全 文 ：·研究论文·
掌叶大黄悬浮培养细胞和根培养体系对
鬼臼毒素的生物转化研究
崔亚君１，刘晓峰２，韩 健２，王宝荣２，果德安２
（１．上海中医药大学 中药学院，上海 ２０１２０３；２．北京大学 药学院，北京 １０００８３）
［摘要］ 目的：对鬼臼毒素进行生物转化研究。方法：利用已经建立的掌叶大黄细胞悬浮体系、根培养体系进
行转化，色谱法分离化合物，波谱法鉴定转化产物的结构。结果：细胞悬浮体系使７３８％的鬼臼毒素发生了转化，
根培养体系使５６３％的鬼臼毒素发生了转化。２种体系对鬼臼毒素的转化产物不同，前者转化生成鬼臼苦素，后
者主要转化形成表鬼臼毒素和脱水鬼臼毒素。结论：鬼臼毒素对掌叶大黄细胞悬浮系统和根培养系统的 ｐＨ无明
显影响；２种掌叶大黄组织培养体系均能转化鬼臼毒素。
［关键词］ 鬼臼毒素；鬼臼苦素；表鬼臼毒素；生物转化；掌叶大黄
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０９０９８９０３
［收稿日期］ ２００６１１１４
［通讯作者］ 果德安，Ｔｅｌ／Ｆａｘ：（０１０）８２８０２７００，Ｅｍａｉｌ：ｇｄａ＠
ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
鬼臼毒素（ｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ）具有抗癌活性，但由
于其毒性大，限制了临床的直接应用［１］。多年以来，
为获得高活性、低毒的鬼臼衍生物，科研工作者对鬼
臼类木脂素的结构改造作了大量工作。除化学方法
外，生物转化方法也被用来研究这类化合物的结构改
造［２４］。本实验利用已经建立的掌叶大黄细胞悬浮体
系、根培养体系对鬼臼毒素进行了生物转化研究，以
确定其转化情况及其相关转化产物，为鬼臼毒素类化
合物的结构修饰探索新途径，同时对掌叶大黄不同
培养体系的生物转化能力和特点进行比较研究，为寻
找可用于生物转化的酶系统作基础性探索。
１ 材料和方法
１．１ 鬼臼毒素
鬼臼毒素从鬼臼中分离得到，经液相色谱检测，
纯度＞９８％，１ＨＮＭＲ和ＭＳ与文献［５］同。
１．２ 掌叶大黄细胞悬浮体系、根培养体系和单克隆
发状根的预培养
１．２．１ 掌叶大黄细胞悬浮体系 取掌叶大黄无菌
苗下胚轴、子叶和真叶作为外植体，在无菌条件下接
种于ＭＳ琼脂培养基（含 ０５ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ＋０５
ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ＋０５ｍｇ·Ｌ－１２，４Ｄ）诱导愈伤组织。
培养条件：ｐＨ５８，光照培养箱温度（２５±１）℃，日
光灯光照１２ｈ·ｄ－１，２０ｄ后愈伤组织形成。用同样
培养基每２０ｄ继代１次。连续继代５次后转入 ＭＳ
液体培养基中振荡培养，培养温度２５℃，摇床速度
为８０ｒ·ｍｉｎ－１。第１次接种２０ｇ松软愈伤组织于
３０ｍＬ培养基中，每２０～２５ｄ继代１次。第１次继
代培养基为５０ｍＬ，第２次继代于１００ｍＬ培养基中
培养５ｄ后即可用于生物转化的研究。
１．２．２ 掌叶大黄根培养系统 切取光照培养箱中
生长的掌叶大黄无菌苗的根须０５ｇ继代于５ｍＬ
的１／２ＷＰ（含０１ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ＋０１ｍｇ·Ｌ－１６
ＢＡ＋０１ｍｇ·Ｌ－１２，４Ｄ，无机盐浓度为正常值一
半）培养基中，ｐＨ５８，经４次继代后，第５次继代于
１００ｍＬ同样的培养基中，用于生物转化的研究。
１．３ 鬼臼毒素的生物转化和转化产物的分离
１．３．１ 鬼臼毒素的生物转化 称取鬼臼毒素 １０
ｍｇ溶于０５ｍＬ无水乙醇中，使其完全溶解。经膜
过滤除菌后，在无菌条件下加入到不同的掌叶大黄
培养体系中进行生物转化。其中，掌叶大黄根培养
体系中根的鲜重约２０ｇ，培养于２５０ｍＬ三角瓶中的
１００ｍＬ培养基中。掌叶大黄细胞悬浮系统中细胞
鲜重３０ｇ，培养基同样是１００ｍＬ。以未加入活性化
合物的相同培养体系作为空白。
１．３．２ 转化系统 ｐＨ的测定 大黄根培养系统经
１４ｄ后收获培养基，细胞悬浮系统２０ｄ后收获，收
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获后的培养基先测定ｐＨ。
１．３．３ 转化产物的分离 收获后的培养基用醋酸
乙酯萃取，５０℃减压浓缩，用 ＨＰＬＣ检验加入体系
中的底物的变化情况。对应的空白培养体系的培养
基同时收获，并加入同样量的鬼臼毒素后随收获的
转化培养基一同处理，作空白对照。将醋酸乙酯提
取物经色谱分离，用醋酸乙酯洗脱，以去除醋酸乙酯
难以溶解部分。洗脱液浓缩后用于液相色谱分析和
制备。色谱条件：ＳｐｅｔｒａＳｅｒｉｅｓＰ１００高效液相色谱
仪，ＳｐｅｃｔｒａＳｅｒｉｅｓＵＶ１００紫外检测器，检测波长２５４
ｎｍ，ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘｐｒｏｄｉｇｙＯＤＳ（３）１００Ａ（４６ｍｍ×２５０
ｍｍ，５μｍ）色谱柱，６０％甲醇水作流动相。
２ 结果分析
２．１ 细胞悬浮体系和根培养体系的ｐＨ
转化前２种培养基的 ｐＨ都为５８。细胞悬浮
体系经２０ｄ后ｐＨ变为５１，空白的培养基ｐＨ５２，
根培养体系１４ｄ后ｐＨ５４，空白同样为５４。这说
明加入鬼臼毒素对体系的ｐＨ无明显影响。
２．２ 细胞悬浮体系和根培养体系转化现象的液相
色谱检测
２种培养体系液相色谱检测发现，在大黄细胞
悬浮体系中，与空白对照比较，经２０ｄ培养，鬼臼毒
素色谱峰（ｔＲ ＝７６１７ｍｉｎ）明显减小，在保留时间
６４ｍｉｎ处出现１个新峰。而在根培养体系中，鬼臼
毒素色谱峰减小，在 ６３８３，９０８３，９５５０，１０１５０，
１１３６７，１１９８３，１３２５０，１４４３３，１６０８３ｍｉｎ处共出
现了９个较明显的新色谱峰。可初步说明鬼臼毒素
在这２个体系中发生了转化，并且２个体系对鬼臼
毒素的转化有明显差异。
根据色谱定量分析结果，在本实验条件下，细胞
悬浮体系使７３８％的鬼臼毒素发生了转化，根培养
体系中使５６３％的鬼臼毒素发生了转化。
２．３ 转化产物的鉴定
利用ＨＰＬＣ从细胞悬浮体系中分离得到１个转
化产物（１）。从根培养体系中分离得到２个转化产
物（２，３）（图１）。
化合物１ 白色粉末（甲醇）。ＥＩＭＳｍ／ｚ４１４
［Ｍ］＋。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ：２７４（１Ｈ，ｍ，
３Ｈ），３２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５０，１００Ｈｚ，２Ｈ），３８２
（６Ｈ，ｓ，３′，５′ＯＭｅ），３８６（３Ｈ，ｓ，４′ＯＭｅ），４１１
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５０Ｈｚ，１Ｈ），４４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６５，１００
Ｈｚ，１１βＨ），４５２（２Ｈ，ｍ，４Ｈ，１１αＨ），５９６（２Ｈ，ｄ，
Ｊ＝１１０Ｈｚ，ＯＣＨ２Ｏ），６３８（１Ｈ，ｓ，８Ｈ），６４５
（１Ｈ，ｓ，２′，６′Ｈ），７０４（１Ｈ，ｓ，５Ｈ）。以上数据与文
献［５，６］鬼臼苦素的数据一致。
图１ 鬼臼毒素及其转化产物的化学结构式
化合物２ 无色粉末（甲醇）。ＥＩＭＳｍ／ｚ４１４
［Ｍ］＋。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）δ：２８６（１Ｈ，ｍ，
３Ｈ），３３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１５，１Ｈ），３６９６（６Ｈ，ｓ，３′，
５′ＯＭｅ），３７０（３Ｈ，ｓ，４′ＯＭｅ），４３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
８０，８５Ｈｚ，１１βＨ），４３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８０，８５Ｈｚ，
１１αＨ），４６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５２Ｈｚ，Ｈ１），４８３（１Ｈ，
Ｊ＝３５Ｈｚ，Ｈ４），５９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３０ Ｈｚ，
ＯＣＨ２Ｏ），６３３（２Ｈ，ｓ，２′Ｈ，６′Ｈ），６４９（１Ｈ，ｓ，８
Ｈ），６９２（１Ｈ，ｓ，５Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）
δ：４０１９（３Ｃ），４１７５（２Ｃ），４５１９（１Ｃ），５６５１
（３′，５′ＯＭｅ），６１０４（４′ＯＭｅ），６７１１（４Ｃ），６９４５
（１１Ｃ），１０２７８（ＯＣＨ２Ｏ），１０９４１（２′，６′Ｃ），
１０９４１（５Ｃ），１１０７７（８Ｃ），１３３０１（９Ｃ），１３３０１
（１０Ｃ），１３３９５（１′Ｃ），１３７４０（４′Ｃ），１４８６５（７
Ｃ），１４９６（６Ｃ），１５３７７（３′，５′Ｃ），１７７６７（１３Ｃ）。
上述数据与文献［７］报道的表鬼臼毒素一致。
化合物３ 无色粉末（甲醇）。ＥＩＭＳｍ／ｚ３９６
［Ｍ］＋。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）δ：３７０（３Ｈ，ｓ，
４′ＯＭｅ），３７５（３Ｈ，ｓ，３′，５′ＯＭｅ），５８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝
１１Ｈｚ，ＯＣＨ２），６４４（２Ｈ，ｓ，２′，６′Ｈ），６６１（１Ｈ，ｓ，
８Ｈ），６７８（１Ｈ，ｓ，５Ｈ）。质谱给出分子离子峰３９６
［Ｍ］＋为基峰，在一系列的碎片离子中，缺乏与内酯
环裂解有关的离子峰，而脱羟基及取代苯基的相关
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碎片离子依然存在，与鬼臼毒素的质谱比较，分子离
子峰少了１８个质量数，表明该化合物有可能是鬼臼
毒素脱水形成的。同时，氢谱的数据显示，母环中的
取代苯基的氢信号及５，８二位的氢信号、３个甲氧
基信号基本不变，但４，３位的氢消失，由此推断该化
合物为脱水鬼臼毒素［８］。
３ 结论与讨论
加入鬼臼毒素对掌叶大黄细胞悬浮体系和根培
养体系的ｐＨ无明显影响，２种掌叶大黄组培体系均
能转化鬼臼毒素。在本实验条件下，细胞悬浮体系
使７３８％的鬼臼毒素发生了转化，根培养体系使
５６３％的鬼臼毒素发生了转化。２种体系对鬼臼毒
素的转化产物不同。前者转化生成鬼臼苦素，后者
主要转化生成表鬼臼毒素和脱水鬼臼毒素。
细胞悬浮体系与根培养体系对鬼臼毒素的转化
存在差异的原因可能是悬浮细胞与根所处的分化状
态不同，它们的生理状态也不同；也就是说它们的相
关基因是否表达及表达活性强弱不同，因此２个系统
中相关酶的种类及数量的多少存在着差异，所以对同
一底物的识别及所起的作用不同。细胞悬浮体系是
高度脱分化体系，系统中酶的种类和数量要低于器官
水平的根培养体系，因此，导致掌叶大黄根培养体系
对鬼臼毒素的转化产物比细胞培养体系复杂。
本实验在根培养转化体系中仅分离得到２个转
化产物，而其他几个在ＴＬＣ上显示的转化产物由于
量微而未分离得到，今后将进一步放大培养分离并
鉴定这些转化产物。
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Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎｂｙｃｅｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ
ｒｏｏｔｃｕｌｔｕｒｅｏｆＲｈｅｕｍｐａｌｍａｔｕｍ
ＣＵＩＹａｊｕｎ１，ＬＩＵＸｉａｏｆｅｎｇ２，ＨＡＮＪｉａｎ２，ＷＡＮＧＢａｏｒｏｎｇ２，ＧＵＯＤｅａｎ２
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎｂｙｔｈｅｃｅｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｒｏｏｔｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｓ
ｏｆＲｈｅｕｍｐａｌｍａｔｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＵｓｉｎｇｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＨＰＬＣｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｔｏｉｓｏｌａｔｅｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｗｅｒｅｅｌｕ
ｃｉｄａｔｅｄｂｙｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃｍｅａｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＣｅｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆＲ．ｐａｌｍａｔｕｍｃｏｕｌｄｃｏｎｖｅｒｔｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎｔｏｐｒｏｄｕｃｅｐｉｃｒｏｐｏｄｏ
ｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎｗｉｔｈｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆ７３．８％，ｗｈｉｌｅｒｏｏｔｃｕｌｔｕｒｅｏｆＲ．ｐａｌｍａｔｕｍｃｏｕｌｄｃｏｎｖｅｒｔｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎｔｏｐｒｏｄｕｃｅｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ
ａｎｄａｐｏｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＰｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎｄｉｄｎｏｔａｆｅｃｔｔｈｅｐＨｖａｌｕｅｏｆｔｈｅｍｅｄｉａｕｓｅｄｉｎｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｂｏｔｈｃｅｌｓｕｓ
ｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｒｏｏｔｃｕｌｔｕｒｅｏｆＲ．ｐａｌｍａｔｕｍｃａｎｃｏｎｖｅｒｔｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ；ｐｉｃｒｏｐｏｄｏｐｈｙｌｉｎ；ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｉｎ；ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｒｈｅｕｍｐａｌｍａｔｕｍ
［责任编辑 张宁宁］
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