全 文 ：ｌｅｓｓｔｈａｎ８％Ｔｈｅｍａｉｎｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｓｃｕｔｅｌａｒｉｎｗｅｒｅａｓｆｏｌｏｗｓ：ｔｍａｘ，Ｃｍａｘ，ＡＵＣａｎｄＭＲＴｂｅｉｎｇ（７７±０９）ｈ，
（２８８０±７５２）μｇ·Ｌ－１，（５６±１６）μｇ·ｍＬ－１·ｈ－１，（１７５±１４）ｈ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓａｐｐｌｉｅｄ
ｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｓｃｕｔｅｌａｒｉｎ．Ａｆｔｅｒｏｒａｌｔｈｅｓｃｕｔｅｌａｒｉｎｉｎｒａｔｓ，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅｄｏｅｓｎ’ｔｏｂｅｙａｎｙｃｏｍｐａｒｔ
ｍｅｎｔｍｏｄｅｌ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｔｉｍｅｃｕｒｖｅｉｓｔｈｅｄｏｕｂｌｅｐｅａｋｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｓｃｕｔｅｌａｒｉｎ；ＨＰＬＣ；ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ；ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｉｓｓｕｅ ［责任编辑 古云侠］
桂皮醛对 ＮＩＨ３Ｔ３细胞周期及相关蛋白表达的影响
赵京霞，李 萍，盛 巡，刘 欣，梁代英
（北京市中医研究所 首都医科大学 附属北京中医医院，北京 １０００１０）
［摘要］ 目的：观察肉桂主要成分桂皮醛对小鼠成纤维瘤细胞株 ＮＩＨ３Ｔ３细胞周期及相关蛋白的影响。方
法：采用流式细胞仪检测桂皮醛（５５ｎｇ·ｍＬ－１）对ＮＩＨ３Ｔ３细胞周期分布的影响；用免疫细胞化学法检测桂皮醛对
ＮＩＨ３Ｔ３细胞的细胞周期蛋白Ｄ１（ＣｙｃｌｉｎＤ１）和增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）蛋白表达的影响。结果：流式细胞仪检测
显示，桂皮醛作用２４ｈ后ＮＩＨ３Ｔ３细胞Ｓ期比例上升了３％（Ｐ＜００５），Ｇ２／Ｍ期比例无明显升高，细胞增殖指数
（ＰｒＩ）增加了３５％（Ｐ＜００１）。经桂皮醛刺激后，ＮＩＨ３Ｔ３细胞ＣｙｃｌｉｎＤ１和ＰＣＮＡ蛋白表达量明显增加，与对照组
比较，有极显著差异（Ｐ＜００１）。结论：桂皮醛可推动 ＮＩＨ３Ｔ３细胞周期向前进展，这种正向调控作用与桂皮醛能
促进ＣｙｃｌｉｎＤ１和ＰＣＮＡ蛋白表达有关。
［关键词］ 桂皮醛；细胞周期；细胞周期蛋白Ｄ１；增殖细胞核抗原
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００７）１６１６９２０３
［收稿日期］ ２００６０６２０
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３０４７２２５８）
［通讯作者］ 李萍，Ｔｅｌ：（０１０）５２１７６６７９，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｐｉｎｇ４１１＠
ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
桂皮醛是中药肉桂的主要成分，肉桂在治疗慢
性皮肤溃疡愈合方面具有重要的作用。成纤维细胞
增殖调控障碍可能是慢性皮肤溃疡难愈合的重要因
素之一。笔者前期研究结果表明，桂皮醛对大鼠慢
性皮肤溃疡疮缘成纤维细胞［１］和ＮＩＨ３Ｔ３细胞具有
促增殖作用［２］。细胞增殖最终取决于增殖细胞在
细胞外信号影响下细胞周期的有序进展，如果细胞
周期本身的调控机制障碍及调节细胞周期的细胞外
信号紊乱都会导致病态的发生。本实验以 ＮＩＨ３Ｔ３
细胞为模型，从细胞周期、细胞周期蛋白 Ｄ１（Ｃｙｃｌｉｎ
Ｄ１）以及增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的表达等方面对
桂皮醛的促增殖作用机制进行初步探讨。
１ 材料
１．１ 主要试剂与仪器 ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ公
司）；胎牛血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ，天津ＴＢＤ公
司）；胰蛋白酶，溴化丙锭（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ，Ｂｉｏｔｉ
ｕｍ公司）；倒置显微镜、ＢＸ５１型多功能显微镜（日
本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）；流式细胞仪（美国 ＢＤ公司）；丙
酮、甲醇（分析纯，北京化学试剂公司）；ＴｒｉｔｏｎＸ１００，
ＲＮＡ酶Ａ（ＲＮＡａｓｅＡ）（Ｓｉｇｍａ公司）；细胞周期蛋白
Ｄ１兔单克隆抗体、即用型快速免疫组化 ＭａｘＶｉ
ｓｉｏｎＴＭ试剂盒、ＤＡＢ显色试剂盒（福州迈新生物技术
开发有限公司）；小鼠抗增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）单
克隆抗体、即用型ＳＡＢＣ二抗试剂盒（武汉博士德生
物工程公司）；Ｉｍａｇｅｐｒｏｐｌｕｓ５０图像分析软件。
１．２ 药物 桂皮醛（ｃｉｎｎａｍｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ，ＣＡ）对照
品，纯度 ＞９８％，由中国药品生物制品检定所提供
（批号１１０７１０２００２１２）。
１．３ 细胞 ＮＩＨ３Ｔ３小鼠成纤维细胞瘤细胞株购于
中国协和医科大学细胞中心。
２ 方法
２．１ 细胞周期检测 将ＮＩＨ３Ｔ３细胞用０１２５％胰
蛋白酶消化后，以相同密度接种于２５ｃｍ２培养瓶中，
培养２４ｈ后，更换为含１％ ＦＢＳ的培养基，２４ｈ血
清饥饿后，加入无血清培养基稀释的药物（增殖检
测筛选的有效浓度）：桂皮醛终浓度为 ５５ｎｇ·
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第３２卷第１６期
２００７年８月
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ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ １６
Ａｕｇｕｓｔ，２００７
ｍＬ－１。继续培养２４ｈ后，消化、离心、清洗细胞并用
７０％冰乙醇固定，４℃保存。上机前离心去除乙醇，
ＰＢＳ洗涤３次，各管弃上清后剩余２００μＬ，混悬细胞
后加入终浓度为１００ｍｇ·Ｌ－１的 ＲＮＡｓｅＡ，３７℃孵
育４０ｍｉｎ；继而加入终浓度为５０ｍｇ·Ｌ－１的 ＰＩ染
液，４℃避光染色１ｈ，３００目纱网过滤，流式细胞仪
检测分析。
２．２ ＣｙｃｌｉｎＤ１和ＰＣＮＡ免疫细胞化学检测 ＮＩＨ３Ｔ３
细胞用０１２５％胰蛋白酶消化，加入含１０％胎牛血清的
ＤＭＥＭ培养基吹打成细胞悬液，以５×１０４个／孔的密度
接种于预先放有消毒盖玻片的１２孔培养板内，置于３７
℃，５％ＣＯ２孵箱中孵育２４ｈ后，换用无血清ＤＭＥＭ培
养基继续培养２４ｈ。桂皮醛组加入无血清培养基稀释
的药物（５５ｎｇ·ｍＬ－１），细胞对照组为相应的无血清
ＤＭＥＭ培养基。分别在加药２４，１６ｈ后取出细胞爬片，
用固定液（甲醇∶丙酮＝１∶１）固定１０ｍｉｎ，干燥数小时
后用免疫细胞化学法分别检测药物对ＣｙｃｌｉｎＤ１和ＰＣ
ＮＡ蛋白表达的影响。实验设立阴性对照，不加一抗。
免疫组化玻片采用ＩＰＰ图像分析系统进行半定量分
析，每组５张爬片，每张爬片上随机选取３个视野，各指
标以平均吸光度（Ａ）表示。
２．３ 统计方法 数据均采用 ＳＰＳＳ１１０软件进行
统计分析，所用数据以 珋ｘ±ｓ表示。
３ 结果
３．１ 桂皮醛对 ＮＩＨ３Ｔ３细胞周期的影响 细胞周
期检测结果见表１。桂皮醛作用 ＮＩＨ３Ｔ３细胞２４ｈ
后，Ｓ期比例上升了３％，与对照组比较有显著差异
（Ｐ＜００１），Ｇ２／Ｍ期比例与对照组比较无差异，细
胞增殖指数（ＰｒＩ）增加了３５％，与对照组比较有显
著差异（Ｐ＜００１）（见表１）。
表１ 桂皮醛对ＮＩＨ３Ｔ３细胞周期的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别 Ｇ１ Ｓ Ｇ２／Ｍ ＰｒＩ（Ｓ＋Ｇ２／Ｍ）
对照 ８０８２±１０７１ ２８８±０４７ ６２３±０８９ １９１２±１０４
桂皮醛 ７７５４±１０９１） １５８８±０７７１） ６７９±０５４ ２２６７±０８０２）
注：与对照组比１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１
３．２ 桂皮醛对ＮＩＨ３Ｔ３细胞 ＣｙｃｌｉｎＤ１表达的影响
桂皮醛作用ＮＩＨ３Ｔ３细胞２４ｈ后用免疫细胞化学
显色方法检测。ＣｙｃｌｉｎＤ１阳性反应物为棕黄色颗
粒，主要分布在细胞核中。对照组细胞核内阳性反
应物颗粒较少，而桂皮醛组细胞核内出现大量阳性
反应物颗粒（见图１）。经图像分析，桂皮醛组 Ｃｙｃ
ｌｉｎＤ１表达量与对照组比较有极显著差异（Ｐ＜
００１）（见表２）。
图１ 桂皮醛对２组ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白表达的影响（×２００）
Ａ．对照组；Ｂ．桂皮醛组
３．３ 桂皮醛对 ＮＩＨ３Ｔ３细胞 ＰＣＮＡ蛋白表达的影
响 桂皮醛作用细胞１６ｈ，固定后用免疫细胞化学
显色方法检测。ＰＣＮＡ阳性反应物位于细胞胞核
内，呈棕黄色颗粒，对照组阳性反应物较少；而桂皮
醛组数量较多，核内出现大量棕黄色阳性反应物颗
粒（见图２）。图像分析结果表明，ＰＣＮＡ表达与对
照组比较有极显著差异（Ｐ＜００１）（见表２）。
图２ 桂皮醛对２组ＰＣＮＡ蛋白表达的影响（×２００）
Ａ．对照组；Ｂ．桂皮醛组
表２ 桂皮醛对ＮＩＨ３Ｔ３细胞ＣｙｃｌｉｎＤ１和ＰＣＮＡ
蛋白表达（Ａ）的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别 ＣｙｃｌｉｎＤ１ ＰＣＮＡ
对照 ０１４１±００１２ ０１９６±００１４
桂皮醛 ０２００±００１６１） ０２７８±００２２１）
注：与对照组比１）Ｐ＜００１
４ 讨论
本实验采用流式细胞仪 （ＦＣＭ）检测桂皮醛对
ＮＩＨ３Ｔ３细胞周期变化的影响，实验结果显示，桂皮
醛有助于促进细胞周期由 Ｇ０／Ｇ１期进入 Ｓ期，桂皮
醛作用ＮＩＨ３Ｔ３细胞２４ｈ后，Ｓ期比例上升了３％，
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Ａｕｇｕｓｔ，２００７
ＰｒＩ增加了３５％，提示桂皮醛可能是使更多细胞通
过Ｇ１／Ｓ期限制点对细胞周期进行调节，从而进一
步促进细胞增殖的。
在细胞周期调控体系中，核心因素为细胞周期蛋
白（Ｃｙｃｌｉｎｓ）、细胞周期蛋白依赖性激酶（ＣＤＫｓ）和细
胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子。其中Ｃｙｃｌｉｎｓ作为
正性调控因子发挥作用。在 Ｃｙｃｌｉｎｓ家族中，Ｃｙｃｌｉｎ
Ｄ１是大多数组织增殖所必须的，在正常细胞中的功
能被认为能促进细胞周期。ＣｙｃｌｉｎＤ１的表达具有周
期性改变［３］，可加速细胞周期进程［４］。
ＰＣＮＡ是细胞增殖和 ＤＮＡ损伤修复过程中
ＤＮＡδ多聚酶的必需辅助因子，在 ＤＮＡ复制和细胞
周期调控等多种细胞活动过程中都具有重要作用。
整个细胞增殖周期中都有 ＰＣＮＡ的存在，Ｓ期达高
峰，而Ｇ０期不含有 ＰＣＮＡ，其量的变化与 ＤＮＡ合成
一致，其水平在很长的时间里可检测到，是反映细胞
增殖的标志物。提高细胞内 ＰＣＮＡ等与 ＤＮＡ修复
有关的蛋白表达，对促进伤口愈合可能起着十分重
要的作用［５］。
本实验发现，桂皮醛作用于 ＮＩＨ３Ｔ３细胞后，
ＣｙｃｌｉｎＤｌ和 ＰＣＮＡ阳性率明显增加，表明桂皮醛能
促进ＣｙｃｌｉｎＤｌ和ＰＣＮＡ蛋白的表达，提示桂皮醛能
促进 ＮＩＨ３Ｔ３细胞由 Ｇ０Ｇ１期进入 Ｓ期，促进 ＤＮＡ
的合成，并与流式细胞仪测定结果相一致。桂皮醛
上调ＣｙｃｌｉｎＤｌ和 ＰＣＮＡ的表达，促进细胞 ＤＮＡ的
合成，加速细胞周期进程可能是桂皮醛促进ＮＩＨ３Ｔ３
细胞生长的机制之一。
研究表明，ＣｙｃｌｉｎＤ１的表达与生长因子有关，
被认为是生长因子的感受器［６］。桂皮醛能促进 Ｃｙ
ｃｌｉｎＤｌ的表达，提示其可能具有类生长因子的作用。
本实验可见桂皮醛能显著提高 ＮＩＨ３Ｔ３细胞碱性成
纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）蛋白的表达。ｂＦＧＦ在胞
内合成之后通常是以旁分泌或者自分泌的形式出现
在胞外，刺激内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞增
殖及移行。桂皮醛能够上调 ＣｙｃｌｉｎＤｌ，ＰＣＮＡ的表
达、推动细胞周期、促进细胞增殖，是桂皮醛本身具
有类生长因子作用，还是桂皮醛通过刺激 ｂＦＧＦ蛋
白的表达使 ｂＦＧＦ分泌增加来实现这一作用，或者
桂皮醛通过其他网络机制进行调控，有待进一步去
研究。
［参考文献］
［１］ 李光善，李 萍，盛 巡，等．黄芪多糖、桂皮醛、川芎嗪对实验
性糖尿病大鼠创面成纤维细胞增殖作用的影响［Ｊ］．中国中医
基础医学杂志，２００４，１０（４）：２０．
［２］ 赵京霞，李 萍，黄启福，等．桂皮醛对 ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖和细
胞周期的影响［Ｊ］．北京中医药大学学报，２００６，２９（１２）：８２３．
［３］ ＭｏｔｏｋｕｒａＴ，ＢｌｏｏｍＴ，ＫｉｍＨＧ，ｅｔａＩ．Ａｎｏｖｅｌｃｙｃｌｉｎｅｎｃｏｄｅｄ
ｂｙａｂｃｌｌｉｎｋｅｄｃａｎｄｉｄａｔｅｏｎｃｏｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５０
（６３１８）：５１２．
［４］ 郭久冰，赵玉元，李 乐．吲哚美辛对胃癌 ＳＧＣ７９０１细胞增殖
及ＣｙｃｌｉｎＤｌ蛋白表达的影响［Ｊ］．临床消化病杂志，２００４，１６
（３）：１０３．
［５］ 陈 伟，付小兵，孙同柱，等．增殖细胞核抗原和Ｐ５３在胎儿和
成人皮肤中的表达特征及其意义［Ｊ］．中国危重病急救医学，
２００２，１４（１１）：６５４．
［６］ ＳｈｅｒＣＪ．ＭａｍｍａｌｉａｎＧ１ｃｙｃｌｉｎｓ［Ｊ］．Ｃｅｌ，１９９３，７３（６）：１０５９．
Ｅｆｅｃｔｓｏｆｃｉｎｎａｍｙｌａｌｄｅｈｙｄｅｏｎｃｅｌｃｙｃｌｅａｎｄｒｅｌａｆｅｏｌｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮＩＨ３Ｔ３ｃｅｌｓ
ＺＨＡＯＪｉｎｇｘｉａ，ＬＩＰｉｎｇ，ＳＨＥＮＧＸｕｎ，ＬＩＵＸｉｎ，ＬＩＡＮＧＤａｉｙｉｎｇ
（ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００１０，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆＣｉｎｎａｍｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ（ＣＡ）ｏｎＮＩＨ３Ｔ３ｃｅｌｃｙｃｌｅａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｕｒｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｏｂｓｅｒｖｉｎｇｃｅｌｃｙｃｌｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎ
ｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）ａｎｄＣｙｃｌｉｎＤ１ｐｒｏｔｅｉｎｉｎＮＩＨ３Ｔ３ｃｅｌｓｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＡｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈＣＡｆｏｒ２４
ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＳｐｈａｓｅｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄｂｙ３％ （Ｐ＜００５）ａｎｄｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ（ＰｒＩ，Ｓ＋Ｇ２／Ｍ）ｗａｓｉｎ
ｃｒｅａｓｅｄｂｙ３５％ （Ｐ＜００１），ｂｕｔＧ２／Ｍｐｈａｓｅｈａｄｎｏｏｂｖｉｏｕｓｃｈａｎｇｅｓ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＣｙｃｌｉｎＤ１ａｎｄＰＣＮＡｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｉｍ
ｐｒｏｖｅｄｍａｒｋｌｙｂｙＣＡｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜００１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＣＡｃｏｕｌｄｐｒｏｍｏｔｅｍｏｒｅｃｅｌｓｉｎＧ０／Ｇ１ｐｈａｓｅｉｎｔｏＳ
ｐｈａｓｅ，ｗｈｉｃｈｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＰＣＮＡａｎｄＣｙｃｌｉｎＤ１．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｃｅｌｃｙｃｌｅ；ｃｉｎｎａｍｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ；ＣｙｃｌｉｎＤ１；ＰＣＮＡ ［责任编辑 古云侠］
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