全 文 ：ＲＰＨＰＬＣ测定开口箭中２个皂苷的含量
周　媛，邹　坤，喻玲玲，秦双玖，徐兰兰，刘　闯
（三峡大学 化学与生命科学学院 天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌 ４４３００２）
［摘要］　目的：建立同时测定开口箭干燥根茎中２个甾体皂苷５βｆｕｒｏｓｔΔ２５（２７）ｅｎ１β，２β，３β，４β，５β，７α，２２ζ，
２６ｏｃｔａｏｌ６ｏｎｅ２６ＯβＤｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（皂苷１）和５βｆｕｒｏｓｔΔ２５（２７）ｅｎ１β，２β，３β，４β，５β，６β，７α，２２ζ，２６ｎｏｎａｏｌ２６
ＯβＤｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（皂苷２）含量的ＲＰＨＰＬＣ测定法。方法：色谱柱为ＹＭＣＰａｃｋＯＤＳＡＱ（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５
μｍ），以乙腈水的梯度流动相洗脱，检测波长 ２０３ｎｍ，流速 １ｍＬ·ｍｉｎ－１，柱温 ３０℃。结果：皂苷 １，２分别在
７５５～６０４０μｇ，８０～４８０μｇ呈良好的线性关系（ｒ＝０９９９６），平均回收率分别为９８６１％和９８３３％。结论：可
通过该方法同时测定开口箭干燥根茎中甾体对照品１，２的含量，为开口箭药材的质量控制提供了可行的方法。
［关键词］　开口箭；皂苷；含量测定；ＲＰＨＰＬＣ
［中图分类号］Ｒ２８４．１　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１５３０２（２００８）２２２６４７０４
［收稿日期］　２００８０２１９
［基金项目］　国家自然科学基金项目（３０６７０２１３）；三峡大学重
大科研项目 （２００５ＺＤ００７）；神农架林区政府科技攻关项目
（ＳＤＨ２００２２１）
［通讯作者］　邹坤，Ｔｅｌ：（０７１７）６３９７４７８，Ｅｍａｉｌ：ｋｚｏｕ＠ｃｔｇｕ．
ｅｄｕ．ｃｎ
　　开口箭ＴｕｐｉｓｔｒａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＢａｋ．为百合科 Ｌｉｌｉａｃｅ
ａｅ植物开口箭的干燥根茎，主产于三峡库区及神农
架林区，味甘微苦，性寒，具有清热解毒，消肿止痛，
散瘀止血功效，对咽喉炎、扁桃体炎，疗效显著［１］，
在土家族聚居地区和神农架林区民间享有盛誉。
本实验室对神农架产开口箭的生药学、化学
成分和药理活性进行了研究，结果表明开口箭正
丁醇提取物和部分单体化合物具有良好的细胞毒
活性和抗炎活性［２８］，而且开口箭根茎中甾体皂苷
元的含量较高［９］。本研究索建立了 ＲＰＨＰＬＣ同时
测定开口箭干燥根茎中 ２个含量较大、具有一定
活性的新的甾体皂苷［１０］５βｆｕｒｏｓｔΔ２５（２７）ｅｎ１β，
２β，３β，４β，５β，７α，２２ζ，２６ｏｃｔａｏｌ６ｏｎｅ２６ＯβＤ
ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（皂苷 １）和 ５βｆｕｒｏｓｔΔ２５（２７）ｅｎ１β，
２β，３β，４β，５β，６β，７α，２２ζ，２６ｎｏｎａｏｌ２６ＯβＤ
ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（皂苷２）的定量分析方法。该方法
简便快速，分离度好，准确度高。可为开口箭质量
控制提供参考。
１　仪器与试药
Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱系统（２６９０型四元梯度
泵、９９６型紫外可见二极管阵列检测器，美国 Ｗａｔｅｒｓ
公司），ＭＥ２１５Ｓ型１／１０万电子天平（德国 Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ
公司）；ＳＺ－９３自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化
仪器厂）；乙腈、甲醇为色谱纯（ｆｉｓｈｅｒ公司），水为二
次蒸馏水（自制）。
开口箭根茎采自湖北省神农架林区，其原植物
标本于２００２年７月采自同一地区，经三峡大学化学
与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为 Ｔ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ，
原植 物 及 药 材 现 保 存 于 本 实 验 室 （编 号
ＴＣ２００２０７ＳＮＪ）。
皂苷１和皂苷２，为本实验室自开口箭中分离
得到，其化合结构经（ＵＶ，ＥＳＩＭＳ，１ＨＮＭＲ，１３Ｃ
ＮＭＲ和２ＤＮＭＲ）波谱学分析鉴定［１０］。以ＨＰＬＣ面
积归一化法测定其质量分数均大于９８％。
２　方法与结果
２．１　色谱条件　ＹＭＣＰａｃｋＯＤＳＡＱ（４６ｍｍ×２５０
ｍｍ，５μｍ）色谱柱；柱温３０℃；流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１；
检测波长２０３ｎｍ；进样量２０μＬ；流动相为乙腈（Ｂ）
水（Ａ）梯度流动相，见表１。通过加标确定了皂苷
１，２的保留时间与供试品中皂苷１，２的保留时间一
致，皂苷１，２的保留时间分别为１８２３ｍｉｎ和１６５８
ｍｉｎ，供试品中皂苷１，２达到有效分离，分离度大于
１５。
２．２　对照品溶液制备　分别精密称取皂苷１，２各
适量，分别置于５ｍＬ量瓶中，用甲醇溶解并定容至
刻度，配制成约含皂苷１，２１５０ｇ·Ｌ－１的溶液，低
温避光保存备用。
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表１　梯度洗脱程序
ｔ／ｍｉｎ Ｂ／％ Ａ／％ ｔ／ｍｉｎ Ｂ／％ Ａ／％
０ １０ ９０ ３１ ２３ ７７
５ １５ ８５ ３５ ２５ ７５
１５ ２０ ８０ ５５ ５０ ５０
２０ ２２ ７８ ８５ １００ ０
２５ ２２ ７８ ９０ １００ ０
２８ ２３ ７７
Ａ．对照品１；Ｂ．对照品２；Ｃ样品；１．皂苷１；２．皂苷２
图１　皂苷１，２及样品的ＨＰＬＣ图
２．３　供试品溶液的制备　取开口箭粉末（６０目筛，
５０℃烘干）约２０ｇ，精密称定，置１０ｍＬ具塞试管
中，精密加入７５％甲醇１０ｍＬ，密塞，摇匀，称重，于
６０℃水浴，超声提取６０ｍｉｎ，称重，补足减重，离心
（转速 ４０００ｒ·ｍｉｎ－１）沉淀１５ｍｉｎ，上清液以０４５
μｍ微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
２．４　线性关系考察　分别精密吸取皂苷１溶液５，
１０，１５，２０，２５，３０，４０μＬ，皂苷２溶液５，１０，１５，２０，
２５，３０Ｌ，４０μＬ，每体积进样３次，按２．１色谱条件
测定峰面积。以进样量质量（Ｘ，μｇ）为横坐标，色谱
峰面积（Ｙ，ＡＵ）为纵坐标，进行线性回归。得对照
品１，２的回归方程 Ｙ＝１５９６×１０５Ｘ，ｒ＝０９９９６和
Ｙ＝１０８１×１０５Ｘ＋９８，ｒ＝０９９９６。皂苷１，２的线性
范围分别为７５５～６０４０μｇ和８０～４８０μｇ。
２．５　精密度试验　分别吸取皂苷１溶液和皂苷２
溶液各２０μＬ，按２．１色谱条件各连续进样６次，测
定峰面积，计算ＲＳＤ分别为１５％，０９７％。表明仪
器的精密度良好。
２．６　重复性试验　精密称取６份开口箭药材粉末
各２０ｇ，按２．３方法平行制备，在上述色谱条件下
进行分析，分别计算开口箭样品中皂苷１，２的质量
分数，其ＲＳＤ皆为１４％。
２．７　稳定性试验　精密吸取供试品溶液２０μＬ，分
别在０，４，１２，２４，３６，４８ｈ进样分析，分别测定色谱
峰峰面积。结果皂苷 １，２峰面积的 ＲＳＤ％皆为
３０％。表明４８ｈ内供试品溶液稳定性良好。
２．８　回收率试验　精密称取已知皂苷１和２含量
的样品９份，每份１ｇ，置１０ｍＬ具塞试管中，平均分
为３组。各样品分别精密加入已知浓度的对照品溶
液适量，按供试品溶液制备方法平行制备。按２１
项下色谱条件，分别进样２００μＬ进行测定。结果
皂苷１，２的平均回收率（ｎ＝９）分别为 ９８６１％和
９８３３％。ＲＳＤ分别为 １７％和 １７％。结果见表
２。
２．９　样品分析　取开口箭粉末（６０目筛，５０℃烘
干至恒重）约２０ｇ，６份，精密称定，按２．３项下方
法制备供试品溶液。按上述色谱条件进行分析测
定。以２０μＬ进样，测定色谱峰峰面积，根据标准曲
线计算样品中皂苷１，２的质量分数。皂苷１平均质
量分数为２６０７ｍｇ·ｇ－１，ＲＳＤ１８％，皂苷２平均
质量分数为２４２５ｍｇ·ｇ－１，ＲＳＤ２６％。
３　讨论
３．１　供试品制备方法的考察　本实验比较了不同
浸提方法（冷浸、回流和不同温度下超声）和不同提
取时间（３０，４５，６０ｍｉｎ）的提取效果，考察了不同溶
剂（甲醇，甲醇水，乙醇，乙醇水，先石油醚处理后
甲醇提取）以及不同固液比的提取率，发现采用６０
℃超声浸提６０ｍｉｎ，固液比为１∶５，提取溶剂为７５％
甲醇的提取条件，具有最佳的提取效率，能够提出开
口箭的主要成分甾体皂苷化合物。
３．２　色谱条件的选择　在实验中对不同波长、柱温
和流速进行了考察，发现在低检测波长２０３ｎｍ处开
口箭中主要成分甾体皂苷类化合物有较强的紫外吸
收，各色谱峰之间分离效果较好。为了能在适宜的
分析时间内获得指标成分的完全分离，在实验中对
流动相体系进行了反复摸索，分别用甲醇水、乙腈
水、乙腈醋酸水、乙腈磷酸水等体系进行洗脱，发
现甲醇水洗脱基线不平稳，分离度差，而乙腈醋酸
水和乙腈磷酸水体系的分离效果同乙腈水体系的
分离效果相比较并没有进一步改善，且对色谱柱有
一定的损害。故最终确定用乙腈水体系为流动相。
本实验采用的供试品溶液为粗提液，为保护色谱柱
故选用流动相从乙腈水（１０％）到乙腈（１００％）的
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　　 表２　皂苷１，２回收率（ｎ＝９）
加入量／ｍｇ·ｇ－１
１ ２
测得量／ｍｇ·ｇ－１
１ ２
回收率／％
１ ２
平均值／％
１ ２
ＲＳＤ／％
１ ２
１９２５ ２０４０ ４４８４ ４２４６ ９８９４ ９５１０ 　 　 　 　
　 　 ４３１９ ４３８７ ９５２６ ９８２６ 　 　 　 　
　 　 ４４３２ ４３５４ ９７８０ ９７５２ 　 　 　 　
３８５０ ４０８０ ６２０４ ６４３１ ９６０９ ９８８６ ９８６１ ９８３３ １７ １７
　 　 ６３６８ ６４０１ ９８６２ ９８４１ 　 　 　 　
　 　 ６３３４ ６５７６ ９８１０ １０１１０ 　 　 　 　
７７００ ８１６０ １０２７１ １０３３０ ９９６４ ９７６０ 　 　 　 　
　 　 １０３３３ １０３１５ １００３０ ９７４５ 　 　 　 　
　 　 １０６０５ １０６６２ １０２９０ １００７０ 　 　 　 　
　　注：样品中皂苷１质量分数为２６０７ｍｇ·ｇ－１，皂苷２样品中质量分数为２４２５ｍｇ·ｇ－１
梯度洗脱。并保持足够的洗脱时间（９０ｍｉｎ），可将
强保留物质洗脱下来。同时为保证皂苷１，２应达到
有效分离，在其色谱峰的保留时间段保持微小的梯
度变化。
［参考文献］
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ｆｒｏｍＴｕｐｉｓｔｒａｃｈｉｎｅｎｓｉｓｒｈｉｚｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００７，１２：
２０２９．
ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｓａｐｏｎｉｎｓｉｎＴｕｐｉｓｔｒａｃｈｉｎｅｎｓｉｓｒｈｉｚｏｍｅｓｂｙ
ＲＰＨＰＬＣ
ＺＨＯＵＹｕａｎ，ＺＯＵＫｕｎ，ＹＵＬｉｎｇｌｉｎｇ，ＱＩＮＳｈｕａｎｇｊｉｕ，ＸＵＬａｎｌａｎ，ＬＩＵＣｈｕａｎｇ
（ＨｕｂｅｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ
ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｉｎａＴｈｒｅｅＧｏｒｇｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｃｈａｎｇ４４３００２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｄｅｖｅｌｏｇａｎＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｎｅｗｓａｐｏｎｉｎｓｉｎｔｈｅｄｒｉｅｄｒｈｉｚｏｍｅｓｏｆＴｕｐｉｓｔｒａ
ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎＹＭＣＰａｃｋＯＤＳＡＱ（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ｅｌｕｔｅｄｗｉｔｈｏｆａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅａｎｄ
ｗａｔｅｒｉｎｇｒａｄｉｅｎｔｍｏｄｅ．Ｔｈｅｃｏｎｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅｉｎｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｃｈａｎｇｅｓｆｒｏｍ１０％ ｔｏ１００％ ｗｉｔｈｉｎ８５ｍｉｎｕｔｅｓ．Ｔｈｅｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓｓｅｔａｔ２０３ｎｍ．Ｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１００ｍＬ·ｍｉｎ－１ａｎｄｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓｓｅｔａｔ３０℃．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｌｉｎｅａｒ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆｔｗｏａｕｔｈｅｎｔｉｃｓａｐｏｎｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｗｉｔｈｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｆｒｏｍ７５５μｇｔｏ６０４０μｇ（ｒ＝０９９９６）ａｎｄ８００μｇｔｏ
４８００μｇ（ｒ＝０９９９６），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｕｓｉｎｇｔｈｅｍｅｔｈｏｄａｂｏｖｅ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔｗｏｓａｐｏｎｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｓ０２６１％ ａｎｄ
０２４２％，ｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓａｓ９８６％ ａｎｄ９８３％ ｗｉｔｈＲＳＤ１７％ ａｎｄ１７％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄｒｅｌｉａ
ｂｌｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｗｏｓａｐｏｎｉｎｓｉｎｔｈｅｄｒｉｅｄｒｈｉｚｏｍｅｓｏｆＴｕｐｉｓｔｒａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｔｕｐｉｓｔｒａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ；ｓａｐｏｎｉｎｓ；ａｓｓａｙ；ＲＰＨＰＬＣ
［责任编辑　王亚君］
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