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Analysis of genetic diversity of wild Rehmannia glutinosa by
using RAPD and ISSR markers

野生地黄种内遗传多样性的RAPD,ISSR分析



全 文 :·研究论文·
野生地黄种内遗传多样性的 RAPD,ISSR分析
王 艳1,2,李先恩2,李学东1,祁建军2,孙 鹏3,周丽莉2
(1.首都师范大学 生命科学学院,北京 100037;
2.中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所,北京 100094;
3.中国农业大学 农学与生物技术学院,北京 100094)
[摘要] 目的:分析野生地黄群落之间的遗传差异类型,比较RAPD和ISSR分子标记在分析地黄野生种质遗
传多样性中的应用。方法:应用RAPD和ISSR分子标记技术,对55份地黄材料进行了遗传差异分析。结果:平均
每条RAPD引物扩增出1600条带,平均每条 ISSR引物扩增出1908条带,多态性位点百分率分别为8958%和
9432%;聚类分析表明,55份地黄分成7大类群。结论:野生地黄具有丰富的遗传多样性;不同地理居群的相似性
为063~098;ISSR标记比RAPD标记能检测到地黄种内更高的遗传差异性。
[关键词] 地黄;种质;遗传多样性;RAPD;ISSR
[中图分类号]R282.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)22259105
[收稿日期] 20071222
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30472155);北京市自然
科学基金项目(5062035)
[通讯作者] 祁建军,Tel:(010)62810019,Email:jq_8@
hotmail.com
  地黄Rehmanniaglutinosa为玄参科 Scrophulari
aceae地黄属Rehmannia多年生草本植物[1],其膨大
的块根可以加工成鲜地黄、生地(黄)和熟地(黄)3
种[2],是常用传统补益中药。地黄的主要药用成分
是梓醇,有清热生津、凉血润燥、滋阴补肾、调经补血
等功效,是许多有名的中成药的主要成分。
地黄属植物有6个种,即地黄 R.glutinosa,茄
叶地黄R.solanifolia,湖北地黄R.henryi,高地黄R.
elata,裂叶地黄 R.piasezki,天目地黄 R.chingi,其
中仅地黄1个种可供药用。药用地黄几乎全部来源
于人工栽培,遗传基础狭窄,而地黄的野生分布最
广,长江以北的大部分地区均有分布,而且野生地黄
外观形态差异很大。一般来说植物的野生品种具有
丰富的遗传多样性,并且携带有许多决定重要经济
性状的优异基因,但由于这些基因常常与不良基因
连锁,加上野生种质鉴定难,不易进行杂交育种,使
这些基因的利用具有许多困难。本研究利用 RAPD
和ISSR技术对野生地黄进行遗传多样性分析[36],
从分子水平上认识各个品种间的遗传关系,为野生
地黄合理开发利用与新品种选育等提供理论依据。
1 材料
实验所用55份地黄材料收集于河南、山东、北
京和陕西等地,其中选择4份栽培类型和3份变异
类型作为参照,以便更好地确定野生地黄材料间的
遗传关系。供试材料的基本信息见表1。
2 方法
2.1 DNA提取 取地黄幼嫩叶片流水洗干净后再
用无菌水洗净晾干,液氮研磨,采用DNAsecurePlant
Kit[天根生化科技(北京)有限公司]试剂盒提供的
方法提取基因组 DNA。DNA样品经08%琼脂糖
凝胶电泳检测。
2.2 RAPD反应 RAPD反应体系:模板 DNA20
ng,引物08μmol·L-1,1×PCRbufer(10mmol·
L-1TrisHCl,pH88;50mmol·L-1 KCl;008%
NonidetP40),MgCl22mmol·L
-1,dNTPs02mmol
·L-1,Taq酶25U,灭菌双蒸水14μL,反应总体
积25μL。其中,RAPD引物由上海生工生物工程技
术服务有限公司合成;10×PCRbufer,MgCl2,
dNTPs,Taq酶均购自上海生工生物工程技术服务有
限公司。扩增反应在梯度 PCR仪(Tgradient96Bi
ometra)上进行。扩增程序为94℃ 4min;94℃ 30
s,36℃ 45s,72℃ 1min,共40个循环;72℃延伸
10min。扩增产物于15%琼脂糖凝胶电泳检测,以
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   表1 供试地黄材料的基本信息
No. 收集地点 来源 No. 收集地点 来源
ny1 河南南阳 野生 rzh4 山东日照 野生
ny2 河南南阳 野生 rzh5 山东日照 野生
xx1 河南西峡 野生 bo'ai1 河南博爱 野生
xx2 河南西峡 野生 bo'ai2 河南博爱 野生
xx31 河南西峡 野生 bo'ai3 河南博爱 野生
xx33 河南西峡 野生 bo'ai4 河南博爱 野生
xx4 河南西峡 野生 bo'ai5 河南博爱 野生
xx6 河南西峡 野生 qy1 河南沁阳 野生
shx11 陕西扶风 野生 qy2 河南沁阳 野生
shx12 陕西扶风 野生 qy4 河南沁阳 野生
shx13 陕西扶风 野生 qy5 河南沁阳 野生
shx21 陕西扶风 野生 qy6 河南沁阳 野生
shx22 陕西扶风 野生 qy7 河南沁阳 野生
shx23 陕西扶风 野生 qy8 河南沁阳 野生
shx24 陕西扶风 野生 qy9 河南沁阳 野生
py4 山东平阴 野生 df2 河南登封 野生
pyPG2 山东平阴 野生 fx7 山东费县 野生
pyPG1 山东平阴 野生 bjysh1 北京海淀 野生
py6 山东平阴 野生 shdysh 山东   野生
py5 山东平阴 野生 855 北京海淀 栽培
fx 山东费县 野生 9302 北京海淀 栽培
fxFG3 山东费县 野生 bjysh2 北京海淀 野生
tsh1 山东泰山 野生 bjyihao 北京海淀 栽培
tsh2 山东泰山 野生 jzhyuan 北京海淀 栽培
tsh3 山东泰山 野生 0517 北京海淀 变异
rzh1 山东日照 野生 0526 北京海淀 变异
rzh2 山东日照 野生 0537 北京海淀 变异
rzh3 山东日照 野生      
HBIreadyload125bpladderDNAmarker(北京科昊
泽生物技术有限公司)为相对分子质量标记,在凝
胶成像系统上拍照。
2.3 ISSR反应 ISSR反应体系为 25μL:模板
DNA20ng,引物08μmol·L-1,1×PCRbufer(10
mmol·L-1TrisHCl,pH88;50mmol·L-1KCl;
008% NonidetP40),MgCl22mmol·L
-1,dNTPs
02mmol·L-1,Taq酶25U,灭菌双蒸水14μL。
其中,ISSR引物由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成;10×PCRbufer,MgCl2,dNTPs,Taq酶均
购自上海生工生物工程技术服务有限公司。扩增反
应在梯度 PCR仪(Tgradient96Biometra)上进行。
扩增程序为94℃4min;94℃30s,53~55℃45s,
72℃ 1min,共40个循环;72℃延伸10min。扩增
产物于 15%琼脂糖凝胶电泳检测,以 HBIready
load125bpladderDNAmarker(北京科昊泽生物技
术有限公司)为相对分子质量标记,在凝胶成像系
统上拍照。
2.4 数据统计与分析 RAPD和 ISSR都是显性标
记,同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被
认为具有同源性,同一位点以带的有“1”和无“0”记
录电泳条带,得到0,1矩阵。用NTSYSpc212软件
进行数据分析。对原始矩阵用其中的SimQual程序
求DICE相似系数矩阵,用其中的SHAN程序和UP
GMA方法进行聚类分析。
3 结果与分析
3.1 地黄基因组DNA提取 按上述方法所提取的
DNA色泽为白色或无色,说明大多数酚类、糖类、蛋
白质等物质已被去除。地黄基因组 DNA琼脂糖凝
胶电泳图谱见图1(部分供试材料的基因组 DNA),
可以看出,各条带整齐、清晰、明亮、基本无降解、完
整性好,说明所提取的 DNA质量较高,完全能达到
RAPD和ISSR分析的要求。
M1.100ngλDNA;M2.200ngλDNA;1~10.样品
图1 地黄基因组DNA08%琼脂糖凝胶电泳图谱
3.2 RAPD和ISSR标记的扩增结果及多态性分析
 从60个RAPD引物和50个 ISSR引物中分别筛
选出12个RAPD多态性高的引物和12个 ISSR多
态性引物。用筛选出的引物对55份供试地黄材料
的基因组DNA进行了RAPD和ISSR扩增。引物序
列及扩增结果见表2,部分材料的扩增图谱见图2。
RAPD引物扩增的条带数为11~20条,平均每条引
物扩增出16条带,平均多态性条带有1433条,多
态性位点为 8958%;ISSR引物扩增的条带数为
15~24条,平均每条引物扩增出1908条带,平均多
态性条带有 18条,多态性位点 9432%。结果表
明,RAPD和 ISSR标记揭示出55份地黄材料之间
有较高的遗传多态性,ISSR标记得到的多态性位点
百分率高于RAPD标记。
3.3 聚类分析 依据 RAPD和 ISSR标记,利用
UPGMA法对55份地黄材料进行聚类分析见图3,
4。2种方法聚类结果稍有差异。图3中,在遗传相
似系数为 0767时,全部材料分成 7大类群;图 4
中,在遗传相似系数为0736时,全部材料分成6大
类群。2个聚类结果中,第Ⅰ,Ⅱ类群的材料组成完
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表2 RAPD引物和ISSR引物对55份地黄材料的扩增结果
引物
RAPD
序列(5′3′) 总带数 多态性带数 多态位点/%
引物
ISSR
序列(5′3′) 总带数 多态性带数 多态位点/%
S127 CCGATATCCC 12 12 10000 808 (AG)8C 15 12 8000
S168 TTTGCCCGGT 16 15 9375 809 (AG)8G 15 13 8667
S200 TCTGGACGGA 11 9 8182 810 (GA)8T 19 19 10000
S242 CTGAGGTCTC 17 17 10000 811 (GA)8C 20 20 10000
S415 GACCTACCAC 14 13 9286 812 (GA)8A 18 18 10000
S439 GTCCGTACTG 19 18 9474 824 (TC)8G 22 22 10000
S460 ACACACGCTG 17 14 8235 840 (GA)8YT 20 20 10000
S465 CCCCGGTAAC 18 15 8333 841 (GA)8YC 20 18 9000
S482 TCTGTCGGTC 12 12 10000 850 (GT)8C 23 22 9565
S483 GGTCACCTCA 18 16 8889 868 (GAA)8 24 23 9583
S485 CCGCGTCTTG 20 17 8500 873 (GACA)4 18 15 8333
S486 GAGCGCCTTG 18 14 7778 874 (CCCT)4 15 14 9333
Mmarker;1~26.样品
图2 RAPD引物S486(A)和ISSR引物868(B)对部分
地黄材料的扩增
全一致;图4将855,9302,bjysh2聚为一类,图3将
这3份材料与来自博爱、沁阳等地的野生材料聚为一
类;图3中,bjyihao和jzhyuan分别聚为一类,图4中,
二者则聚为一类。
将RAPD和 ISSR标记的总数据相结合,利用
UPGMA法对 55份地黄材料进行聚类分析见图 5。
在遗传相似性系数为075时,55份地黄材料分为7
大类群。分别为第Ⅰ类群包括11份材料。这些材料
株形大多为平展型,浅绿色、椭圆形叶,波状叶缘。其
中,xx2和 xx31的遗传相似性系数达到098,说明
二者的亲缘关系极近,可能属于同一品种;第Ⅱ类群
包括15份材料。这些材料大多表现为平展型,深绿
色、椭圆形叶,波状叶缘;第Ⅲ类群包括日照的除rzh1
外的4份材料。这4份材料都是平展型,椭圆形叶,
波状叶缘;第Ⅳ类群包括博爱、沁阳、登封、费县、山
东、北京的野生品种和855,9302,共20份材料。其
中,来自地黄道地产区博爱和沁阳的材料很明显地聚
  
图3 基于RAPD标记的55份地黄材料的聚类图
在一起。除了登封和费县的2份材料是半直立型外,
其余材料都是平展型;第Ⅴ类群包括3个变异类型
0517,0526,0537。为平展型,椭圆形叶;第Ⅵ类群仅
bjyihao1个品种。为半直立型,深绿色、椭圆形叶,波
状叶缘;第Ⅶ类群仅jzhyuan1个品种。为半直立型,
浅绿色、卵圆形叶,波状叶缘。结果充分说明同一地
域分布的地黄材料亲缘关系较近。
4 讨论
4.1 地黄 RAPD和 ISSR标记及其遗传多样性 本
研究中RAPD和ISSR标记的多态性位点百分率分别
为8958%,9433%,有效地反映了55份地黄材料
间丰富的遗传多样性。研究结果表明,RAPD和ISSR
技术用于地黄遗传多样性分析是有效的,ISSR标记
比RAPD标记能检测到更高的品种间遗传差异。
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图4 基于ISSR标记的55份地黄材料的聚类图
图5 基于RAPD和ISSR标记的55份地黄
材料的聚类图
4.2 地黄种质资源分类与地理位置和生态环境的关
系 本研究依据 RAPD和 ISSR标记对55份地黄材
料进行聚类分析,聚类结果表明,材料间的遗传关系
与地理位置有必然联系,同一地域分布的材料之间亲
缘关系较近。地理位置不同,生态因子就不同,必然
导致不同产区的地黄产生差异。比如怀地黄之所以
能成为“道地药材”与其得天独厚的自然地理条件有
密切关系,该地区土壤为砂壤土,是由黄河冲积而成
的,pH为75~85,透气性好,适合地黄生长和主要
药用成分梓醇的积累[7]。
4.3 地黄野生种质资源的利用价值及其遗传多样性
保护 野生品种有自然的居群结构,它们的生长群落
不像栽培品种那样简单,和栽培品种的变异式样也不
一样[8],它们包含有栽培品种所没有的一些优异的
有价值的基因,能经受时间和环境的考验。本研究中
55份材料(其中有48份野生类型)的多态性位点百
分率高达8958%,9432%,都高于陈京荔[9]和周延
清[10]等人得到的数据699%,6158%,7158%,说
明地黄野生类型比栽培类型存在更丰富的遗传差异。
在今后的科学研究中,应该竭尽全力保护这些野生品
种所携带的遗传基因,同时有目的地选用具有优良基
因的野生品种进行杂交育种,使优良基因得到有效转
移。
[参考文献]
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AnalysisofgeneticdiversityofwildRehmanniaglutinosaby
usingRAPDandISSRmarkers
WANGYan1,2,LIXianen2,LIXuedong1,QIJianjun2,SUNPeng3,ZHOULili2
(1.ColegeofLifeSciences,CapitalNormalUniversity,Beijing100037,China;
2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalColege,
Beijing100094,China;
3.ColegeofAgronomyandBiotechnology,ChineseAgricultureUniversity,Beijing100094,China)
[Abstract] Objective:ToanalyzethegeneticdiversityofwildRehmanniaglutinosaandevaluateandcomparerandomampli
fiedpolymorphicDNA(RAPD)andintersamplesequencerepeat(ISSR)foranalysisofR.glutinosaaccessions.Method:Twomo
lecularmarkers,RAPDandISSRwereusedforanalyzing55wildR.glutinosaaccessions.Result:Average16.00and19.08bands
wereamplifiedbyRAPDprimersandISSRprimersrespectively,andthepercentageofpolymorphicbandswere89.58% and94.32%
respectively;FiftyfiveR.glutinosaaccessionscategorizedinto7clusterswereidentifiedbyunweightedpairgroupmethod,arithmetic
average(UPGMA)method.Conclusion:AhighlevelofgeneticdiversityofwildRehmanniaglutinosawasdisplayedatDNAlevel,
andgeneticdiversitycoeficientofR.glutinosafromdiferentproductionareaswas0.630.98,andISSRmarkercandetecthigherge
neticdiversityofR.glutinosagermplasmsthanRAPDmarker.
[Keywords] Rehmanniaglutinosa;germplasm;geneticdiversity;RAPD;ISSR
[责任编辑 吕冬梅]
[收稿日期] 20071212
[基金项目] 2005年度山东省重大科技专项
[通讯作者] 王建华,Tel:(0538)8242226,Email:jhwangjh@163.com
野葛叶片光合特性及其与环境因子的相互关系
周红英1,王建华1,2,房信胜1,薛永峰1,朱海芳1,董其亭2,蔡爱民2,
付志文2,王 玲3
(1.山东农业大学 农学院,山东 泰安 271018;
2.山东鼎立中药材科技有限公司,山东 淄博 255086;
3.山东中医药大学 附属医院,山东 济南 250000)
[摘要] 目的:研究野葛叶片光合特性及其与环境因子的相互关系。方法:用英国产CirasⅡ型便携式光合测
定系统,测定了野葛叶片的净光合速率日变化以及环境因子的日变化。结果:野葛叶片的表观光量子速率00173
μmolCO2·μmol
-1photon,暗呼吸速率29333μmol·m-2·s-1,光补偿点180μmol·m-2·s-1,光饱和点1600
μmol·m-2·s-1;羧化效率00338μmol·m-2·s-1,光呼吸速率25μmol·m-2·s-1,CO2补偿点100μmol·
mol-1,CO2饱和点1600μmol·mol
-1。结论:光量子通量密度、叶片CO2浓度和叶片温度是影响野葛光合速率的主
要因素,气孔导度和蒸腾速率具有一定调节作用。
[关键词] 野葛;光合特性;环境因子
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)22259504
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