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HPLC fingerprint of total flavonoids of Folium Apocyni VenetiHAO Xu-liang, ZHANG Su-qiong, WANG Xiao-jian, LI Qing-shan

罗布麻总黄酮高效液相色谱指纹图谱研究



全 文 :AnewmethodforquickidentificationforFufangDanshentablets
byAOTFnearinfraredspectroscopy
WANGNin1,CAIShaosong2,WUWeihong1,ZHOUAimin3,LIZhongwen1
(1.ShandongHighTrainingSchool,Jinan250002,China;2.JinanJinhongliIndustryLtd.,Jinan250100,China;
3.JinanHongjitangPharmaceuticalLimitedliabilityCompany,Jinan250000,China)
[Abstract] Objective:ToestablishanewmethodusingAOTFNearinfraredspectroscopyforfastidentifyingFufangDanshen
tablets.Method:NearinfraredspectroscopyofFufangDanshentabletsfromdiferentfactoriesanddiferentbacthnumberswerecol
lectedandthediscriminantanalysismodel(FFDSC)wasestablishedwithprincipalcomponentanalysis.Thismodelwasappliedto
predictthethediferentsamplesofFufangDanshntablets.Result:ThemodelcanbeusedtopreciselyidentifyFufangDanshentablets
fromothersamples.Conclusion:Themethodwithlowconsumptionissimpleandquickandcanbeappliedtotheidentificationofthe
FufangDanshentablets.
[Keywords] Acoustooptictunablefilter;nearinfraredspectroscopy;FufangDanshentablet;principalcomponentanalysis;
quickidentification [责任编辑 鲍 雷]
罗布麻总黄酮高效液相色谱指纹图谱研究
郝旭亮,张素琼,王晓剑,李青山
(山西医科大学 药学院,山西 太原030001)
[摘要] 目的:建立罗布麻总黄酮有效部位的指纹图谱,为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。方法:
采用HPLCDAD法进行测定,色谱柱:KromasilC18(46mm×250mm,5μm),流动相005%磷酸乙腈005%磷酸
水梯度洗脱,柱温25℃,流速10mL·min-1;检测波长360nm。结果:测定7批罗布麻总黄酮的HPLC图,建立标
准指纹图谱,有17个共有峰,并用中药指纹图谱相似度评价系统计算其相似度,各批总黄酮的相似度介于095~
10。梯度洗脱得到的色谱图色谱蜂分离较好,达到了指纹图谱的要求,并在相同的色谱条件下测定了罗布麻叶药
材的HPLC图谱,其结果与罗布麻总黄酮有很好的相关性。结论:该方法精密度、稳定性及重现性较好,特征性及
专属性强,可全面控制罗布麻总黄酮及其制剂质量,确保每批产品的均一性。
[关键词] 罗布麻叶;总黄酮;高效液相色谱;指纹图谱
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)16196804
[收稿日期] 20080420
[基金项目] 山西省自然科学基金(20031102);山西省教育厅
攻关课题(512500012023)及太原市大学生创新创业扶持项目
(07010780)
[通讯作者] 李青山,Tel:(0351)4690322,Email:qingshanl
@yahoo.com
  罗布麻 ApocynumvenetumL.为夹竹桃科 Apoc
ynaceae植物,遍布于我国华北、西北及黄河流域的
盐碱沙荒地区,资源丰富。其叶是一味传统平肝清
热的中药[1]。近年来的研究表明,罗布麻叶具有降
脂、抗氧化、保肝、利尿、防感冒、抗抑郁和镇静等作
用。本课题组前期对罗布麻叶药效物质基础进行了
较系统的研究,从罗布麻叶中分离鉴定了20余种黄
酮类化合物化学成分,其中主要为金丝桃苷、异槲皮
苷、槲皮素3O槐糖苷等,药理研究表明,其总黄酮
具有明确的降血脂、抗血栓活性,并已得到分离纯化
后的有效部位[24]。
前期研究[57]已建立了金丝桃苷的含量及总黄
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酮含量测定方法来控制罗布麻总黄酮的质量,但不
能反映总黄酮中其他成分的情况,难于真正控制其
质量。鉴于植物药具有复杂的化学成分,而其活性
成分常常不甚明确的状况,色谱指纹图谱方法是评
价植物药质量的有效方法之一。作者应用 HPLC
DAD方法对罗布麻叶总黄酮的指纹图谱进行了研
究,建立了罗布麻总黄酮指纹图谱,并考察了总黄酮
与罗布麻药材间的相关性,为全面控制总黄酮的质
量提供了可靠方法。
1 仪器与试药
美国Waters2695全自动高效液相色谱系统 (包
括PAD二极管阵列检测器,自动进样器,配置 Em
powerPro色谱处理工作站);金丝桃苷对照品
(1521200202,中国药品生物制品检定所);异槲皮
苷对照品,本课题组提供;罗布麻叶药材(运城地区
药材公司中药饮片厂)经山西医科大学药学院生药
学教研室高建平教授鉴定为罗布麻属罗布麻 A
venetum,罗布麻总黄酮为本课题组所在的山西省中
医药现代工程技术研究中心提供,批号 2007001
2007007,乙腈、甲醇为 Fisher公司产品,色谱纯,水
为超纯水,其余均为分析纯。
2 方法及结果
2.1 色谱条件
色谱柱 KromasilC18色谱柱(46mm×250mm,
5μm);流动相005%磷酸乙腈005%磷酸水梯度
洗脱(梯度洗脱程序见表1);柱温25℃;进样量10
μL,流速 10mL·min-1;色谱峰光谱采集范围
250~450nm;检测波长360nm。以金丝桃苷的色
谱峰(6号)计算理论塔板数为15000。
表1 流动相梯度洗脱程序
t/min 乙腈(含005%磷酸)水(含005%磷酸) 梯度曲线
0 17 83 9
0~45 100 0 9
45~60 100 0 -
2.2 对照品溶液的制备
精密称取经五氧化二磷干燥的金丝桃苷对照品
适量,80%甲醇溶解,制成0092g·L-1对照品储备
液。
2.3 供试品溶液的制备
各批次的总黄酮样品60℃真空干燥4h,置于
干燥器中,放冷后精密称取 10mg,置 50mL量瓶
中,加80%甲醇40mL,超声处理5min,80%甲醇定
容至刻度,045μm滤膜滤过,即得。
2.4 色谱条件的选择及结果
2.4.1 洗脱系统的选择及结果 基于黄酮类成分
呈弱酸性这一特点;实验中对2种弱酸性流动相系
统进行了选择:乙腈水磷酸及甲醇水磷酸,结果
发现乙腈水磷酸系统的分离效果明显优于甲醇
水磷酸系统,得到的色谱峰形较好,且较稳定,故选
择乙腈水磷酸洗脱系统。但等度洗脱时分离效果
较差,为使色谱峰达到最佳分离效果,反复摸索流动
相梯度变化程序,最终确定上述表1梯度洗脱程序。
2.4.2 检测波长的选择 本实验采用二极管阵列
检测器,于分析时进行了190~400nm全波长紫外
扫描,并在不同波长(254,320,350,360,370nm)下
获取数据,经对各波长下色谱图比较分析,结果表明
360nm色谱图峰形最好,出峰数目较多,各色谱峰
相互之间分离度较好,基线平稳,同时结合罗布麻总
黄酮所含主要成分的吸收波长,故检测波长定为
360nm。
2.4.3 分离柱温的选择 考察了分离柱温对罗布
麻总黄酮指纹图谱的检测影响。结果显示,柱温变
化对各色谱峰的保留时间和峰面积影响不大。但在
恒温条件下,各色谱峰保留时间和峰面积的稳定性
和重复性均得到明显改善,试验选择分离柱温为
25℃。
2.4.4 内参物的选择 金丝桃苷是从罗布麻中分
离得到的含量比较高的黄酮类化合物,是罗布麻最
具代表性的活性成分之一,在本实验条件下,金丝桃
苷的色谱峰为谱图中7号峰,其色谱峰面积约占总
峰面积30%以上,且色谱保留时间和峰面积稳定,
与相邻其他色谱峰分离较好,故选择金丝桃苷为指
纹图谱的内参物,按金丝桃苷峰计算,分离系统理论
塔板数约为15000。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度实验 取批号为07004号的样品,按
供试品溶液制备方法制备供试品溶液,按上述色谱
条件连续进样5次,测定HPLC色谱图。结果表明,
各色谱峰的相对保留时间和主要峰的峰面积比值基
本没有明显变化,RSD<3%。表明仪器精密度良
好,符合指纹图谱要求。
2.5.2 稳定性实验 取批号为04号的样品,按供
试品溶液制备方法制备供试品溶液,分别在0,2,4,
8,12h进样分析,测定HPLC色谱图。结果表明,各
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共有峰相对保留时间的RSD<3%,各共有峰的相对
峰面积的RSD<3% ,表明供试品溶液在12h内稳
定性良好。
2.5.3 重现性实验 取批号为04号的样品5份,
按供试品溶液制备方法制备供试品溶液,测定
HPLC图。结果表明,各共有峰相对保留时间的
RSD<3%,各共有峰的相对峰面积的 RSD<3%,表
明方法重现性良好。
2.6 主要色谱峰的鉴定
在同样色谱条件下,测定金丝桃苷和异槲皮苷
对照品,并与样品指纹图谱中相应色谱峰进行比较,
发现样品指纹图谱中6,7号峰的保留时间及紫外光
谱分别与金丝桃苷和异槲皮苷吻合,故样品指纹图
谱中6,7号特征峰分别鉴定为金丝桃苷和异槲皮
苷。
2.7 罗布麻总黄酮指纹图谱的建立
2.7.1 样品指纹图谱的制备 取7批总黄酮样品,
分别按供试品的制备方法处理,按上述色谱条件测
定50min内的 HPLC图,有17个共有峰,标准指纹
图谱见图1。出峰时间为20min左右的S峰为金丝
桃苷,作为参比峰。
1~17号峰为共有峰,图3同
图1 罗布麻总黄酮HPLC图谱
2.7.2 共有模式的建立和相似度计算 将7批罗
布麻有效部位HPLC指纹图谱导入中国药典会指纹
图谱相似度评价软件(2004年版),采用广义夹角余
弦法,计算样品共有色谱峰与标准模式中对应的色
谱峰相似度。
指纹图谱相似度的测定方法有多种,其中夹角
余弦法测定更适于分析评价不同批次间质量的稳定
性[8],本实验就是以夹角余弦法来初步计算罗布麻
总黄酮指纹图谱相对峰面积的相似度的。7批总黄
酮指纹图谱的相似度分别为0998048,0985211,
0999207,0998646,0957351,0993368。指纹
图谱相似性见图2。
图2 罗布麻总黄酮HPLC指纹图谱相似性
2.8 罗布麻叶药材的HPLC分析
应用相同色谱条件分析罗布麻叶药材,结果见
图3。通过与总黄酮的指纹图谱进行比较,可以看
出,总黄酮的指纹图谱中主要特征峰等均可在药材
中找到相应的峰,最强峰仍然是6号峰(金丝桃苷)
和7号峰(异槲皮苷)。可分为3个部分,保留时间
0~6min处,除前面两个溶剂峰外,有 1个小峰,
10~25min处,有6个峰,其主要特征峰6,7均在此
区域。通过与标准品的保留时间及紫外光谱比较6
和7号峰分别鉴定为金丝桃苷和异槲皮苷,25~45
min处,有10个峰,另一主要特征峰11在此区域。
图3 罗布麻叶药材指纹图谱
3 讨论
色谱指纹图谱用于中药鉴别较用任何一种单一
化学对照品作为鉴别的依据提供的信息要丰富的
多,对于保证药品质量稳定和提高中药质量控制水
平具有重要意义。本研究结果显示,7批罗布麻总
黄酮成品指纹图谱相似度均大于097,说明该总黄
酮有效部位的提取工艺较稳定,采用所建立的色谱
指纹图谱方法对生产工艺中质量控制较可靠。
黄酮类成分是罗布麻叶的主要有效成分,采用
指纹图谱能较全面地反映总黄酮所含主要化学成分
的种类、数量,相对比例等信息。本实验中,罗布麻
叶总黄酮指纹图谱的各种黄酮类成分分离较好,大
多数组分达到了基线分离。
在相同色谱条件下测定罗布麻叶药材的 HPLC
图谱,并与总黄酮的色谱图比较,发现两者有很好的
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相关性,总黄酮的指纹图谱中主要特征峰均可在药
材中找到相应的峰。
[参考文献]
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HPLCfingerprintoftotalflavonoidsofFoliumApocyniVeneti
HAOXuliang,ZHANGSuqiong,WANGXiaojian,LIQingshan
(SchoolofPharmaceuticalScience,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)
  [Abstract] Objective:ToestablishasensitiveandspecificHPLCfingerprintforthequalitycontrolingoftotalflavonoidsofFolium
ApocyniVeneti.Method:HPLCanalysiswasperformedonaKromasilC18column(46mm×250mm,5μm)withthemixtureofsolventA
[acetonitrilephosphoricacid(95∶5)]andsolventB(005% phosphoricacid)ingradientmodeataflowrateof10mL·min-1.Thede
tectionwavelengthwassetat360nm.Thecolumntemperaturewassetat25℃andtheinjectionvolumewas20μL.Result:Thechromato
graphicfingerprintoftotalflavonoidswasestablishedwhichshowed17characteristicpeaksfrom7patchesoftotalflavonoidsproducts.The
similarityfromdiferentpatcheswas095100analyzedbythesoftwareof‘ComputeraidedSimilarityEvaluation’andshowedhighsimili
tudeinpeaknumbersandtheretentiontime.Moreover,comparisonoftheHPLCprofilesofthetotalflavonoidswiththecorespondingFolium
ApocyniVenetileavesindicatedthattheywerecloselyrelatedtoeachother.Conclusion:Thechromatographicfingerprintofthetotalfla
vonoidswithhighspecificityandcanbeusedtocontrolitsqualityandassurethehomogenicityforeachpatchofthetotalflavonoids.
[Keywords] FoliumApocyniVeneti;totalflavonoids;HPLC;fingerprint [责任编辑 鲍 雷]
[收稿日期] 20071228
[基金项目] 江苏省方剂重点实验室开放项目(022021014010)
[通讯作者] 尹莲,Tel:13813971246,Fax:(025)85811524,Email:yinlian162@163.com
二妙丸类方抗湿热证痛风有效部位群
指纹图谱比较研究
李 欣1,尹 莲1,段金廒2,丁安伟1,2
(1.南京中医药大学 药学院,江苏 南京 210046;
2.江苏省方剂研究重点实验室,江苏 南京 210046)
[摘要] 目的:为探索类方方剂配伍物质基础变化特征,研究二妙丸类方(二妙丸、三妙丸、四妙丸及加味四妙
丸)配伍物质基础的关联。方法:建立加味四妙丸抗湿热证痛风有效部位群HPLC指纹图谱,利用对照品确定指纹
图谱共有峰成分、组方药有效部位色谱峰归属以及有效部位群共有峰的组方药有效部位来源,测定二妙丸类方抗
湿热证痛风有效部位群指纹图谱,比较指纹图谱共有峰成分特征及配伍变化。结果:加味四妙丸有效部位群有60
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