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Extraction of triterpenoids from fruits of Ganoderma lucidumby supercritical fluid extraction

超临界CO2萃取灵芝子实体中的三萜类成分



全 文 :Pharmaceuticalcharacteristicsofbrucinestealthliposomes
CHENJun1,2,WANGWei1,CAIBaochang2,HUWei2,WANGLijie2
(1.ColegeofPharmacy,2.JiangsuKeyLaboratoryofChineseMedicineProcesing,NanjingUniversityof
ChineseMedicine,Nanjing210029,China)
[Abstract] Objective:Topreparebrucinestealthliposomesandcomparetheinvitrocharacteristicswithbrucineconventional
liposomes.Method:Brucinestealthliposomesandconventionalliposomeswerebothpreparedbyammoniumsulfatetransmembrane
gradients.Theencapsulationeficiency,particlesize,invitroreleaseprofilesandstabilitywerecomparedrespectively.Result:The
encapsulationeficiencyofbrucinestealthliposomesandconventionalliposomeswere(807±05)%,and(805±03)%,respec
tively.Themeanpariclesizeswere1035nmand1694nm,respectively.Whetherratplasmawasaddedornot,thereleaserateand
degreeofbrucinestealthliposomesweresignificantlylowerthanthoseofconventionalliposomes.Brucinestealthliposomesweremore
stablethanconventionalliposomes.Conclusion:Astheantitumordurgdeliverysystem,theinvitrocharacteristicsofbrucinestealth
liposomesaremoresatisfactorythanthecorespondingconventionalliposomes.
[Keywords] brucine;stealthliposomes;releaseprofile;stability [责任编辑 鲍 雷]
超临界 CO2萃取灵芝子实体中的三萜类成分
宋师花1,2,贾晓斌1,陈 彦1,2,陈 斌1,王丽静2,赵呈雷1
(1.江苏省中医药研究院 中药新型给药系统应用技术重点研究室,江苏 南京 210028;
2.江苏大学,江苏 镇江 212013)
[摘要] 目的:筛选超临界CO2萃取灵芝子实体中三萜类成分的最佳工艺条件。方法:采用RPHPLC测定灵
芝酸B的含量、可见分光光度法测定灵芝总三萜含量,设计正交试验优化超临界 CO2萃取灵芝子实体中三萜类成
分的工艺条件。结果:超临界CO2萃取灵芝子实体中三萜类成分的最佳工艺条件:萃取压力为25MPa,萃取温度为
45℃,萃取时间为15h,夹带剂(95%乙醇)用量为3mL·g-1。结论:超临界 CO2萃取灵芝子实体中三萜类成分
具有萃取效率高、萃取时间短、操作简单等优点,其方法可靠,切实可行。
[关键词] 灵芝;超临界CO2萃取;正交试验;灵芝总三萜;灵芝酸B;RPHPLC
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)17210404
[收稿日期] 20080208
[基金项目] 江苏省公益专项(BM2007701)
[通讯作者] 陈 彦,Tel:(025)85637809,Email:ychen202@ya
hoo.com.cn
  灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌,药用部
位为子实体、孢子体、菌丝体,2005年版《中国药典》
收载的作为药材灵芝来源的是赤芝 Ganodermaluci
dum(Leyss.exFr.)Krast.和紫芝 GsinenseZhao,
XuetZhang的干燥子实体[1],具有补气安神,止咳
平喘之功效。现代药理研究表明,灵芝中主要有效
成分灵芝三萜具有抗肿瘤、抗突变、抗氧化、清除自
由基、提高机体免疫力等作用[23]。该类化合物的传
统提取方法主要有氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂提
取[45],其提取效率较低,有溶剂残留,毒性较大。超
临界CO2萃取具有萃取效率高,有机残留少,绿色无
污染等优势,是一种很有发展前景及潜力的方法,但
文献报道以该法萃取灵芝孢子中三萜类成分居
多[67],而以该法萃取灵芝子实体中三萜类成分的报
道较少,其考察方法也多采用紫外分光光度法测定
灵芝总三萜的含量[8],而用RPHPLC测定灵芝酸B
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的含量并以其作为考察指标的未见报道,因此本试
验以RPHPLC测定的灵芝酸 B含量并结合灵芝总
三萜含量、固形物含量为考察指标,采用正交试验筛
选超临界CO2萃取灵芝子实体中三萜类成分的最佳
工艺条件,为灵芝子实体中三萜类成分的提取提供
一种可靠、可行的新方法。
1 仪器与药品
HA221-04(50)-25型超临界萃取装置(江苏
南通华安超临界萃取有限公司);Waters高效液相
色谱仪(Waters600Controler,Waters2996Photodi
odeArayDetector);UV-2802型紫外可见分光光
度计(上海尤尼克仪器有限公司)。
灵芝子实体购自江苏盐城神农保健食品有限公
司,经中国科学院微生物研究所文华安研究员鉴定
为赤芝Ganodermalucidum(Leyss.exFr.)Krast.的
干燥子实体;熊果酸对照品(批号 110742200516,
供含量测定用,中国药品生物制品检定所);灵芝酸
B(购于中国医学科学院药物研究所,纯度为
980%);甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯;水为重蒸水,
其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 正交试验设计
经预试验可知,影响超临界 CO2萃取灵芝子实
体中三萜类成分的因素主要为萃取压力、萃取温度、
萃取时间、夹带剂(95%乙醇)用量4个因素,因此
拟定3个水平,以总三萜含量、灵芝酸 B含量、固形
物含量为考察指标,采用 L9(3
4)正交表安排试验,
见表1。
表1 正交试验因素水平
水平

萃取压力
/MPa

萃取温度
/℃

萃取时间
/h

夹带剂用量
/mL·g-1
1 20 35 10 10
2 25 45 15 20
3 30 55 20 30
2.2 样品制备
采用一级萃取、二级分离的方法对灵芝三萜进
行萃取,萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂用量
按照表1条件进行正交试验;设定分离釜Ⅰ压力为
7MPa,温度为50℃;分离釜Ⅱ压力为4MPa,温度
为36℃;萃取装置内CO2流量控制在30L·h
-1。
超临界CO2萃取灵芝三萜类成分流程:将灵芝
子实体粉碎,过12目筛,取100g灵芝子实体粗粉
装入萃取釜中,打开CO2钢瓶(需保持出口压力在4
MPa以上),同时调节萃取釜、分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ
温度达设定温度,然后加压至设定压力,调节CO2流
量,使超临界CO2流体在设定的压力、温度下进行萃
取循环,当达到试验设定的萃取时间后,从分离釜 I
和分离釜 I出料口接收萃取液,定容至500mL,即
得灵芝子实体超临界CO2萃取液样品,备用。
2.3 灵芝总三萜含量测定
2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取熊果酸对照
品225mg,置于10mL量瓶中,加无水乙醇适量使
溶解,定容,摇匀,即得。
2.3.2 显色方法及检测波长的确定[8] 取上述对
照品溶液05mL,置10mL具塞试管中,沸水浴中
挥干溶剂,依次加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶
液05mL,高氯酸08mL,密塞,于60℃水浴中加
热15min,取出,冰水浴中冷却 5min,加冰醋酸 5
mL,摇匀。用UV-2802型紫外可见分光光度仪进
行全波长扫描,在543nm处有最大吸收峰,故选择
检测波长为543nm。
2.3.3 标准曲线的制备 分别精密吸取熊果酸对
照品溶液02,03,04,05,06,07,08mL,按上
述条件及步骤在543nm处测定吸光度,以吸光度为
纵坐标(Y),熊果酸对照品含量(μg)为横坐标(X),
绘制标准曲线,线性方程为 Y=36444X+0005,
r=09995,结果表明熊果酸在 00450~01800
mg呈现良好的线性关系。
2.3.4 供试品溶液制备及含量测定 分别取灵芝
子实体超临界CO2萃取液样品60μL,按2.3.2项下
测定吸光度,根据标准曲线计算总三萜含量,见表
2。
2.4 灵芝酸B含量测定
2.4.1 色谱条件 AltimaC18色谱柱(46mm×
250mm,5μm);流动相乙腈(A)01%磷酸水溶液
(B),采用梯度洗脱,0min30%A,40min32%A;流
速10mL·min-1;检测波长252nm;柱温25℃;进
样量10μL。
2.4.2 标准曲线的绘制 精密称取灵芝酸 B对照
品2375mg,置 5mL量瓶中,加甲醇适量使溶
解,定容,制成质量浓度为0475g·L-1的灵芝
酸B对照品储备液。吸取灵芝酸 B对照品储备液
适量,分别制成质量浓度为 00475,00950,
01425,01900,02375g·L-1的灵芝酸 B对
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照品溶液。吸取灵芝酸 B对照品溶液10μL进样,
测定其峰面积。以对照品浓度为横坐标,峰面积积
分值为纵坐标,绘制标准曲线,得灵芝酸 B标准
曲线Y=91104X-3758,r=09999,结果表明,
灵芝酸B在00475~02375g·L-1呈良好的线性
关系。
2.4.3 测定 取灵芝子实体超临界 CO2萃取液样
品,过045μm微孔滤膜,取续滤液,分别进样 10
μL,按上述色谱条件进行分析,计算灵芝酸 B的含
量,结果见表2。
2.5 灵芝固形物含量测定
精密量取灵芝子实体超临界 CO2萃取液样品
10mL,置已干燥恒重的蒸发皿中,水浴挥干溶剂,
置105℃烘箱中恒重,称定,计算固形物的含量,结
果见表2。
表2 正交试验结果 mg·g-1 
No. 总三萜 灵芝酸B 固形物
1 902 0290 1430
2 1064 0452 1810
3 954 0441 1595
4 1145 0468 1820
5 1049 0437 1800
6 1112 0451 1920
7 1022 0449 1755
8 1089 0461 1895
9 1051 0422 1642
2.6 正交试验结果分析
用L9(3
4)正交表进行试验设计优化,极差分析
和方差分析见表3,4。
表3 正交试验极差分析
指标  
因素
A B C D
总三萜 K1 954 1023 1034 1001
  K2 1102 1048 1067 1047
  K3 1054 1039 1008 1063
  S 148 025 059 062
灵芝酸B K1 0394 0402 0401 0383
  K2 0452 045 0447 0451
  K3 0444 0438 0442 0457
  S 0058 0048 0046 0074
固形物 K1 1612 1668 1748 1624
  K2 1847 1835 1757 1828
  K3 1764 1719 1717 1770
  S 235 167 040 204
  通过极差分析可知,超临界 CO2萃取灵芝子实
体中三萜类成分以总三萜含量为考察指标的最佳工
   表4 正交试验方差分析
指标 方差来源 偏差平方和 自由度 F P
总三萜 A 342 2 3564 <005
  B 001 2 100  
  C 052 2 547  
  D 062 2 648  
  误差 01 2    
灵芝酸B A 0006 2 150  
  B 0004 2 100  
  C 0004 2 100  
  D 0010 2 250  
  误差 000 2    
固形物 A 853 2 3112 <005
  B 438 2 1598  
  C 027 2 100  
  D 665 2 2426 <005
  误差 027 2    
  注:F临界值为1900
艺条件为A2B2C2D3,以灵芝酸B量为考察指标的最
佳工艺条件为A2B2C2D3,以灵芝固形物含量为考察
指标的最佳工艺条件为A2B2C2D2,综合这3个考察
指标可知,萃取压力、萃取温度、萃取时间这3个因
素对萃取的影响一致,最佳条件均为 A2B2C2,方差
分析表明,萃取压力对灵芝总三萜含量、固形物含量
影响显著(P<005),所以选择萃取条件:萃取压力
为25MPa,萃取温度为45℃,萃取时间为15h。
夹带剂用量这个因素对萃取过程的影响不完全一
致,但从灵芝总三萜含量和灵芝酸 B含量为主要考
察指标的角度考虑,以选择夹带剂用量为 3mL·
g-1为佳,最终确定最佳萃取工艺:萃取压力为 25
MPa,萃取温度为45℃,萃取时间为15h,夹带剂
用量为3mL·g-1。
2.7 验证试验
为进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性,取
3份药材,每份100g,按上述最佳萃取条件进行试
验,结果见下表5。
表5 工艺验证试验 mg·g-1 
样品 总三萜 灵芝酸B 固形物
1 1168 052 2001
2 1183 055 2050
3 1176 053 2023
3 讨论
本试验通过正交试验法对超临界CO2萃取灵芝
子实体中三萜类成分的萃取条件进行了优化,综合
灵芝总三萜含量、灵芝酸 B含量、灵芝固形物含量
等3项指标进行考察,确定最佳萃取工艺为 A2B2C2
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D3。将最佳工艺进行验证试验,证明该最佳萃取工
艺稳定、可靠。
以可见分光光度法测定灵芝总三萜含量是以三
萜类成分熊果酸为对照品,而在灵芝三萜中并不含有
熊果酸,所以可见分光光度法只能粗略的测定灵芝三
萜的含量。灵芝酸B是灵芝中一种重要的三萜类成
分,具有很强的药理活性,作者以RPHPLC测定灵芝
酸B的含量,比可见分光光度法测定灵芝总三萜的含
量更可靠、准确,而且可以进一步验证可见分光光度
法测得的试验结果。所以本试验综合考察灵芝总三
萜的含量和灵芝酸B的含量试验结果更为可靠。
萃取压力是超临界流体萃取过程中的关键因素
之一,萃取压力增加则超临界流体的密度增大,从而
增强其溶解能力,提高萃取率。但从结果分析可知,
萃取压力与灵芝三萜的萃取量并不成线性关系,当
压力增大到25MPa以后,灵芝三萜的萃取量增加不
明显。这是因为压力增大到一定程度后,大部分灵
芝三萜成分被释放溶出到超临界流体中,再增大压
力,已失去意义,同时萃取压力增加会导致高压设备
的安全性隐患增大,因此萃取压力选择25MPa为
宜。温度是除压力之外的另一个重要的影响因素。
本试验中,温度对灵芝三萜萃取的影响有两种趋势:
随着温度的升高,萃取量逐渐增加,当超过45℃时,
又逐渐下降。这是由于温度对灵芝三萜在超临界
CO2流体中的溶解有两方面的影响:一是温度升高
后,超临界CO2流体的挥发性和扩散性提高,促进
灵芝三萜溶出到超临界CO2流体中,萃取量增多;二
是随着温度的升高,CO2流体的密度降低,导致CO2
流体的溶剂化效应下降,使灵芝三萜在其中的溶解
度下降。因此,在本试验条件下选择灵芝三萜的最
佳萃取温度为45℃。夹带剂的使用有利于增加超
临界CO2对极性物质的溶解能力和选择性,在本试
验条件下夹带剂的最佳用量选择3mL·g-1。
[参考文献]
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ExtractionoftriterpenoidsfromfruitsofGanodermalucidum
bysupercriticalfluidextraction
SONGShihua1,2,JIAXiaobin1,CHENYan1,2,CHENBin1,WANGLijing2,ZHAOChenglei1
(1.JiangsuProvincialAcademyofChineseMedicine,JiangsuEngineeringResearchCenterforPharmaceuticalPreparation,
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[Abstract] Objective:TooptimizetheextractingconditionfortriterpenoidsfromthefruitsofGanodermalucidumbysupercriti
calfluidextraction(SFE).Method:Optimumextractionconditionswerestudiedbyorthogonaltests.Thetotaltriterpenoidswerede
terminedbyultravioletspectrophotometryandganodericacidBwasdeterminedbyRPHPLC.Result:Theoptimalextractioncondi
tionswerethatthepressure25MPa,thetemperaturewas45℃,theextractiontimewas15hour,andtheethanolwasemployedas
modifiercarieratthevolumeof3mL·g-1.Conclusion:SFEissuperioranditisfeasibletoextracttriterpenoidsfromfruitsofGano
dermalucidum.
[Keywords] Ganodermalucidum;supercriticalfluidextraction;orthogonalexperimentaldesign;totaltriterpenoids;ganoderic
acidB;RPHPLC
[责任编辑 鲍 雷]
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