程度
及闷润时间。
结果稀释5倍甘草汁溶液的闷润效果不均匀;6
倍拌入药材后,药材底部有少量溶液积存,闷润3h
后,已将药材闷透至心,底部没有甘草汁积存,但药
材表面较湿,继续闷润至6h后,药材表面较干爽,
手抓不黏,置锅中炒制不粘锅;7倍甘草溶液量偏
多,闷润6h后较湿润,不利于炒制。因此,甘草汁
以制成6倍量的甘草溶液进行闷润较合理。
1.3 炒制火候的确定 全国各地炮制规范中没有
规定具体的炒制温度,均用文火将吴茱萸药材炒至
有香气,发泡鼓起,表面较原色稍深。以中试规模进
行炮制温度的确定(北京首创大地,10批中试的平
均收率为966%)。炒制设备为自动炒药机,炮制
温度指炒锅内温度。见表4。
表4 不同炒制温度的甘草制吴茱萸中吴茱萸胺和吴茱萸次碱的含量(n=2)
样品 炒制温度/℃ 炒制时间/min 外观特征 含水量/% 吴茱萸胺/mg·g-1 吴茱萸次碱/mg·g-1
生品 417 321 176
制品 165±5 11 鼓起,深棕褐色,无焦化 252 373 221
195±5 9 鼓起,暗褐色,无焦化 145 376 287
230±5 8 鼓起,焦褐色,部分焦化 354 278 520
1.4 小结 从表4的含量测定结果可以看出,不同
炒制程度的制品对2种成分的含量影响很大,且具
有明显的规律性。随着炒制火候的加大,2种成分
含量的总和有增大的趋势,文火炒制品与生品中的
含量没有显著性差异,而中火与武火炒制品中若有
焦化现象发生时,则2种成分含量变化较明显,吴茱
萸胺的含量减小,而吴茱萸次碱的含量明显增加。
推测可能是当药材焦化时吴茱萸胺母核上的甲
基脱落转变成吴茱萸次碱,羟基吴茱萸胺脱水变成
吴茱萸次碱。因此,炒制吴茱萸时要控制好“火
候”,焦化为炒制成功与否的临界点,这说明前人炮
制经验的合理性。
2 含量测定
2.1 色谱条件 AltimaODSC18色谱柱(46mm×
250mm,5μm);流动相乙腈水四氢呋喃磷酸(51∶
48∶1∶005);柱温25℃;流速08mL·min-1;检测
波长225nm;系统适用性:吴茱萸胺和吴茱萸次碱
理论踏板数均不低于12000。
供试品溶液:取吴茱萸及炮制品样品粉碎,过
40目筛,精密称取05g,置50mL量瓶中,移液管
吸取50mL甲醇置量瓶中,超声提取45min,超声前
后称重补失,静置过夜,吸取上清液少量过045μm
微孔滤膜,弃去初滤液,留取续滤液备用。
2.2 线性考察 精密吸取吴茱萸胺和吴茱萸次碱标
准溶液各2,4,6,8,10μL进样,自动计算峰面积积分
值,以峰面积积分值对进样量进行回归处理,分别得
到回归方程为Y=7427196X+191928,r=09999;
Y=3190769X+164174,r=09999;结果表明吴茱
萸胺在0025~0125μg呈良好的线性关系;吴茱萸
次碱在0036~018μg呈良好的线性关系。
2.3 提取条件考察 文献[1]和2000年版药典均
采用甲醇提取,因此仅对提取时间及溶剂体积进行
考察。
取样品粉碎,过60目筛,精密称取05g,共6
份,置25mL或50mL量瓶中,分别加甲醇至刻度超
声提取15,30,45min。结果在甲醇样品(100∶1)时
超声45min提取较充分。
2.4 精密度试验 取湖南甘草制吴茱萸(批号
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G0409011)样品溶液在1d内重复进样6次,结果吴
茱萸胺峰面积平均值6849808,RSD062%。吴茱
萸次碱峰面积平均值2250835,RSD062%。
2.5 重复性试验 取湖南甘草制吴茱萸(批号
Y0409011)粉末05g,精密称定,平行操作5份,按
样品制备方法处理并测定。以外标一点法计算含
量,吴茱萸胺质量分数平均值为176mg·g-1,RSD
068%。吴茱萸次碱质量分数平均值为122mg·
g-1,RSD059%。
2.6 回收率试验 取湖南甘草制吴茱萸(批号
G0409011)样品粉末025g,5份,分别精密加入吴
茱萸胺和吴茱萸次碱对照品一定量,按样品制备方
法处理并测定,计算回收率,见表5。
表5 甘草制吴茱萸中吴茱萸胺和吴茱萸次碱加样回收率
测定成分
药材中含量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
吴茱萸胺1) 0441 0875 9874
0440 0883 10078
0440 0876 9916 9975 096
0441 0883 10076
0439 0876 9932
吴茱萸次碱2) 0308 0606 9727
0306 0617 10103
0306 0611 9901 10039 222
0307 0623 10274
0306 0620 10189
注:1)加入量均为0440mg,2)加入量均为0308mg
2.7 样品测定 结果见表6。
表6 吴茱萸生品、甘草制品及市售品中2种成分的含量 mg·g-1
品名 (购)产地
生品
吴茱萸胺/mg·g-1 吴茱萸次碱/mg·g-1
批号
制品
吴茱萸胺/mg·g-1 吴茱萸次碱/mg·g-1
吴茱萸 安徽亳州(湖南) 179 125 G0409011 191 117
G0409012 194 124
G0409013 190 118
G0409021 186 129
安徽亳州(江西) 183 124 G0409022 189 119
G0409023 187 120
G0409031 199 119
安徽亳州(浙江) 198 123 G0409032 197 110
G0409033 187 110
G0409034 192 109
吴茱萸 湖南 016 036 016 035
河南郑州 132 115 133 129
扬州(四川泸州) 161 135 097 092
浙江(磐安) 169 132 109 117
陕西咸阳 1515 1083 618 643
广州(广西) 193 123 188 126
北京首创(湖南) 308 169 387 226
贵州遵义 368 285 513 433
石虎 北京卫仁(云南) 192 258 617 733
四川犍为 1528 472 1317 480
2.8 小结 甘草制吴茱萸中次碱含量与生品比较
变化不大,而吴茱萸胺含量比生品增加。中试品随
产地不同但制品中生物碱差异不大;市售品不同产
地的生品和炮制品中次碱和胺的变化无明显规律
性,说明产地和炮制方法都会在很大程度上影响其
质量。四川、云南、陕西市售品中生物碱含量较高,
可能是云贵为其道地产区的缘故。
3 急性毒性研究
3.1 药物 吴茱萸生品(批号 040902,出膏率
214%)、甘 草 制 品 (批 号 G040902,出 膏 率
2243%)。
3.2 动物 ICR小鼠,体重(204±11)g,雌雄各
半。由北京维通利华试验动物技术有限公司提供。
二级饲养,合格证号 SCXK000008,动物饲养于
SPF级的动物室内,温度22~24℃,湿度40~70%,
人工照明,12h明暗周期,6~10次/h。动物的饲料
为军事医学科学院提供的灭菌小鼠颗粒饲料。
3.3 方法 预试验:先选用20~22g体重的小鼠
84只,分21组,雌雄各半,吴茱萸饮片的不同剂量
组分别为雌、雄各2只动物。将动物禁食16h后,
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每个样品均分3个浓度梯度进行毒性预试验,大剂
量均采用50g·kg-1(饮片/体重,下同)、中剂量35
g·kg-1、小剂量245g·kg-1进行1日内1次灌胃
给药预试验。结果表明生品、甘草制品的大剂量组
各有1只雄性的小鼠出现死亡,其他药物的各组动
物均未出现死亡。
最大耐受量测定:根据预试验结果,吴茱萸生品
40g·kg-1b.w,剂量为临床剂量(以60kg人计算)
的533倍。试验前动物禁食16h,自由饮水,将动物
按体重均匀分为 7组,每组 20只,雌、雄各 10只。
各药物均采用1次性灌胃给药,给药后连续观察7
d,观察动物的一般情况、活动、神态、排泄物、饮食情
况,记录动物有无死亡,隔日称1次体重。结果:以
40g·kg-1b.w,各给药组的动物均未见明显的异
常。动物的行为活动、饮食均未见异常,体重于对照
组比较,除生品组的雄性动物的体重明显低于对照
组外,制品组与对照组比较均未见显著性差异。因
药物已配成最大给药浓度,给药体积也为最大,故而
确定吴茱萸饮片对小鼠的最大耐受剂量为40g·
kg-1。
表7 吴茱萸生品及饮片对小鼠最大耐受量
组别
剂量
/g·kg-1
性别 动物数
药前体重
/g
药后体重检测时间/d
3 5 7
对照组 ♂ 10 198±09 241±06 263±06 2917±09
♀ 10 193±08 237±05 258±12 266±14
吴茱萸生品汤剂 40 ♂ 10 198±09 220±111) 228±192) 237±182)
♀ 10 193±08 240±13 247±13 254±13
甘草制吴茱萸汤剂 40 ♂ 10 198±09 213±18 242±08 271±14
♀ 10 193±08 234±11 242±14 252±10
注:与正常对照组比较1)P<005,2)P<001
4 药效学试验研究
吴茱萸具有散寒止痛,降逆止呕,助阳止泄的作
用。临床上主要用于治疗厥阴头痛,寒疝腹痛,行径
腹痛,脘腹胀痛等痛证。根据其主治功能,拟采用热
刺激性疼痛和冰醋酸诱导的小鼠扭体反应模型,试
验比较其镇痛作用。结果表明,给小鼠灌胃给予
06g·kg-1(临床等效剂量)的产品(生品、甘草制
品)后,均可明显延长小鼠的热板痛阈值;明显减少
由冰醋酸诱导的小鼠腹膜刺激性扭体反应次数,对
小鼠扭体反应的潜伏期也有一定延长作用。
4.1 对小鼠热刺激性疼痛的影响 生品和制品配
制为06g·kg-1的浓度(为体表面积临床等效剂
量)。小鼠同3.2。热板仪:HSS-1B数字式超级恒
温水浴槽,成都仪器厂生产。阳性对照药索米痛
01g·kg-1。
将热板温度调节至(55±01)℃,小鼠单只放
入热板测定仪,以放入小鼠后至小鼠出现舔后足动
作之间的时间为痛阈值。痛阈值低于6s者和超过
30s或跳跃者予以淘汰。将筛选后的按痛阈值分入
各组,开始给药。于药后1,2h测定痛阈值。各组
试验数据均已 珋x±s表示。各给药组和阳性对照药
组分别与对照组进行比较,各药物组之间进行比较。
结果用t检验进行统计分析。
结果表明,给小鼠灌胃给予吴茱萸饮片各不同
工艺制品06g·kg-1后2h,与模型对照组比较各
给药组均可明显延长小鼠的热板痛阈值,表明生品
和炮制品对温热刺激诱导的疼痛具有明显的镇痛作
用。结果见表8。
表8 吴茱萸生品及炮制品对小鼠热板痛阈的影响
(珋x±s,n=10)
组别
剂量
(g生药/kg)
痛阈值/s
药后1h 药后2h
对照组 - 206±474 183±620
阳性药 01 283±5662) 238±538
吴茱萸生品 06 242±565 280±11351)
甘草制吴茱萸 06 233±502 257±7951)
注:与模型对照组比较1)P<005,2)P<001
4.2 对冰醋酸诱导的小鼠化学性腹膜刺激性疼痛
的影响 受试药物以及剂量、动物的分组、给药方法
等均同前。
各组动物给药后 1h,给每只小鼠腹腔注射
06%冰醋酸02mL,随后立即观察每只小鼠出现
扭体的潜伏期和15min内的扭体次数。各组试验
数据均已 珋x±s表示。各给药组和阳性对照药组分
别与对照组进行比较,各药物组之间进行平行比较。
结果用t检验进行统计分析。
结果表明,给小鼠灌胃给予生品及甘草制品06
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g·kg-1后1h,与对照组比较,各组均可明显减少由
冰醋酸诱导的小鼠腹膜刺激性扭体反应次数(P<
005),对小鼠出现扭体反应的潜伏期也有一定的延
长作用,但未见显著性差异。表明吴茱萸对化学刺激
性疼痛具有明显的镇痛作用,但生品、制品间比较,未
见显著性差异。结果见表9。
表9 吴茱萸饮片及其各配方颗粒冰醋酸诱导的小鼠
扭体反应的影响(珋x±s,n=10)
组别
剂量
/g·kg-1
扭体潜伏期
/min
扭体次数
对照 - 32820±12770 2050±1181
阳性 01 900±02) 02)
吴茱萸生品 06 41370±22261 1070±6341)
甘草制吴茱萸 06 47890±21567 950±6791)
注:与模型对照组比较1)P<005,2)P<001
5 结论
选择吴茱萸胺和吴茱萸次碱为指标进行了甘草
制吴茱萸的炮制工艺研究,结果表明炮制温度会对
吴茱萸胺的含量造成影响,随着炒制温度的升高,其
含量下降,吴茱萸次碱含量增高。
本草记载吴茱萸生品有小毒,具有温热苦燥辛香
走窜之副作用,《本草通玄》中有“陈久者良”的说法,
经炮制后辛香之气大为减少,口尝口味也有减弱,实
验证明其挥发油总量按生品、醋制品、甘草制品、盐制
品收率依次下降,盐制品仅及生品的一半,据此有人
认为炮制后对降低其用药的临床副作用、减轻毒副作
用发挥了有利的作用[3]。现代应用习惯认为:吴茱萸
经甘草制后能降低毒性和燥性,更好的发挥效用。本
试验确证了生品和甘草制品的毒性较小。
药效学结果表明:吴茱萸生品和甘草制品均有
明显的镇痛作用。
[参考文献]
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吴茱萸胺和吴茱萸次碱的含量[J].药物分析杂志,1997,17
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[2] 陈 奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,
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析[J].中国中药杂志,1994,19(6):341.
Studyofliquoriceprocessingfructus
HONGYumei,WANGWeihao,WANGZhimin,WANGJinhua
(InstituteofChineseMateriaMedicaChina,AcademyofChineseMedicalScience,Beijing100700,China)
[Abstract] Objective:Toestablishtheprocessingmethodoffructusevodiaeanditsstandardforqualitycontrol,toxicityas
pectsandpharmacodynamicswerecariedoutatthesametime.Method:Inthestudiesofprocessingtechniques,theoptimizedtech
nicalparametersweredeterminedbythecontentsofevodiamineandevodine.Andtheacutetoxicityandpharmacodynamicswerestud
iedbyrats.Result:Theprocesswasthattheliquoriceprocessedfructusevodiaewaswetedbyliquoricedecoctionbysixthofrawfruc
tusevodiae(V/W)andfriedbelow230℃.ThemethodofdetectingthecontentsofevodiamineandevodinewasthatAltimaODSC18
(46mm×250mm,5μm);mobilephaseacetonitrilewatertetrahydrofuranphosphoricacid(51∶48∶1∶005);columntemperature
25℃;mobilerate08mL·min-1;wavelength225nm.Thetoxicityexperimentationshowthatratsdidn'tshowanynotablechanges
afterafusedtherawmaterialandtheprocessedfructusevodiae'sdecotion40g·kg-1b.w.atonetimesevendaysconstantly.Thean
algesicefectwasobservedafter06g(material)·kg-1(weight)b.w.Conclusion:Thetoxicityoftherawmaterialandthepro
cessedonewerelowandtheliquoriceprocessedfructusevodiaanalgesicefectwasgood.
[Keywords] liquoriceprocessedfructusevodiae;processingmethod;standardforqualitycontrol;acutetoxicity;pharmaco
dynamics
[责任编辑 鲍 雷]
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