全 文 ：·研究论文·
用蛹虫草固体发酵法高效生产虫草素的研究
韦会平１，２，叶小莉３，张华英２，李学刚１，钟运俊３
（１．西南大学 药学院，重庆 ４００７１６；２攀枝花学院 医学院，四川 攀枝花 ６１７０００；
３西南大学 生命科学学院，重庆 ４００７１６）
［摘要］ 目的：研究并建立用蛹虫草固体发酵方式高效生产虫草素的最佳方法。方法：通过对不同菌株在固
体发酵过程中各生长期的虫草素含量变化进行跟踪测定以及正交旋转组合设计、正交试验设计等方法，对影响虫
草素产量和含量的各影响因子（包括菌种、生长期、培养基配方和环境条件等）进行系统优化。结果：ＪＦ１是虫草素
生产的最佳菌株，现蕾期是收获提取虫草素的最佳时期；最佳的培养基配方为水料比１１∶１（ｍＬ·ｇ－１），营养水中
酵母膏、蛋白胨、葡萄糖的用量分别为 ２２６，６０，２５４ｇ·Ｌ－１，营养水 ｐＨ６６；最佳的环境条件为：光照强度
４４００ｌｘ，每日光照时间１８ｈ，温度１８～２２℃。结论：用以上方法固体发酵生产虫草素，经过约１３ｄ的培养，培养基
中虫草素达到０６０％，比传统液体发酵方法的最高产量高近２倍，并且培养时间缩短２ｄ。
［关键词］ 虫草素；蛹虫草；固体发酵；生物制药
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１９２１５９０４
［收稿日期］ ２００７１１２７
［基金项目］ 重庆市卫生局医学科技项目（渝中医［２００１］２５号）
［通讯作者］ 李学刚，Ｔｅｌ／Ｆａｘ：（０２３）６８２５０７２８，Ｅｍａｉｌ：ｘｕｅ
ｇａｎｇｌｉ２０００＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
虫草素（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ，３′ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）为蛹虫
草的次生代谢产物［１］，有抗肿瘤、抗菌等多方面的
药理功效［２７］，并可作为核酸和染色体复制的终止
剂［８］，在生理生化研究方面有重要用途。目前，虫
草素主要从蛹虫草子实体中提取，但由于子实体生
产周期长，产量低，虫草素含量较低，故虫草素生产
成本极高，这已经成为制约虫草素进一步研究和开
发利用的瓶颈［９］。近年来，许多研究者试图通过蛹
虫草液体培养来提高虫草素的生产效率［１０１３］，其中
ＳｈｉｈＩＬ等通过大约１３ｄ的液体培养，使液体培养
基中虫草素达到大约０２３％［１３］，此为报道的世界上
虫草素生产的最高水平。本研究对蛹虫草固体发酵
过程中虫草素含量的动态变化进行了跟踪测定，对
影响虫草素含量的营养因子和环境因子进行了系统
优化，建立了一种高效生产虫草素的新方法。
１ 材料与方法
１．１ 供试菌株
试验菌株包括５个我国各地区普遍使用的蛹虫
草生产菌株：Ｃｍ００１（中国农业大学），２９１３（陕西宁
强食用菌开发公司），ＨＪ１（华中农业大学），Ｋ１（山
东虫草科技园），ＪＦ１（重庆市药物种植研究所自育
子实体生产高产品种）。
１．２ 固体发酵方法
１．２．１ 液体种子制备 培养液配方为水１Ｌ，马铃
薯２００ｇ，酵母膏１０ｇ，蛋白胨６ｇ，葡萄糖３０ｇ，
ＫＨ２ＰＯ４２ｇ，ＭｇＳＯ４０５ｇ。用２５０ｍＬ培养瓶装培养
液，每瓶装约 ８０ｍＬ，按照常规方法制备液体菌
种［１４］。
１．２．２ 固体发酵方法 用５００ｍＬ罐头瓶装培养
基，每瓶装大米３０ｇ、水３３ｍＬ。营养水的配方为：
水１Ｌ，葡萄糖２０ｇ，酵母膏５ｇ，蛋白胨６ｇ，ＫＨ２ＰＯ４
２ｇ，ＭｇＳＯ４０５ｇ。按照蛹虫草常规栽培方法进行固
体发酵培养［１５］。
１．３ 虫草素生产优良菌株的筛选和最佳收获生长
期的确定
将１．１所列５个菌株分别用１．２的方法进行固
体培养，每个菌株培养１００瓶。将蛹虫草生长过程
划分为下列６个生长期：菌丝满瓶期（ＦＭ期）、转色
期（ＣＣ期）、现蕾期（ＦＥ期）、子实体旺长期（ＦＢ
期）、孢子出现期（ＡＥ期）、子实体萎缩期（ＦＦ期）。
对各菌株各不同生长期中培养基和子实体的质量和
虫草素的含量进行跟踪测定，筛选出虫草素的高产
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菌株，确定收获提取虫草素的最佳生长期。
１．４ 培养基配方的优化
根据相关研究资料［１０１３］和实践经验，认为固体
培养基配方中下列５个因子会严重影响蛹虫草培养
过程中固体培养基中虫草素的含量：营养水和大米
的比值（ｍＬ·ｇ－１，以下简称水料比），营养水中酵母
膏、蛋白胨、葡萄糖的用量，营养水的ｐＨ。因此用正
交旋转组合试验设计［１６］来研究５个因子和培养基
中虫草素含量的关系，并根据该关系计算出最佳的
培养基配方和预测最高的虫草素含量。该试验采用
５因素５水平的试验设计方案，共需作３６个试验处理
（每个处理作１０个重复）。各因素试验水平见表１。
表１ 正交旋转组合设计的试验因素和水平
水平
Ｘ１
酵母膏
／ｇ·Ｌ－１
Ｘ２
蛋白胨
／ｇ·Ｌ－１
Ｘ３
葡萄糖
／ｇ·Ｌ－１
Ｘ４
水料比
／ｍＬ·ｇ－１
Ｘ５
ｐＨ
－２ ００ ００ ０ ０９ ５
－１ １２５ ２５ １０ １０ ６
０ ２５０ ５０ ２０ １１ ７
＋１ ３７５ ７５ ３０ １２ ８
＋２ ５００ １００ ４０ １３ ９
根据上述正交旋转组合设计的试验结果，通过
多重回归技术［１６］拟合下列２次多项式方程：
ｙ＝β０＋∑βｉｘ
２
ｉ＋βｉｊｘｉｘｊ （１）
其中，ｙ为培养基中虫草素的质量分数（％），β
为常数项，ｘ为自变量。
方程的可靠性用专用计算机软件 Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ５０
进行统计分析，拟合程度用决定系数 Ｒ２表示，显著
性检验用Ｆ检验。
１．５ 环境因子的优化
根据相关研究资料［１７］和实践经验，认为 ＦＭ期
到ＦＢ期是虫草素产生的关键时期，环境因子会对
培养基中虫草素含量产生重要影响，其中影响最大
的是下列３个因子：光照强度、每日光照时数、温度。
因此用正交试验来研究这３个因子和培养基中虫草
素含量的关系，并筛选出最佳的环境因子组合。该
试验采用３因素５水平试验设计，各试验因子的试
验水平见表２，按照Ｌ２５（５
６）正交表［１８］安排布置试验，
共需作２５个试验处理，每个处理作１０个重复。
１．６ 批量生产试验
按照上述试验确定的最佳生产方案，培养１０００
瓶蛹虫草，并对各生长期中培养基中虫草素的含量
进行跟踪测定，验证试验结果。
表２ 正交试验的因素和水平
水平 光照强度／ｌｘ 每日光照时间／ｈ 温度／℃
１ ２００ ０ １４
２ １６００ ６ １８
３ ３０００ １２ ２２
４ ４４００ １８ ２６
５ ５８００ ２４ ３０
１．７ 虫草素含量的测定
采用 ＨＰＬＣ对各样品的虫草素含量进行测定。
虫草素对照品购自 Ｓｉｇｍａ公司 （美国，批号
１２５Ｋ４０３，纯度９９６％）。仪器采用 ＬＣ－６ＡＤ高压
泵（日本）、ＰＲＥＰ－ＯＤＳＣ１８柱（日本）、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ
可变波长检测器（日本）。流动相为甲醇和水的混
合溶剂（２５∶７５），流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１，检测波长２６０
ｎｍ。
２ 结果与分析
２．１ 菌株筛选和最佳生长期的选择
５个试验菌株从接种到各生长期的生长天数见
表３。统计分析的结果表明，生长速度从慢到快依
次为２９１３，Ｃｍ００１，ＨＪ１，ＪＦ１，Ｋ１。培养基和子实
体中虫草素产量变化情况见图１，２。在各菌株的各
个生长时期，虽然子实体虫草素含量高于培养基，但
因为子实体的质量远远低于培养基，故培养基中虫
草素的产量远高于子实体，超过９０％的虫草素产量
存在于培养基中。因此，如果以虫草素生产为目的，
子实体中虫草素的产量可忽略不计。
表３ 各品种不同生长期的生长天数 ｄ
生长期 Ｃｍ００１ ２９１３ ＨＪ１ Ｋ１ ＪＦ１
ＦＭ ７ ７ ６ １１ ９
ＣＣ １０ １０ ９ １５ １２
ＦＥ １３ １４ １２ １９ １５
ＦＢ ２１ ２２ ２０ ３０ ２６
ＡＥ ３３ ３３ ３１ ４０ ４１
ＦＦ ４８ ４７ ４５ ５２ ５４
图１ 培养基中虫草素产量的动态变化
对５个菌株，各生长期均以 ＪＦ１的虫草素产量
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图２ 子实体中虫草素产量动态变化
为最高，培养基中虫草素产量均在 ＦＥ期达到最高
值。因此选定 ＪＦ１为虫草素生产的最佳菌株，以
ＦＥ期为收获提取虫草素的最佳生长时期。
２．２ 培养基配方的优化结果
对正交旋转组合设计试验的结果进行回归分
析，得到２次多项式方程：
Ｙ＝０３９８９＋００２Ｘ２＋００３０８Ｘ３－００１０８Ｘ４－００３５
Ｘ５－００２Ｘ１Ｘ２ －００１３８Ｘ２Ｘ５ －００１５Ｘ４Ｘ５ －００２０８Ｘ１２ －
００３７１Ｘ２２－００２８３Ｘ３２－００４４６Ｘ４２－００４４６Ｘ５２ （２）
该方程的决定系数计算结果为 Ｒ２＝０９７９。回
归检验结果表明，方程总回归达到极显著水平（Ｐ＜
００１），各项系数也达到显著水平（Ｐ＜０２５）。因
此，该方程是可靠的。依据该方程计算得知，各试验
因子分别取下列值时，虫草素可达到最高值
０４２％：水料比１１ｍＬ·ｇ－１，酵母膏用量２２６ｇ·
Ｌ－１，蛋白胨用量６０ｇ·Ｌ－１，葡萄糖用量２５４ｇ·
Ｌ－１，营养水ｐＨ６６。
２．３ 环境因子的优化结果
对正交设计试验结果的直观分析见表４。光照
强度、每日光照时数、温度均对虫草素含量均有显著
影响，最佳的环境因子组合为：光照强度取 ４水平
（４４００ｌｘ），每日光照时间取４水平（１８ｈ），温度取
２～３水平（１８～２２℃）。
表４ 正交试验直观分析表 ％
参数 光照强度 每日光照时间 温度
Ｋ１ ０２２６ ００１６ ０３２４
Ｋ２ ０２９４ ０３０２ ０３５２
Ｋ３ ０３２２ ０３６２ ０３５２
Ｋ４ ０４１０ ０４３８ ０２７０
Ｋ５ ０２９２ ０４２６ ０２４６
极差 ０１８４ ０４２２ ０１０６
注：Ｋｉ为各因素在ｉ水平时的平均虫草素质量分数
２．４ 批量生产试验结果
以ＪＦ１为生产菌株，按照最佳培养基配方和环
境条件进行虫草素批量生产试验的研究结果表明，
在此最优条件下，依次达到６个生长期的时间平均
分别为７，１０，１３，２５，３８，５３ｄ。培养基中虫草素含量
的动态变化情况见图３。统计分析结果表明，当生
长天数为１３ｄ（ＦＥ期）和２５ｄ（ＦＢ期）时，培养基中
虫草素达到最高值０６０～０６３％（此二者间没有显
著差异）。
图３ 批量生产试验中虫草素含量的动态变化
３ 结论与讨论
研究结果表明，如果采用 ＪＦ１为生产菌株，按
照优化的培养基配方和环境条件进行固体发酵生产
虫草素，经过大约１３ｄ的培养，培养基中虫草素的
可以达到０６０％以上。
此外，在试验中还观察到，当菌丝长满培养基
后，如果给予充足的光照，培养基就能在３ｄ内由白
色转变成黄色，颜色转变得越深，虫草素的含量就越
高；但如果不给予充足的光照，培养基就不能转色，
培养基中虫草素含量始终维持在极低的水平。因
此，推测培养基中虫草素的产生可能和菌丝体内的
光反应机制相关。目前，液体发酵是生产微生物药
物的主要手段。但当该方法应用于虫草素生产时，
淹没在液体培养基中的菌丝体难以得到充足的光
照，因此虫草素不能大量产生，这也是用液体发酵法
生产虫草素难以达到满意效果的原因。用本研究的
固体发酵方法生产虫草素，培养基中虫草素的含量
比报道的液体发酵的最高含量高近２倍，培养时间
缩短２ｄ，并且固体发酵生产设备简单，生产条件易
于控制。因此，本方法是一种高效生产虫草素的好
方法，对虫草素的进一步研究和开发利用具有重要
意义。
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ＷＥＩＨｕｉｐｉｎｇ１，２，ＹＥＸｉａｏｌｉ３，ＺＨＡＮＧＨｕａｙｉｎｇ２，ＬＩＸｕｅｇａｎｇ１，ＺＨＯＮＧＹｕｎｊｕｎ
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１６，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＰａｎｚｈｉｈｕａＣｏｌｅｇｅ，Ｐａｎｚｈｉｈｕａ６１７０００，Ｃｈｉｎａ；
３．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ＡｎｅｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏｐｒｏｄｕｃｅｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｂｙｓｏｌｉｄｃｕｌｔｕｒｅｕｓｉｎｇＣｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．
Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｄｕｒｉｎｇｖａｒｉｏｕｓｇｒｏｗｉｎｇｐｅｒｉｏｄｓｏｆｓｏｌｉｄｃｕｌｔｕｒｅｕｓｉｎｇ５ｓｔｒａｉｎｓｏｆＣ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｔｈｅｂｅｓｔ
ｓｔｒａｉｎａｎｄｏｐｔｉｍａｌｇｒｏｗｉｎｇｐｅｒｉｏｄｆｏｒｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅｎ，ｂｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｆｑｕａｄｒａｔｉｃｒｏｔａｔｉｏｎｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｄｅｓｉｇｎａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎ，ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｈｉｇｈｙｉｅｌｄｏｆｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．
Ｗｉｔｈｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｍｅｔｈｏｄｔｏｐｒｏｄｕｃｅｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｉｎｔｈｅｍｅｄｉｕｍｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｏ０．６０％，ｗｈｉｃｈｗａｓｎｅａｒｌｙ
２ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｙｉｅｌｄｒｅｐｏｒｔｅｄ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ；Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ；ｓｏｌｉｄｃｕｌｔｕｒｅ；ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｃｅｓｓｅｓ
［责任编辑 吕冬梅］
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