全 文 ：¦∏·¨∏±ª¬±∏µ¼ ¤±§°²µ·¤¯¬·¼ ¤µ¨ «¨ µ¤¯§¨ §¥¼ ± ∏¨·µ²³«¬¯ ¶¨ ∏´¨ ¶2
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≈z 李传云 o李澎涛 o潘彦舒 o等 q胆酸与栀子配伍拮抗大鼠局灶性
脑缺血再灌注损伤中的作用环节分析 ≈ q中华中西医杂志 o
ussvowkxl}ywvq
≈{ 蒋玉凤 o张丹卉 o黄启福 o等 q清开灵对内毒素性发热家兔的解
热机制研究 ≈ q北京中医药大学学报 oussvouykxl}xvq
Α στυδψ οφ µ εχηανισµ ανδ εφφεχτιϖε ινγρεδιεντσ οφΘινγκαιλινγ φορ
ΠΦΙΒ ινηαλατιον ινδυχεδ πυλµ οναρψ εδεµ α
׬¤±2«²±ªt o ≥ «¬2«∏¤u o ∏¤±v o ÷ ¬±u o ⁄ ¬2ª¤²t o ¬±2¬¬∏t
(t. Ινστιτυτε οφ Πηαρµ αχολογψ ανδ Τοξιχολογψ, Αχαδεµ ψ οφΜιλιταρψΜεδιχαλΣχιενχεσ, Βειϕινγ tss{xs, Χηινα;
u. Ζηεϕιανγ ϑυηυα Ηοσπιταλ, ϑυζηου vuwssw, Χηινα;
v. Ψανται Γοϖερνµ ενταλΗοσπιταλ, Ψανται uywsss, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ∏±√ ¬¨¯·«¨ ©¨©¨¦·¬√¨¬±ªµ¨§¬¨±·¶¤±§° ¦¨«¤±¬¶°¶²©±¬±ª®¤¬¯¬±ª¬±¨¦·¬²± ²± ·«¨ ·µ¨¤·° ±¨·²©³∏¯°²±¤2
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[ Κεψ ωορδσ] ³∏¯°²±¤µ¼ §¨¨ °¤~ ±¬±ª®¤¬¯¬±ª~ ¦«²¯¬¦¤¦¬§~ ¶∏µ©¤¦·¤±·
≈责任编辑 古云侠
≈收稿日期 ussy2sv2uu
≈基金项目 国家 {yv计划 kussvuvwzl
≈通讯作者 3 王广基 oר¯}ksuxl{vuztxwwo∞2°¤¬¯}ªº¤±ª ¦³∏q §¨∏q¦±
≤2 ≥法测定槐果碱及其在 ≤¤¦²2u
细胞上的转运特征
王素军 t o王广基 u3 o李晓天 u o阮金秀 t o张振清 t
ktq军事医学科学院 毒物药物研究所 药物代谢重点实验室 o北京 tss{xs~
uq中国药科大学 药物代谢研究中心 o江苏 南京 utssv{l
≈摘要 目的 }建立槐果碱的 ≤ 2 ≥测定法 o研究其在 ≤¤¦²2u细胞上的转运特征 ∀方法 }采用 ²µ¥¤¬ ∞¬·¨±§2
≤t{柱 o流动相 ts °°²¯# pt醋酸铵水溶液 2乙腈 k{xΒtxlo流速 s1u °# °¬±pt ∀电喷雾离子化 k∞≥l方式 o采用选
择性离子检测法 o检测离子为正离子 o槐果碱的选择性离子为 ≈µ / ζ n n uwz1v~考察了温度 !药物浓度 !时间对槐
果碱在 ≤¤¦²2u细胞上转运的影响 ∀结果 }槐果碱在 x ∗ u sss Λª# pt呈良好的线性关系 kρ s1||{ xlo最低定量限
为 x Λª# pt ~槐果碱在 ¬¯¯¬¦¨¯¯系统上的转运量具有一定的浓度 2时间依赖性 o其转运表现为被动扩散 o槐果碱的
平均表观通透系数 Π¤³³为 v1tx| ≅ tspx ¦°# ¶pt ∀结论 }该法灵敏 !简单 o专属性强 o槐果碱在 ≤¤¦²2u细胞上具有良
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第 vu卷第 t期
ussz年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ t
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好的转运 ∀
≈关键词 槐果碱 ~≤ 2 ≥~≤¤¦²2u细胞 ~转运
≈中图分类号 u{xqx ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukusszlst2ssxz2sv
槐果碱 k¶²³«²¦¤µ³¬± o¨≥≤l是从豆科植物苦豆草
的种子苦豆子或豆科植物苦参的根中提取的一种苦
参型生物碱 o基础药理与临床研究表明有较好的抗
癌 !平喘 !抗病毒 !抗心律失常等作用 ≈tou o具有广阔
的开发前景 ∀在前期试验中 o作者采用 ≤ 2 ≥法研
究了苦参型生物碱中的氧化苦参碱和苦参碱 ≈vow o
为了对此类化合物作系统深入的研究和对槐果碱作
进一步的开发 o首次采用 ≤ 2 ≥法对槐果碱在
≤¤¦²2u细胞上的转运特性进行了研究 ∀
1 材料
1q1 药品与试剂
槐果碱和内标苦参碱 k中国药品生物制品检定
所 l~乙腈 k色谱纯 oƒ¬¶«¨ µl~⁄ ∞ 培养基 k美国
¬¥¬¦²公司 l~胎牛血清 k¼¦¯²± l¨~非必需氨基酸
k¼¦¯²± l¨~Λ2谷氨酰胺 k≥¬ª°¤公司 l~胰蛋白酶
k≥¬ª°¤公司 l~水为 ¬¯¯¬2±超纯水 o其他试剂均为
分析纯 ∀
1q2 主要仪器
细胞培养箱 k ¤¨µ²∏¶o德国 l~≥÷ p ws扫描电子
显微镜 k日立 o日本 l~高效液相色谱 p质谱联用仪
k岛津 o日本 l~uw孔培养板 k≤²¶·¤µo美国 l~ ¬¯¯¬p ±
µ¤§¬¨±·ts超纯水器 k ¬¯¯¬³²µ¨ ±¦q美国 l~≥2
°∞ × ut高速冷冻离心机 k≥²µ√¤¬¯公司 o美国 l~
∞∂ 皮肤伏特计 k美国 • °公司 l~ ¬¯¯¬¦¨¯¯转运
系统 k美国 ¬¯¯¬³²µ¨公司 l∀
2 方法
2q1 细胞培养的条件及方法
≤¤¦²2u细胞株 k §qlo传代数在 ws代之内 ∀
将细胞接种于培养瓶 o培养液为 ⁄ ∞ 高糖 kw1x
ª# pt l 培养基 o培养基中含 tsh胎牛血清 ! th
非必需氨基酸 ! th Λ2谷氨酰胺以及青霉素 2链霉素
双抗液 o置于 xh ≤u o vz ε 培养箱 ∀细胞按 y万
个 r¦°u接种于 uw孔培养板 o以后每 u天换培养液
t次 o t周后每天换液 o并在接种后的 uo wo {o
tuo ty和 ut §测定其电阻值 k×∞∞ l∀以跨膜电
阻作为细胞融合的指标 o发现接种后 x ∗ y §细胞
融合 o融合后的细胞会自发呈上皮样分化 o形成分
化良好的微绒毛及连接复合体 o约第 ut天分化完
全 o并且电阻值达到坪台 k xys 8 # ¦°u lo开始
通透实验 ∀
2q2 药物转运试验
试验前以 vz ε ¤±®¶液浸泡接种有细胞的
¬¯¯¬¦¨¯¯ vs °¬±o轻微冲洗 ¬¯¯¬¦¨¯¯o除去细胞表面的
附着物 ∀腔面到基底面的通透性 }在顶侧 k°l加入
含药的 ¤±®¶液 s1w °k³ y1xlo底侧 k
l加入
空白 ¤±®¶液 k³ z1wls1y °∀置 vz ε o以 xs µ#
°¬±pt振摇 o并分别于 txovsoyso|sotus °¬±于下层
采样 tss Λo并补充同体积空白 ¤±®¶液 ∀每个浓
度重复 v个孔 o取出的样品 k高浓度样品稀释一定
比例后 l精密加入 u sss Λª# pt内标溶液 ts Λo
混匀 o高速离心 o取 x Λ进样测定 ∀基底面到腔面
的通透性则将药物加入底侧 k
lo顶侧 k°l加入
空白的 ¤±®¶液 o以下步骤同腔面到基底面的通透
性试验操作 ∀
药物的表观通透系数 kΠ¤³³l的大小反映了药物
透过单层细胞的能力以及药物吸收的速度 !程度 ∀
它可由下式计算 }
Παππ ∃Θ∃τ# Α# Χs
其中 o∃Θ为药物在 ∃τ时间段内透过的量 oΑ为
细胞表面积 o在本模型中即为支持膜的面积 ks1y
¦°u loΧs为初始浓度 ∀ Π¤³³的单位常用 ¦° # «pt或
¦°# ¶pt表示 ∀
2q3 ≤ 2 ≥分析
2q3q1 液相色谱条件 色谱柱 }²µ¥¤¬ ∞¬·¨±§2≤t{
柱 ou1t °° ≅ xs °°ox Λ°~保护柱 }²µ¥¤¬ ∞¬·¨±§2
≤t{柱 ou1t °° ≅ tu1x °°ox Λ° kª¬¯¨ ±·× ¦¨«±²¯²2
ª¬¨¶o≥lo柱温 ws ε o流动相 ts °°²¯# pt醋酸铵
水溶液 2乙腈 k{xΒtxlo流速 s1u °# °¬±pt ∀
2q3q2 质谱检测参数和电喷雾参数 采用电喷雾
离子化 k∞≥l方式 o槐果碱和内标苦参碱 ≥ 的离
子是 ≈ n n o分别为 uwz1v和 uw|1u∀雾化气流
速 t1x # °¬±pt o反吹气流速 u1s # °¬±pt ~曲形脱
溶剂装置 k≤⁄l温度 uxs ε ~探针 k°µ²¥¨ l电压 w1x
®∂ ~检测电压 t1ws ®∂ ∀
2q4 统计学处理
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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数据用 cξ ? σ表示 o数据统计采用双侧 τ检验 ∀
3 结果
3q1 单细胞层完整性的验证
3q1q1 测量单细胞层的电阻值 k×∞∞ l 在 t周
后细胞单层 ×∞∞ 值达到约 yss 8 # ¦°u kz ∗ { §lo
而后电阻值趋于稳定 out §细胞达到融合 o形成紧
密单层 ∀
3q1q2 tw ≤ 2甘露醇通透量实验 将 tw ≤ 2甘露醇 ks1x
Λ≤¬l溶液按上述 2q2项下操作和计算其 Π¤³³o液闪
法测定转运 v «后 ≤¤¦²2u单层细胞基底侧的 tw ≤ 2甘
露醇浓度 o其腔面到基底面的 Π¤³³值为 k{1wy ≅
tspz l¦°# ¶pt o在 v «内其通透量为 t1uh out §后
细胞已形成紧密单层 ∀
3q1q3 碱性磷酸酶活性测定 分别用碱性磷酸酶
试剂盒以及碱性磷酸酶活力试剂盒对 ≤¤¦²2u单层
细胞的碱性磷酸酶进行了染色以及活力考察 ∀胞浆
内弥漫性红色颗粒即为碱性磷酸酶 o按照 vz ε 时碱
性磷酸酶与基质作用 tx °¬±产生 t °ª酚为 t个金
氏单位 ∀测得结果为 °侧碱性磷酸酶活力 }
kt1uvu ? s1v|yl金氏 ~
侧碱性磷酸酶活力 }
ks1s|{ ? s1ssvl金氏 out §后碱性磷酸酶绝大部分
已经定位于 °侧 k刷状缘一侧 l∀
3q2 方法学研究
3q2q1 色谱行为 在上述试验条件下槐果碱 o苦参
碱的检测灵敏度高 o保留时间 τ分别为 x1tov1z
°¬±o且溶液中无杂质峰干扰样品的测定 ∀
3q2q2 标准曲线 取 ¤±®¶溶液 s1t °o精密加
入不同量的标准品槐果碱 o u sss Λª# pt内标溶
液 ts Λo使样品分别为 xo tso xso tsso usso
xsso t ssso u sss Λª# pt o取 x Λ进样 o ≤ 2
≥分析 o ≥≤在 x ∗ u sss Λª# pt线性关系良好 o
标准曲线方程为 } Ψ s1ssw tΞ n s1stv w kρ
s1||| zl∀
3q2q3 精密度试验 ≥≤在 tsotssot sss Λª# pt
v种水平下 o日内变异和 x日内的日间变异均小于
txh o符合生物样本的测定要求 ∀
3q3 ≥≤从腔面到基底面的通透性 k°ψ
l
≥≤在不同浓度下从腔面到基底面的通透性见表
tou∀ ≥≤在不同浓度 kt1s ≅ tspx ot1s ≅ tspv °²¯ #
pt l下从腔面到基底面的通透量均随着浓度增高而
增大 o求得的表观通透系数 kΠ¤³³l分别为 kv1vw| ?
s1uv{lokv1s|z ? s1uvslokv1svu ? s1tu{l¦° # ¶pt ∀
经双侧 τ检验分析 ov个浓度的 Π¤³³无显著性差异 o故
在以下实验中均选用一个中间浓度 kt1s ≅ tspw °²¯#
pt lo同时也表明 ≥≤在 ≤¤¦²2u单层细胞上转运机制
为被动扩散 ∀ v个浓度 kt1s ≅ tspx ∗ t1s ≅ tspv °²¯
# pt l的 Π¤³³无显著性差异 o≥≤的平均表观通透系
数为 v1tx| ≅ tspx ¦°# ¶pt ∀
表 t 不同浓度的槐果碱于不同时间从腔面到基底面的通透量 kcξ ? σ, ν vl Λª
浓度 r°²¯# pt tx °¬± vs °¬± ys °¬± |s °¬± tus °¬±
t1s ≅ tspx s1szt ? s1ssz s1tty ? s1sus s1t|| ? s1ssv s1u|{ ? s1stz s1v{u ? s1sty
t1s ≅ tspw s1zz{ ? s1stz t1t{u ? s1s{w t1|{| ? s1szt v1sty ? s1uwx v1x{t ? s1v|u
t1s ≅ tspv ts1uuy ? s1wss ty1tz| ? s1{zw uv1uvt ? u1x{{ vt1|xv ? s1z{{ v{1|zz ? u1yux
表 u 不同浓度的槐果碱从腔面到基底面
的表观通透系数 kcξ ? σ, ν vl
浓度 r°²¯# pt Π¤³³ r≅ tspx ¦°# ¶pt
t1s ≅ tspx v1vw| ? s1uv{
t1s ≅ tspw v1s|z ? s1uvs
t1s ≅ tspv v1svu ? s1tu{
3q4 ≥≤从基底面到腔面的通透性 k
ψ °l
≥≤在 t1s ≅ tspw °²¯ # pt浓度下从基底面到
腔面的通透性 ∀ ≥≤在不同浓度下从基底面到腔面
的通透性为 kv1vw| ? s1u{ul ≅ tspx ¦° # ¶pt o与同
浓度下从腔面到基底面的表观通透常数比较 o≥≤从
基底面到腔面转运增多 o但经双侧 τ检验分析 o无显
著性差异 o表明从基底面到腔面的通透性与从腔面
到基底面通透性无明显差别 ∀
3q5 温度 kw ε l对 ≥≤转运速率的影响
≥≤在 w ε 时从腔面到基底面通透性 o≥≤从腔
面到基底面的通透性为 ku1{ww ? s1uwzl ≅ tspx ¦°
# ¶pt o与 vz ε 时腔面到基底面的通透性相比 oΠ¤³³
略小 o但经统计分析无显著性差异 o表明温度对该化
合物转运影响并不明显 ∀
4 讨论
过去文献报道的槐果碱分析测定方法主要是高
效液相色谱法 ≈x2z o但其最低检测含量为 tss Λª#
pt o无法用于槐果碱细胞转运特性的研究 ∀本研究
首次采用 ≤ 2∞≥2 ≥联用技术研究了槐果碱在
≤¤¦²2u细胞上的转运特性 o最低定量限达 x Λª#
pt o同时该检测方法也可用于大鼠和犬体内槐果碱
#|x#
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药动学的测定 ∀
≥≤的通透量随着浓度增大而增大 o不同浓度的
通透性 kΠ¤³³l比较接近 o经 τ检验分析 o不同浓度的
通透性无显著性差异 o而且药物从基底面到腔面的
通透性与从腔面到基底面通透性无明显差别 o表观
通透系数不受温度的明显影响 o表明 ≥≤的转运表
现为被动扩散 o与作者早期研究的其同系化合物氧
化苦参碱的吸收特征相似 ≈{ ∀
µ·∏µ¶¶²± °等 ≈| 用 ≤¤¦²2u细胞模型研究了 us
种不同结构的药物的被动扩散机制 o发现通透系数
值的大小在 x ≅ tsp{ ∗ x ≅ tspx ¦°# ¶pt ∀吸收良好
的药物表观通透系数 tspy ¦°# ¶pt ~吸收在 th ∗
tssh的药物的表观通透系数在 s1t ∗ t ≅ tspy ¦°#
¶pt ~而吸收差的药物 k即吸收 th l的 Π¤³³ tspz
¦°# ¶pt ∀ ≥≤的 Π¤³³明显大于 tspy ¦°# ¶pt o按此推
算 o该药吸收良好 o可以开发成口服制剂 o值得进行
深入研究 ∀
≈致谢 中国药科大学吴晓兰和孙建国指导细胞培养 ∀
≈参考文献
≈t 李雪梅 o李兰珍 o陈绍励 o等 q槐果碱对动物肿瘤的抑制作用
≈ q中国药理学报 ot|{woxkul}tuxq
≈u 陈曙霞 q苦参生物碱的药理研究进展 ≈ q中成药 oussvoux
ktl}zxq
≈v 王素军 o王广基 o李晓天 o等 q≤ 2 ≥法研究血浆中氧化苦参碱
及其代谢物在犬体内的药代学 ≈ q中国中药杂志 oussxovs
kul}tvvq
≈w • ¤±ª≥ o • ¤±ª o ¬÷ ×o ·¨¤¯q ⁄ ·¨¨µ°¬±¤·¬²± ²©°¤·µ¬±¨¬±
¥¨ ¤ª¯¨§²ª³¯¤¶°¤¥¼ ¬¯´∏¬§¦«µ²°¤·²ªµ¤³«¼ ¨¯ ¦¨·µ²¶³µ¤¼ ¬²±¬½¤·¬²±
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≈ q ≤ ¬¯± °«¤µ°¤¦² ∞¬³ ׫¨ µ¶¬¤o ussxouktl}ywq
≈x 李培凡 o王 智 o沈 彬 o等 q反相高效液相色谱同时测定苦参
碱 !氧化苦参碱 !槐果碱和槐胺碱的含量 ≈ q时珍国医国药 o
usswotxkul}zyq
≈y 李 凯 o王银兰 o朱会琴 q °≤法测定苦豆子总碱中 v种生物
碱的含量 ≈ q西北药学杂志 ousswot|kul}xvq
≈z 徐 瑾 o陈曙霞 o周贤飙 o等 q高效液相色谱法对大鼠体内槐果
碱的药代分析 ≈ q上海第二医科大学学报 ousswouwkzl}xw|q
≈{ 王素军 o王广基 o李晓天 o等 q氧化苦参碱大鼠肠道吸收机理及
吸收部位的研究 ≈ q中国临床药理学与治疗学 oussxots
ktul}tvuyq
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u. Κεψ Λαβ οφ ∆ρυγ Μεταβολισµ ανδ Πηαρµ αχοκινετιχσ, Χηινα Πηαρµ αχευτιχαλΥνιϖερσιτψ, Νανϕινγ utssv{, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¶¨·¤¥¯¬¶«≤ 2 ≥ ° ·¨«²§©²µ§¨ ·¨µ°¬±¤·¬²± ²©¶²³«²¦¤µ³¬±¨k≥≤l ¤±§¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨¬·¶·µ¤±¶³²µ·¬± °¬¯2
¬¯¦¨ ¯¯ ¶¼¶·¨°q Μετηοδ : ≥ ³¨¤µ¤·¬²± ²©≥≤ º¤¶¦¤µµ¬¨§²∏·¥¼ ¤± ¬¨·¨±§2≤t{ ¦²¯∏°± kuqt °° ≅ xs °°o x Λ°o ¤ª¬¯¨ ±··¨¦«±²¯²ª¬¨¶o
≥lq ׫¨ °²¥¬¯¨ ³«¤¶¨ º¤¶¤¦¨·²±¬·µ¬¯¨ 2º¤·¨µ¦²±·¤¬±¬±ªts °°²¯ # pt ¤°°²±¬∏° ¤¦¨·¤·¨ ktxΒ{xl ¤··«¨ ©¯²º µ¤·¨ ²©s1u °#
°¬±pt q ׫¨ ∞≥¬²± ¶²∏µ¦¨ º¤¶¶¨·¬± ·«¨ ³²¶¬·¬√¨¬²± ³²¯¤µ¬·¼ °²§¨ ©²µ¤¦´∏¬µ¬±ª¤¯¯°¤¶¶¶³¨ ¦·µ²° ·¨µ¼ §¤·¤q ׫¨ ¶¨¯¨ ¦·¬√¨¬²± °²±¬·²2
µ¬±ªk≥ l º¤¶∏¶¨§o ¤±§³µ²·²±¤·¨§°²¯ ¦¨∏¯ ¶¨≈ n n º µ¨¨ §¨ ·¨¦·¨§¤·µ / ζuwz1v ©²µ≥≤q ׫¬¶≤ 2 ≥ ° ·¨«²§º¤¶¤³³¯¬¨§·²§¨ 2
·¨µ°¬±¨≥≤ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ¬± °¬¯¯¬¦¨¯¯ ¶¼¶·¨°q Ρ εσυλτ: ׫¨ ¬¯± ¤¨µ¬·¼ ²©≥≤ µ¤±ª¨ §©µ²° x ·²u sss Λª# pt kρ s1||{ xlq ׫¨ ∏´¤±·¬©¬2
¦¤·¬²± ¬¯°¬·²©≥≤ º¤¶x Λª# pt q ≥≤ ·µ¤±¶³²µ·¬± ≤¤¦²2u ¦¨ ¯¯¶º¤¶·¬°¨¤±§¦²±¦¨±·µ¤·¬²± §¨ ³¨ ±§¨ ±·o ¤±§≥≤ ·µ¤±¶³²µ·¦²°³¯¬¨§º¬·«
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«¬ª«¯¼ ¶¨±¶¬·¬√¨¤±§¶³¨ ¦¬©¬¦ ±¨²∏ª«©²µ§¨ ·¨µ°¬±¬±ª¦²±¦¨±·µ¤·¬²±¶²©≥≤ ¬± °¬¯¯¬¦¨¯¯ ¶¼¶·¨°o ¤±§≥≤ ¶«²º §¨ª²²§·µ¤±¶³²µ·¬± °¬¯¯¬¦¨¯¯
¶¼¶·¨°q
[ Κεψ ωορδσ] ¶²³«²¦¤µ³¬± ~¨ ¬¯´∏¬§¦«µ²°¤·²ªµ¤³«¼2°¤¶¶¶³¨ ¦·µ²° ·¨µ¼~ ≤¤¦²2u ¦¨ ¯¯¶~ ·µ¤±¶³²µ·
≈责任编辑 古云侠
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第 vu卷第 t期
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