全 文 ：·研究报告·
壳聚糖絮凝沉淀法在牛膝纯化工艺中的应用性研究
刘 益，王玉蓉，许文博
（北京中医药大学 中药学院，北京 １００１０２）
［收稿日期］ ２００７０７２０
［通讯作者］ 刘益，Ｅｍａｉｌ：ｚａｃｈｚａｃｈ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ
牛膝ＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓｂｉｄｅｎｔａｔａＢＩ．为苋科多年生草本
植物，味苦、酸，性平，入肝、肾经，有补肝肾、强筋骨、
逐瘀通经、引血下行等功效［１］。现代药理研究证明其
具有免疫调节、抗凝血、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗衰老、抗
病毒等作用［２］，其主要活性成分是牛膝皂苷（其苷元
为齐墩果酸，属于五环三萜类化合物）和牛膝多糖［３］。
作为临床常用药，牛膝正日益引起医药研究者的广泛
关注。本研究着重对牛膝的纯化工艺，及壳聚糖絮凝
沉降的动力学过程进行了探讨。
１ 仪器与试剂
ＵＶ－２０００型分光光度计（日本日立）；ＥＲ－１８２Ａ
型电子分析天平；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器
厂）；水（娃哈哈纯净水），壳聚糖（山东潍坊盈得甲壳
素公司，药用级）；其余试剂均为分析纯。
葡萄糖对照品（批号２００３０３２１）、齐墩果酸对照
品（批号１１０７０９２００３０４）均购自中国药品生物制品检
定所。牛膝经本校中药鉴定教研室陈玉婷副教授鉴
定为苋科牛膝Ａｂｉｄｅｎｔａｔａ的干燥根。
２ 方法与结果
２．１ 含量测定
２．１．１ 对照品溶液的制备
精称葡萄糖对照标准品 ５０２７５ｍｇ，置 ５０ｍＬ
量瓶中，加水至刻度，摇匀，制得１００５５ｍｇ·ｍＬ－１
葡萄糖对照品溶液。
精密称取齐墩果酸对照品２８ｍｇ置２５ｍＬ量
瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，制得０１１２０ｍｇ·
ｍＬ－１齐墩果酸对照品溶液。
２．１．２ 标准曲线的制备
分别精密吸取上述对照品溶液１，１５，２，２５，
３，４ｍＬ于５０ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即
得，用苯酚硫酸法显色，即分别精取上述葡萄糖对
照品溶液１ｍＬ，加入５％苯酚溶液１ｍＬ，迅速加入
５ｍＬ９８％浓硫酸，振摇５ｍｉｎ，置沸水浴中１５ｍｉｎ，
再置冰水浴中冷却至室温。另取１ｍＬ水，同法制备
空白溶液，于４８９ｎｍ处进行测定吸光度，阴性无干
扰［４］。以葡萄糖质量浓度（μｇ·ｍＬ－１）为横坐标、
吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程 Ｙ＝
１６４４５０Ｘ－１９０８３（ｒ＝０９９９６）。结果表明，葡萄
糖在２８７３～１１４９１μｇ·ｍＬ－１与吸光度呈良好的
线性关系。
分别精密吸取上述齐墩果酸对照品溶液０４，
０５，０７，１０，１２，１５ｍＬ置１０ｍＬ具塞试管中，加
热挥去溶剂，再加入０４ｍＬ新鲜配制的５％香草醛
冰醋酸液及１６ｍＬ高氯酸试剂，于７０℃恒温水浴
加热 １５ｍｉｎ，冰水浴冷却至室温，再加入５ｍＬ冰醋
酸，摇匀即得。以随行显色剂，同法制备空白溶液，
于５４４ｎｍ处进行测定，阴性无干扰［４］。以齐墩果酸
质量浓度（ｍｇ·ｍＬ－１）为横坐标、吸光度（Ａ）为纵坐
标绘制标准曲线，得回归方程 Ｙ＝３４６５５０Ｘ＋
００１２７（ｒ＝０９９９８）。结果表明，齐墩果酸在
０００６４～００２４０ｍｇ·ｍＬ－１进样量与吸光度呈良
好的线性关系。
２．１．３ 样品溶液的制备
精密称取牛膝药材２５ｇ，加１２倍量水浸泡０５
ｈ，煎煮 ２次，每次 １５ｈ，所得提取液用水定容至
５００ｍＬ量瓶中，得提取液，备用。
精密吸取上述提取液０５ｍＬ，用水稀释到 ５０
ｍＬ量瓶，即得供含测总多糖的样品溶液。
精密吸取上述提取液１０００ｍＬ，再加水饱和正
丁醇萃取４次（每次１０ｍＬ），合并萃取液，置锥形瓶
中挥干，加６ｍＬ盐酸溶液（盐酸∶水＝１∶５），于沸水
浴回流２ｈ。取出放冷，滤过，沉淀用水洗至中性后，
用氯仿乙醇（３∶２）混合溶液将沉淀转移至１０ｍＬ量
瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得齐墩果酸样品溶液。
２．２ 牛膝纯化工艺考察
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２．２．１ 各纯化方法考察
按２．１．３项下操作制备提取液，样１至样３各
精密吸取２５ｍＬ提取液，分别处理如下：
样１：不纯化处理，直接作为供试品溶液。
样２（７０％醇沉法）：提取液浓缩到相当于生药
质量浓度为１∶４（ｇ·ｍＬ－１），加９５％乙醇使醇体积
分数达７０％，低温冷藏（４℃）静置２４ｈ，取上清液，
沉淀用体积分数为７０％乙醇洗涤２次，合并洗涤液
与上清液，回收乙醇，加水至 ２５ｍＬ，冷藏 １２ｈ，滤
过，得供试品溶液。
样３（絮凝沉淀法）：提取液浓缩到相当于生药
浓度为１∶８（ｇ·ｍＬ－１），７０℃时加０１％壳聚糖溶液
（其质量浓度为０５％），搅拌１０ｍｉｎ，待沉淀出现后
置冰箱（４℃）冷藏１２ｈ，滤过，得供试品溶液。
样４：（９５％乙醇回流除杂法）取２５ｇ牛膝药
材，加９５％乙醇２０ｍＬ，８０℃水浴回流１ｈ，弃去提
取液，药渣加 １２倍量水（５０ｍＬ），提取 ２次，每次
１５ｈ，合并提取液，转移至 ５０ｍＬ量瓶中，用水定
容。精密吸取２５ｍＬ提取液，即得供试品溶液。
将上述供试品溶液按２．１．２和 ２．１．３项下操
作，分别制备样品溶液并显色后，测定吸光度，结果
见表１。
表１ 各纯化方法所得总皂苷元提取率的结果 ％
编号 纯化方法 总皂苷元 总皂苷元提取率 总多糖 总多糖提取率 浸膏得率
样１ 未纯化 １５２ ９８０６ １０７０８ １８６４５ ７７９６
样２ 醇沉 １２５ ７９３５ ０００ ０００ ６１６０
样３ 絮凝沉淀 １３４ ８７１０ ５９８２ １０４１６ ６２５１
样４ ９５％乙醇回流除杂 ０５６ ３６１３ ７６１２ １３２５４ ７７８７
注：总多糖提取率（％）＝总多糖／粗多糖×１００％，粗多糖（由分级醇沉法制得）质量分数为５７４３％
结果表明，未经纯化的样１因含有淀粉、鞣质等
其他杂质，干扰总多糖的测定，使其总多糖提取率高
于１００％。与样１比较，样４总皂苷元损失较大；样
２虽能较好地保存总皂苷，但总多糖损失殆尽；而样
３（经絮凝沉淀法处理）既能有效除杂，减少总多糖
测定时的干扰，且能同时保留总多糖和总皂苷，生产
成本较低，操作简便、快捷，故确定絮凝沉淀法为牛
膝提取液的纯化方法。
２．２．２ 牛膝壳聚糖絮凝沉淀工艺优选
２．２．２．１ 牛膝絮凝沉淀法星点设计试验 以总多糖
及总皂苷元质量分数（％）为指标，采用星点设计法牛
膝絮凝沉淀工艺参数进行优化，因素水平见表２。
表２ 星点设计因素水平
水平
ｘ１
壳聚糖用量／％
ｘ２
药液浓缩比／ｍＬ·ｇ－１
－１４１４ ００５ １
－１ ００８ ２
０ ０１５ ５
１ ０２２ ８
＋１４１４ ０２５ ９
按２．１．３项下操作制备牛膝提取液。每份试验
精密吸取样品溶液５０ｍＬ按表３安排进行试验，然
后用水定容于１００ｍＬ量瓶中，再按２．１．２和２．１．３
项下操作制备样品溶液并显色，测定，并计算总皂苷
元质量分数（％），结果见表３。
２．２．２．２ 模型拟合 使用ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ软件，以总多糖
表３ 星点实验设计与结果
Ｎｏ． ｘ１ ｘ２ 总多糖／％ 总皂苷元／％
１ ＋１ ＋１ ７５７６ １００
２ ＋１ －１ ６９８２ ０８３
３ －１ ＋１ ８７０３ １３４
４ －１ －１ ４９８２ ０９１
５ ＋１４１４ ０ ６３４９ ０８２
６ －１４１４ ０ ５５７７ １２１
７ ０ ＋１４１４ ８４６３ １２９
８ ０ －１４１４ ４４８８ ０８０
９ ０ ０ ４３３６ ０９８
及总皂苷元质量分数为指标，分别对各因素进行多
元线性回归和二项式模型拟合。
以总多糖质量分数为指标 多元线性回归 ｒ＝
０．７６２３３，Ｆ＝４１６２５，Ｐ＝００７３４８。模型拟合度不
佳，且未能通过检验，线性模型不适合。
非线 性 二 项 式 拟 合 得 Ｙ＝３７５７３８４＋
９０９４６６７ｘ２１＋１１２２２４９ｘ
２
２ －４６３１１９ｘ１ｘ２，ｒ＝
０９４２７，方程可信度较高，而预测性相对于线性拟
合有大幅提高。根据该数学模型绘制效应面见图
１。
图１ 以总多糖质量分数为指标所得效应面
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以总皂苷元质量分数为指标 多元线性回归：
Ｙ＝ｂ０＋ｂ１ｘ１＋ｂ２ｘ２，ｒ＝０９６５２，Ｆ＝４０８４４，Ｐ＜
００１。尽管模型虽通过检验，但拟合度不佳，预测性
较差，线性模型不适合。
故选择非线性二项式拟合，得 Ｙ＝０７４３５３＋
０１０６３０ｘ２－０３４０００ｘ１ｘ２，ｒ＝０９８９６０，方程可信
度较大而相对于线性拟合其预测性有大幅提高。根
据该数学模型绘制效应面图 ２。Ｙ＝ｂ０＋ｂ１ｘ１＋
ｂ２ｘ２＋ｂ３ｘ
２
１＋ｂ４ｘ
２
２＋ｂ５ｘ１ｘ２，经简化后，结果见表４。
图２ 以总皂苷元质量分数为指标所得效应面
表４ 二次多项式非线性估计结果
ｂ０ ｂ２ ｂ５
估计值 ０７４３５３ ０１０６３０ －０３４０００
标准误 ００２４０４ ０００６４１ ００３２２０
ｔ ３０９３０５５ １６５９４１７ －１０５７０００
Ｐ ０００００１ ０００００１ ０００００１
数学模型为 Ｙ＝０７４３５３＋０１０６３０ｘ２ －
０３４０００ｘ１ｘ２，ｒ＝０９８９６，结果表明该方程可信度
较大而相对于线性拟合其预测性有大幅提高。
２２２３ 工艺优化和预测 以拟合的目标函数为
数学模型，以总皂苷元质量分数为指标绘制因变量
曲面图（图１）。
由图１可知壳聚糖用量和药液浓缩比例之间有
交互作用。而药材中总多糖含量与药液浓缩比例成
反比，与壳聚糖用量成正比。
由图２可知壳聚糖用量对牛膝总皂苷元质量分
数的影响显著，而药液浓缩比例在考察范围内影响
不大，较高的壳聚糖用量使总皂苷元损失较多。
综上所述，由图可知牛膝总皂苷元质量分数较
高的范围为 ｘ１：００５％ ～０１０％；ｘ２：６～８ｍＬ·
ｇ－１。兼顾经济成本，确定牛膝提取液絮凝纯化的最
佳工艺为牛膝提取液浓缩到 ７ｍＬ·ｇ－１后，加入
００５％的壳聚糖进行纯化。
按以上选定工艺对牛膝提取液絮凝沉淀后的样
液进行鞣质和蛋白质检识反应，显示为阴性，证明该
类杂质已被除去。结果表明，所选工艺稳定、可靠。
２．３ 絮凝动力学过程研究
取牛膝药材１００ｇ，加１２倍量蒸馏水煎煮两次，
每次１５ｈ，合并提取液，用水定容到１０００ｍＬ量瓶
中。每份取２５ｍＬ按所优选的最佳絮凝工艺在不同
温度下，加入壳聚糖溶液，分别测定不同间隔时间下
溶液中残留的总皂苷元的含量，并由此算出此时间
时总皂苷的絮凝沉淀量。结果见表５、图２。
表５ 各温度条件下不同间隔时间的总皂苷絮凝沉淀量
温度
／℃
总皂苷絮凝沉淀量／ｍｇ
１０ｓ ３０ｓ １ｍｉｎ ５ｍｉｎ ３０ｍｉｎ ６０ｍｉｎ １２０ｍｉｎ
３０ ２４０５７ ５０１１５ ６８１５５ １４４３２５ １８４４１５ ２１４４８２ ２６６５９８
７０ １８０４３ ２４０５７ ３２０７５ １００２９４ １５４３４８ １７４３９２ ２２８５１３
９０ ４０１２ １００２６ ２２０５２ ９０２７２ １４２３２１ １６３４７０ ２１０４７３
同时在该絮凝动力学曲线上对时间求导，从而
得到沉降速度随时间变化的曲线，见图３。
图３ 壳聚糖对牛膝总皂苷的絮凝动力学曲线
由絮凝动力学曲线可知，较大胶体的絮凝沉降
与粗分散体系颗粒的沉降不同。前者是由于吸附、
架桥、电中和等反应导致胶体粒子的聚集而形成粗
分散系后的沉降。又以被沉淀的总皂苷元浓度的对
数ｌｎＣ对时间作图可得一直线：ｌｎＣ＝－ｋｔ＋Ａ。其
中ｋ为反应速度常数，Ａ为常数，见表６。故可认为
该絮凝沉淀过程基本符合动力学一级反应过程；而
后者是一单纯的物理过程。
由图３可见，对于每个温度下的曲线，开始０～
５ｍｉｎ絮凝沉淀量随时间的递增急剧上升，此阶段
属于快速絮凝阶段。在此阶段，壳聚糖与鞣质、蛋白
质等杂质发生吸附、架桥、电中和，使胶体不稳定成
分的分子迅速增大，从提取液中析出。５ｍｉｎ
后絮凝沉淀速度逐渐减小，约在２００ｍｉｎ后，絮凝沉
淀速度随时间的延长趋于平衡，絮凝沉淀量也基本
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表６ 各不同温度下ｌｎＣ与时间ｔ的关系表
温度／℃ ｋ Ａ ｒ
３０ ２９３１４ ３９４３２ ０９９１２
７０ ２９６１０ ５１６３１ ０９９０１
９０ ３２５６８ ７７８３５ ０９９６２
达到饱和，这一阶段属于慢速絮凝。此外由表５和
表６中结果可知平衡絮凝沉淀量随着温度的升高而
减小。因为无论是化学吸附还是物理吸附，其吸附
热△Ｈ均小于０，又由 ｄｌｎＫ／ｄＴ＝△Ｈ／ＲＴ２可知，随
着温度Ｔ升高，平衡吸附常数 Ｋ会相应减小，故平
衡絮凝沉淀量也降低。并由结果可知温度对反应速
度常数的影响不明显。
由图４可知，随着温度的增加，诱导期缩短，拐
点在曲线上的位置提前，曲线在速度恒定区的斜率
增大。故胶体絮凝沉降的速度会随温度的升高而增
加，与高温下胶体吸附量下降基本一致。
图４ 沉降速度随时间变化的曲线
３ 小结与讨论
牛膝的主要有效成分为皂苷类成分，但其水提
液中含大量的鞣质、蛋白质等杂质，增大了服用量，
且所制成的制剂吸湿性较强，大大影响了制剂稳定
性。又因其含大量的有淀粉、等其他杂质，从而干扰
总多糖的测定，由此计算的总多糖提取率甚至高于
１００％。故需对提取液进行纯化。而常规纯化方法
繁杂，成分损失较大。而壳聚糖絮凝沉淀法能较好
地除去牛膝提取液中的鞣制和蛋白类杂质，能同时
最大限度地保留多糖和皂苷类成分。并在此基础上
运用星点设计法对该工艺进行优化，并对其吸附动
力学过程进行了初步探讨，实验证明所得纯化工艺
简便、稳定、可靠。
作为近年来发展起来的新型除杂技术，壳聚糖絮
凝沉淀法通过吸附、架桥以及电中和等作用使体系中
粒度较大的颗粒和有斯托克沉淀趋势的悬浮颗粒产
生絮凝沉淀，能有效除去其水提液中的杂质，保留有
效成分，从而减少服用量，提高制剂稳定性和内在质
量；且该法经济成本和时间成本较之醇沉法较低、简
便可行，在中药制剂领域具有广阔的应用前景。
［参考文献］
［１］ 中国药典［Ｓ］．一部．２００５：４９
［２］ 曹明俐，张小军，王振生，等．牛膝的药理作用研究进展［Ｊ］．中
医药信息，２００１，１８（３）：２０．
［３］ 赵培西，王四旺，王剑波．牛膝中齐墩果酸提取工艺研究［Ｊ］．
陕西中医，２００５，２６（１０）：１０９９．
［４］ 杨朝莲，张运杰．牛膝及其炮制品中齐墩果酸的含量测定研究
［Ｊ］．中医药导报，２００５，１１（６）：７１．
［责任编辑 鲍 雷］
吴茱萸降压颗粒提取工艺研究
张丽艳，杨玉琴，刘 毅，李 健
（贵阳中医学院 药学系，贵州 贵阳 ５５０００２）
［收稿日期］ ２００７１２２０
［通讯作者］ 张丽艳，Ｔｅｌ：（０８５１）５６１５３４４，Ｅｍａｉｌ：ｚｌｙ１９６４＠
１６３ｃｏｍ
吴茱萸降压颗粒为我院内科专家张光奇主任医
师多年临床经验方，主要由吴茱萸、人参、泽泻、杜
仲、大枣、生姜６味中药组成。具有调肝泻浊、降压
固本的功效，用于眩晕头疼、失眠等症，常用于高血
压病的治疗［１，２］。根据处方中各药材的性质，确定
吴茱萸、人参、泽泻用乙醇提取［３］，杜仲、生姜、大枣
采用水提醇沉的方法进行提取［４］。作者分别以浸
膏中吴茱萸总碱总量和绿原酸总量为指标，运用正
交试验法优选了醇提与水提醇沉的提取工艺［５，６］。
１ 仪器与材料
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱仪，ＡＹ１２０１／１万电
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