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Progressive studies of paeoniflorin

芍药苷研究进展



全 文 :芍药苷研究进展
孙丽荣,曹 雄,侯凤青,朱心红,高天明
(南方医科大学 神经生物学教研室,广东 广州 510515)
[摘要] 芍药苷为常用中药芍药的主要有效成分,是一种单萜类糖苷化合物。近年来,国内外学者对芍药苷
展开了较为深入的研究,发现芍药苷具有多种生物学效应,并且毒副作用较小;但在检测方法、药效功用等方面的
研究结果有很大差异。为了进一步开发其药用价值,揭示其药物配伍规律的物质基础,查阅了 PubMed、中国期刊
全文数据库有关芍药苷的研究,并结合作者的实验,从芍药苷的检测方法、药物代谢动力学、药理学及毒理学等方
面予以综合述评。
[关键词] 芍药苷;高效液相色谱;酶联免疫吸附;离子通道;受体;神经保护
[中图分类号]R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)18202805
[收稿日期] 20080320
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30672660)
[通讯作者] 朱心红,Tel:(020)61647112,Email:zhuxh@
fimmucom
  芍药苷(paeoniflorin,PF)是芍药的主要有效成分之一,
是一种单萜类糖苷化合物。国内外学者对PF展开了较为深
入的研究,发现其具有多种生物学效应,并且毒副作用较小。
但在检测方法、药效功用等方面的研究结果有很大差异。为
了进一步开发其药用价值,揭示其药物配伍规律的物质基
础,作者以“paeoniflorin”为关键词,在 PubMed上共检测到
208篇文献,以“芍药苷”为关键词,在中国期刊全文数据库
中共检测到453篇文献。依据这些研究成果,就 PF的检测
方法、药物代谢动力学、药理学及毒理学等方面的研究予以
综述。
1 PF的检测方法研究
由于白芍中PF的含量较高,检测较为容易,通常用高效
液相色谱法,中药复方制剂中也通常选用测定 PF的含量为
制剂质量标准。然而,PF进入体内后,在血浆、组织中的含
量微小,检测较为困难。因而,近些年来,研究者们为了深入
揭示PF的作用机制及药物作用的直接靶点,对微量样本中
PF的检测方法也作了系统研究,改进和发明了一些新的检
测方法。
11 高效液相色谱(HPLC)法
HPLC法仍然是检测血浆、组织中的 PF含量的主要方
法,但在样本制备、色谱条件、内标物的选择等操作环节上各
个实验室有很大的不同,直接影响样品中 PF的回收率(re
covery)、检测灵敏度(sensitivity)以及实验结果的可重复性。
111 样本制备 目前已建立了适宜于血浆、大脑皮层、海
马、心、肝、肾、脾、肺、睾丸等各种组织中PF的HPLC检测样
品制备方法。由于这些样品中蛋白含量丰富,因而去蛋白是
样品制备中的必要步骤,也是影响 PF回收率的关键环节。
通常采用的去蛋白方法有:35% ~75%的乙腈[12]、45%高
氯酸(pH072)[3]或磷酸二氢钠(pH50)酸化的醋酸乙
酯[4]处理样品后,13000r·min-1离心 10min,得上清液。
有研究表明用乙腈处理样品,PF的回收率较低且重复性差,
均不如用45%高氯酸处理[3]。由于PF在正常及碱性溶液
中易于离子化,因而样品酸化处理易于提高PF的回收率,但
目前没有不同酸化条件对 PF回收率影响的研究,尚不能够
确定PF提取时样本制备的最佳酸性条件。另外,液液萃取
(liquidliquidextraction)或固相萃取(solidphaseextraction)
等提取方式的不同也可能影响 PF的提取回收率。PF的水
溶性稍好、脂溶性差,因而采用二氯甲烷、己烷二氯甲烷异
丙醇混合液(20∶10∶1)、醋酸乙酯等液液提取方式提取 PF
的回收率很低,一般不超过17%。有研究发现采用固相萃
取能够提高样品中PF的回收率,再结合液质联用质谱分析
的检测方法,从而提高检测的灵敏度[1]。但固相萃取消耗较
大,操作步骤繁琐,加上液质联用质谱分析的检测方法所需
设备昂贵,导致该方法不利于推广。
112 色谱条件 检测血浆或组织样品中的 PF采用的色
谱条件为:C18色谱住;柱温(25±1)℃;检测波长 230nm。
但流动相以及流速的选择有较大的差别。常用的流动相有
甲醇水(68∶32)[5]、甲醇01% 甲酸水溶液(50∶50)[2]、梯
度乙腈01%甲酸水溶液[6]、乙腈01%磷酸缓冲液(18∶
83)[7]、乙腈水(14∶86)[3]、乙腈水醋酸(18∶82∶04)[4]、乙
腈005%甲酸水溶液(25∶75)[1]。有研究表明,流动相中加
入甲酸或缓冲液能够获得较好的峰型和分离效果[4,6]。流
动相的选择无疑是影响实验结果的重要因素,造成如此多样
流动相选择差异的原因,可能与样品的处理、HPLC检测设
备差异等的不同有关。作者采用 Agilent1200HPLC系统,
比较分析了乙腈水醋酸(18∶82∶04)、乙腈水(18∶82)以
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及乙腈水(14∶86)3种流动相(流速10mL· min-1)对经
45%高氯酸处理的同一血浆上样样品的色谱分离效果,结
果发现乙腈水(14∶86)的分离效果最好。流速的选择也是
影响色谱分析结果的原因,通常选用的流速为 10mL·
min,也有研究者选用 05mL·min-1或 02~03mL·
min-1[1]。原则上,流速越慢,色谱峰分离的效果越好,但流
速慢,必然导致检测时间延长,很难得到描述精密度(preci
sion)的重要指标,比如日间差异(intradailyvariances)、日内
差异(interdailyvariances)等。
113 内标物的选择 样品中加入内标物是提高实验重复
性、可靠性的重要手段。通常选用的内标物有己酮可可碱
(pentoxifyline)、胡黄连苦苷(picroside)等。有研究显示胡
黄连苦苷与PF在理化特性上相似,在 HPLC的检测中也呈
现相似的保留特性(retentionbehavior)[4]。内标物应于样品
去蛋白处理前加入,根据色谱峰面积先测出内标物的得率,
检验样品处理过程中造成的实验误差,进一步校正样品中
PF实际含量,从而提高实验的可重复性。
12 酶联免疫测定(enzymelinkedimmunosorbentassay)法
该方法最早由Shoyama于1984年提出,后又有所改进。
PF免疫原的制备是该方法的重要环节(8)。按照上述方法可
以得到多个单克隆抗体(monoantibody),这些抗体不仅能够
识别血浆中PF,还与芍药中其他化合物,如白芍苷(albiflor
in)、氧化芍药苷(oxypaeoniflorin)、苯甲酰芍药苷(benzoyl
paeoniflorin)等有交叉反应,从而影响了检测的特异性。进
一步的研究发现,其中一个单克隆抗体MAbC31B9能够较特
异性地识别PF和氧化芍药苷,经测序得到 MAbC31B9的重
链和轻链的序列,将其构建于pET28/scFv质粒中,再将该质
粒转染入大肠杆菌(Escherichiacoli)B21中进行蛋白扩增,即
得到特异性地识别PF和氧化芍药苷的抗体Fv段,从而大大
简化了酶联免疫测定的抗体制备过程[9]。与HPLC相比,该
方法具有较高的检测灵敏度,能够检测到血浆样品中纳克水
平的PF(HPLC检测灵敏度为微克水平),为研究治疗剂量
(05~40mg·kg-1)条件下PF的体内代谢过程提供了可能
的检测手段。
13 光反应探针(photoreactiveprobe)检测法
光亲和标记(photoafinitylabeling)技术是用于确定药物
与靶蛋白结合位点的一种技术,利用该技术不仅可以确定药
物作用的靶蛋白,还可以提供药物与靶蛋白结合的结构上的
信息。有研究者构建了PF生物素标记的光反应探针[10],可
能为揭示PF作用靶点的研究提供有益的检测方法。
2 药物代谢动力学研究
PF的体内代谢过程基本符合二室开放模型。给药途径
不同,PF的体内代谢过程亦不同。PF的口服生物利用度很
低,约3%~4%。研究表明,口服 PF在肠内菌的作用下产
生3种转化物,分别为PF代谢素(paeonimetabolin)Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ
(简称PMⅠ,Ⅱ,Ⅲ)。PF在24~30h内被完全代谢,此时
PMⅠ的产量最大,约相当于原药物PF的72%;其后PMⅠ
的产量逐渐减少。PMⅡ的代谢过程与 PMⅠ相似,但过程
缓慢,产量仅为PMⅠ的1/4。PMⅢ仅在转化的早期出现,
服药25h后就检测不到了[11]。Heikal等比较了 SD大鼠灌
胃给药05,5mg·kg-1后血浆PF与PMⅠ水平的时间变化
曲线,发现2种浓度下 PF,PMⅠ的血浆水平的变化曲线相
似。PF很快即达到最大血药浓度时间(tmax=116~133
min),此后血药浓度逐渐下降;而 PMⅠ达到最大血药浓度
的时间较长(tmax=60~80min),并且维持于较高的浓度水
平>4h。还发现,PMⅠ的最大血浆浓度是PF的2~5倍。
为了提高 PF的血浆浓度,有研究者发现药物配伍可以
明显提高PF的口服生物利用度。Liu等的研究发现 PF与
青藤碱(sinomenine)联合灌胃给予 SD大鼠,PF的血浆浓度
明显高于单纯灌胃给予PF,提示青藤碱具有提高PF的口服
生物利用度的作用[1213];进一步的研究发现,青藤碱能够抑
制肠道内P糖蛋白向肠腔内转运PF的功能,增强了肠道吸
收PF的能力,从而提高了 PF的口服生物利用度[14]。但也
有研究发现,芍药的解痉作用可能主要是 PMⅠ的作用,因
为PMⅠ的解痉作用明显优于 PF。此外,芍药甘草汤为治
疗腹痛的主要代表方剂,研究发现口服芍药甘草汤后,Wistar
大鼠血浆中PMⅠ的水平明显高于口服对应剂量的PF时血
浆PMⅠ水平[15],表明芍药甘草配伍可能促进了 PF向 PM
Ⅰ的转化,从而具有更好的解痉作用。这些结果提示:芍药
的有效组分可能被不同的药物配伍改变了,进而针对不同的
临床症状发挥不同的药理作用。
除了给药途径、药物配伍影响PF的药代动力学以外,生
物体的状态也可以影响PF的药代动力学。有研究者比较了
正常Wistar大鼠和双侧颈总动脉结扎造成的脑缺血再灌流
大鼠PF的体内代谢过程。结果发现,在脑缺血动物体内,
PF的血浆浓度明显升高、半衰期明显缩短、平均滞留时间延
长、清除率下降[16]。
3 药理学和毒理学研究
31 对离子通道的作用
离子通道是细胞膜上能够通透离子的一类跨膜蛋白质,
是许多化合物的作用靶点。研究表明,在 NG10815细胞系
(1种神经胶质瘤细胞系)上,PF能够阻断 L型钙通道(Cav
13),并呈剂量依赖性和活动依赖性,IC50为14μmol·L
-1,
300μmol·L-1浓度的PF几乎可以完全阻断 Cav13;而且
PF能够延长Cav13复活的时间,这可能是由于PF对Na+
K+通道也具有部分阻断作用,从而导致膜电位下降造成
的[17]。在急性分离的昆明种小鼠海马 CA1区神经细胞上,
PF能够阻断 Na+通道电流,并呈剂量依赖效应,IC50为271
μmol·L-1;但最大阻断效应仅为80%(PF浓度达到1mmol
·L-1)[18]。可见PF对 Cav13通道的阻断作用可能更为
敏感。
32 对受体的作用
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较早的研究发现,口服PF能够改善腹腔注射03mg·
kg-1M受体阻断剂东莨菪碱(scopolamine)造成的 Wistar大
鼠的空间学习记忆障碍,并呈剂量依赖性(001~1mg·
kg-1,口服)。进一步的研究发现,非选择性β受体阻断剂普
萘洛尔(propranolol)和 β1受体阻断剂阿替洛尔(atenolol)以
及α1受体阻断剂育亨宾(yohimbine)均能够阻断 PF对东莨
菪碱诱导的大鼠空间学习记忆障碍的改善作用;而 α2受体
阻断剂哌唑嗪(prazosin)没有类似的作用。由于这些受体阻
断剂本身并不能够造成大鼠的空间学习记忆障碍,也不能够
改善东莨菪碱诱导的大鼠空间学习记忆障碍,因而提示 PF
对M受体、β1受体和 α1受体可能具有类似激活的效应。在
成年大鼠(180~280g)离体脑片的研究表明,非选择性M受
体阻断剂东莨菪碱以及 M1受体阻断剂哌吡卓酮(pirenz
epine)均能够抑制突触长时程增强(longtermpotentiation,
LTP),而M2受体则没有此作用;PF(1μmol·L
-1)能够逆转
东莨菪碱、哌吡卓酮对LTP诱导的抑制效应;但对 LTP的诱
导没有作用[19]。提示 PF不是直接激活了 M1受体,而可能
是间接地阻断了由于 M受体抑制产生的效应,从而改善东
莨菪碱导致的大鼠空间学习记忆障碍。
腺苷A1受体(adenosineA1receptor)是 G蛋白偶联受
体,具有多种生物学效应。PF对腺苷 A1受体的作用,目前
报道的结果不一致。有研究表明,PF在03~10mg·kg-1
(腹腔注射,ip),能够呈现与腺苷 A1受体阻断剂(antago
nist)8环戊基1,3二丙基黄嘌呤(DPCPX)相似的药理效
应:逆转腺苷A1受体激动剂(agonist)氮6环戊基腺苷 (N6
cyclopentyladenosine,CPA)缩短的小鼠被动逃避反应(passive
avoidanceperformance)的潜伏期,并呈剂量依赖性。离体脑
片的研究还发现,腺苷(10μmol·L-1)能抑制 LTP的诱导,
而1μmol·L-1PF能够逆转腺苷的这一效应[20]。但多数研
究发现,PF可能对腺苷A1受体具有激动剂效应。PF(20mg
·kg-1,皮下注射,sc)能够增强CPA抗伤害性疼痛(antinoci
ceptive)的效应;也具有神经保护作用,这些药理效应能够为
DPCPX所阻断[2122]。受体竞争结合实验的研究发现,PF能
够与腺苷A1受体阻断剂乙基羧化腺苷(NECA)发生竞争性
结合,腺苷A1受体第 7跨膜段上的苏氨酸残基(threonine
residue)可能是他们的结合位点[22],提示 PF可能直接作用
于腺苷A1受体。造成上述实验结果不一致的原因可能与
PF的使用剂量与给药方法的不同有关;作者的研究也发现,
PF在1~10mg·kg-1呈现剂量依赖性的抗抑郁效应,但当
剂量>20mg·kg-1时该药理效应即消失[23]。
33 神经保护作用
关于PF的神经保护作用,系统性的研究工作来自朱兴
族教授的实验室。研究发现,在 SD大鼠大脑中动脉阻塞再
灌流(MCAO)脑缺血模型上,PF(25~10mg·kg-1,sc)能
够显著降低模型大鼠的死亡率,缩小缺血造成的大脑皮层的
梗死面积,改善大鼠的神经损伤状况以及空间学习记忆能
力[2225];在双侧颈总动脉结扎(2VO,4周)造成的慢性脑缺
血模型上,PF(125~25mg·kg-1,sc)能够显著改善由慢
性缺血造成的Wistar大鼠空间学习记忆障碍,并明显保护易
受损的海马 CA1区神经元[26]。在 6羟基多巴胺(6OH
DA)、四氢吡啶 (MPTP)等造成的帕金森疾病(Parkinson's
disease)啮齿类动物模型上,PF能够保护黑质(SNc)多巴胺
能神经元,显著改善动物的运动能力[2728]。尤为重要的是
研究发现,静脉注射PF,在10~160mg·kg-1内对清醒状态
的大鼠的平均动脉血压、心率、体温等均无影响,而注射腺苷
A1受体的激动剂 CPA025mg·kg-1即可造成大鼠平均动
脉血压和心率的显著下降[22]。另外,在离体培养的皮层神
经元损伤模型上,有研究发现PF能够对抗由咖啡因、谷氨酸
或高钾等造成的神经损伤[29]。但目前还没有关于 PF在离
体培养的皮层或海马神经元糖氧剥夺神经损伤模型上的神
经保护作用的研究报道,而糖氧剥夺神经损伤模型才是最
为公认的模拟脑缺血缺氧造成神经损伤的离体模型。
关于PF作用机制的研究表明:PF可能通过抑制星形胶
质细胞的激活、增强 ATP敏感的钾通道的表达从而降低细
胞膜的兴奋性、增强脑源性营养因子(BDNF)的表达以及抑
制细胞色素 C的释放、NKκB的激活等多个环节而发挥神
经保护作用[2526]。但由于尚不清楚 PF的作用靶点,因而目
前还不清楚PF神经保护作用的明确机制。
34 抗伤害性疼痛的作用
有研究报道,PF(5~100mg·kg-1,ip)能够显著降低蜂
毒引起的疼痛反应,这一效应能被鸦片受体阻断剂盐酸纳洛
酮(naloxone)所阻断[30];但 PF(5~20mg·kg-1,sc)对机械
压迫造成的伤害性疼痛没有作用[21]。PF对抗炎性疼痛可
能与其抗炎作用有关,因为有研究发现 PF能够减轻 SD大
鼠佐剂性关节炎的症状,抑制腹腔巨噬细胞的吞噬功能以及
炎性因子的产生[31]。
35 PF的其他药理作用
近些年来的研究还发现PF具有保肝作用[32];能够抑制
肺癌A549细胞系细胞的分裂[33];能够刺激培养的脂肪细胞
释放腺苷从而促进糖代谢[34];能够保护培养的胸腺细胞免
受放射损害[35]。但也有研究发现,PF对放射造成的海马
CA1区神经损伤没有保护作用[36]。
36 PF的细胞毒性检验
有研究表明在培养的正常胸腺细胞中加入01~1000
mg·L-1的PF没有发生毒性反应[35];在 U937细胞系(人骨
髓单核细胞系)中加入160~640mg·L-1浓度的PF也没有
发生毒性反应[37]。但作者的研究发现,在 HEK293细胞系
上,当PF的终浓度 >500μmol·L-1(相当于24023mg·
L-1)时即可导致细胞的死亡。结果提示针对不同的细胞,
PF可能呈现不同的毒性反应。
4 小结
PF是中药芍药的主要有效成分,研究已经发现其具有
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多种生物学效应,但目前尚不清楚针对不同的生物学效应,
真正起效的是PF本身,还是其代谢产物,因为 PF的药物代
谢动力学研究发现PF的口服生物利用度很低,即使是静脉
给药,PF也很快代谢为 PMⅠ。另外,由于检测手段的局
限,目前还不清楚PF的作用靶点。因而,阐明 PF及其代谢
产物的作用靶点及其信号转导机制,可能为认识中药芍药的
药理作用,发现其药用价值,揭示其药物配伍规律的物质基
础提供指导。
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Progressivestudiesofpaeoniflorin
SUNLirong,CAOXiong,HOUFengqing,ZHUXinhong,GAOTianming
(DepartmentofNeurobiology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)
[Abstract] PaeoniflorinisoneofthebioactivecomponentsofPaeonialactiflora,atraditionalChineseherbalmedicineItisthe
mainmonoterpeneglucosideisolatedfromthePlactiflorain1963Sincethen,researchershavefoundthatpaeoniflorinhasmultifold
pharmacologicalefectsInthisreview,basedontherecentavailablepaperspublishedinPubMedandNationalKnowledgeInfrastruc
tureDataBase,wepresentthemajorcurentapproachesinunderstandingthedetectionmethodology,pharmacokineticsandpharmacol
ogy,andtoxicologyofpaeoniflorin
[Keywords] paeoniflorin;highperformanceliquidchromatography;enzymelinkedimmunosorbentassay;ionchannel;recep
tor;neuroprotection
[责任编辑 古云侠
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·2302·
第33卷第18期
2008年9月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 18
September,2008