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Neuro-protective effect of naomaitong to brain damage after focal cerebral isc hemia reperfusion (I/R) in the aged rats

脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤脑保护作用的研究



全 文 :²¯ª¬¦¤¯ ¶¨¦·¬²±¶º«¬¦«º µ¨¨ ¶·¤¬±¨ §º¬·« ‹ °¨¤·²¬¼¯¬±2∞²¶¬±k‹∞l ¤±§ ¤¶¶²±¶·¤¬±¬±ª©²µ³¤·«²¯²ª¬¦¤¯ §¬¤ª±²¶¬¶qΡεσυλτ }≤…• ° ¦²¤¯§§¨¦µ¨±¶¨
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≈ Κεψ ωορδσ  ¦²°³²∏±§…¬¨­¬¤ •∏¤±ª¤± ³µ¨¶¦µ¬³·¬²±k≤…• °l ~µ¤·¶~³∏¯°²±¤µ¼©¬¥µ²¶¬¶~ ¶2¦²¯ ¤¯ª¨ ± ~ ·2¦²¯ ¤¯ª¨ ± ~ ¤¯°¬±¬±~«¼¤¯∏µ²±2
¬¦¤¦¬§
≈责任编辑 方文贤 
脑脉通对老龄大鼠脑缺血Π再灌注
损伤脑保护作用的研究
任小巧 3 o李建生 o封银曼 o卢跃卿
k河南中医学院 老年医学研究所 o河南 郑州 wxsss{l
≈摘要  目的 }研究脑脉通对急性局灶性脑缺血Π再灌注后脑损伤的保护作用 ∀方法 }采用线栓法建立老龄大鼠
急性局灶性脑缺血Π再灌注模型 o观察缺血 v «及再灌注 tu «各组神经症状 !脑梗死面积 !脑组织含水量 !脑组织病理
形态及超微结构变化 ∀结果 }脑缺血组及脑缺血Π再灌注组脑梗死面积明显大于假手术组 o神经障碍重于假手术组 o脑
组织含水量高于假手术组 o脑组织病理形态及超微结构改变较重 ∀治疗组脑组织梗死面积 !神经障碍 !脑组织含水量 !
脑组织病理形态及超微结构变化较脑缺血组及脑缺血Π再灌注组明显减轻k Π s qsstl ∀结论 }脑脉通对局灶性脑缺血
Π再灌注后脑组织有保护作用 ∀
≈关键词  老年 ~脑脉通 ~脑缺血 ~超微结构 ~神经保护
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukusswlst2ssyy2sx
本室以往的研究证实 o脑脉通对脑缺血Π再灌注
后脑组织具有保护作用 ∀据此 o本研究采用老年大
鼠急性局灶性脑缺血及再灌注模型 o通过观察脑脉
通对脑缺血Π再灌注后脑组织梗死面积 !脑组织含水
量和超微结构变化的影响 o进一步探讨脑脉通对脑
缺血Π再灌注脑组织的保护作用及其作用机制 ∀
1 材料与方法
1 .1 动物与药物
≥⁄雄性老龄大鼠 {w只 o体重 wss ∗ yxs ªo鼠龄
us ∗ uu月龄由河南省动物实验中心提供 o合格证
号 }≠˜2„2wtsstuy ∀尼莫地平 o由山东新华制药股份
有限公司提供批号 sstusz| ∀脑脉通k大黄 o人参 o葛
根 o等l o由河南中医学院第一附属医院制剂室提供 o
批号 sssusts ∀
≈收稿日期  ussv2sy2su
≈基金项目  河南省杰出青年科学基金项目 kswtusss{ss o
sttusstvsssl ~河南省高校创新人才基金项目kusss2tsl
≈通讯作者  任小巧 oר¯ }ksvztlz|wusxw oxyzyxy{ o∞2°¤¬¯}• ¬´ uv
ƒ ¶²«∏q¦²°
1 .2 实验分组
将老龄大鼠 {w只按体重结合随机法分为假手
术组 !模型组 !尼莫地平组 !脑脉通高 !中 !低剂量组 o
共 y大组 o除假手术组外 o每组又分为单纯缺血 v «
及再灌注 tu «组 o每组 y只动物 ~尼莫地平组大鼠于
造模前 x §灌胃给予尼莫地平 y qy °ª#®ªpt#§pt ~脑
脉通高 !中 !低剂量组 o用药剂量按体型系数计算
t qsy ª#®ªpt#§pt o低剂量按平均量的 tΠu计算 o中剂
量按平均量的 t倍计算 o高剂量按平均量的 u倍计
算 ∀假手术组 !造模组灌胃生理盐水 o其余各给药组
均于造模前 x §灌胃给予脑脉通混悬液 o每天 t次 o
最后 t次给药 u «后开始造模 ∀每组分别于缺血 v «
及再灌注 tu «每个时间点各取 y只 ∀
2 方法
2 .1 造模方法
所有大鼠均按 ²±ª¤的方法栓塞左侧大脑中动
脉 o将单股尼龙线的头端 s qx ¦°热膨胀并打磨后 o
经颈外动脉2颈总动脉2颈内动脉进入大脑中动脉起
始部位 o造成栓塞 o于栓塞 v «拔出栓线 o形成缺血
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第 u|卷第 t期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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后再灌注 o再灌注时间为 tu «∀术后大鼠置单笼饲
养观察 ∀
2 .2 指标与检测方法
2 .2 .1 大鼠神经功能观察 ²±ª±评分标准稍作改
进 o将大鼠行为分为 y个等级评分 ∀s级 }无明显神
经功能障碍 os分 ~t级 }提鼠尾 o右前肢不能完全伸
直 ot分 ~u级 }右前肢阻力减小 o行走偏右侧 ou分 ~v
级 }右侧旋转行走 ov分 ~w级 }原地右旋 ow分 ~x级 }
完全右瘫 ox分 ∀
2 .2 .2 梗死面积 !脑组织含水量及脑组织病理形态
造膜成功的大鼠 o在规定的时间点 o断头后 o于冰
盘上迅速分离全脑 o驱除嗅球 !小脑及脑干 o在冰上
将大脑从前向后切成 x块厚约 t q{ °°的大脑冠状
切片 o切取的第 u脑片 o常规 ‹∞o±¬¶¶¯. ¶染色 o光镜
观察 ~第 v片经处理后电镜观察 ∀将第 v ow脑片迅
速投入 u h的 ××≤溶液 vz ε 避光温育 ws °¬±∀然后
将脑片放入 ts h的福尔马林溶液中固定 uw «以上 ∀
观察染色结果 o将脑片照相并计算两个层面梗死坏
死组织面积占两个层面总面积的百分比 o为其范围 ∀
第 w块切取部分大脑皮层组织标本k约 s qv ∗ s qw ªl
分别用分析天平测定其湿重及在电热恒温干燥箱
tss ε 干燥 w{ «后的干重 o计算k湿重 p干重lr湿重
比值 ∀
2 .2 .3 统计方法 应用 ≥°≥≥ 软件包进行统计分
析 o各组脑组织含水量 !神经症状评分 !脑梗死面积
采用方差分析及 τ检验 o数据用kξ ? σl 表示 ∀
3 结果
3 .1 神经症状评分
大鼠脑缺血Π再灌注 v «!再灌注 tu «后几乎所
有的动物都出现了神经功能障碍 ∀脑脉通高 !中剂
量均可使脑缺血Π再灌注 v «!再灌注 tu «后的大鼠
神经功能障碍减轻和尼莫地平组具有相似的作用 o
与老龄大鼠脑缺血Π再灌注相同时间点比较有显著
的统计学差异 ∀低剂量组作用不明显 ∀值得注意的
是脑脉通高剂量组动物 o灌药后 v §有便溏现象 o术
中出血量相对较多k表 tl ∀
3 .2 脑组织梗死面积
脑组织在 ××≤染色时梗死区内坏死组织呈苍白
色 o未坏死组织呈红色 ∀观察发现 o老龄大鼠脑缺血
Π再灌注组脑组织梗死区面积较大 o尼莫地平 !脑脉
通高 !中剂量脑缺血Π再灌注 tu «组梗死区面积较老
龄大鼠脑缺血Π再灌注模型组明显缩小 o脑脉通低剂
量组与老龄大鼠脑缺血Π再灌注模型组比较无显著
性差异k表 ul ∀
表 t 脑脉通对脑缺血Π再灌注后
各组大鼠神经功能障碍的影响k ξ ? σl
组别
脑缺血Π再灌
注时间Π« ν 神经功能障碍评分
老龄假手术 w s
老龄脑缺血 vΠs y w qtyz ? s qzuv
vΠtu x w qss ? s qzsz
尼莫地平 vΠs y u qvvv ? t quttul
vΠtu y u qyyz ? s qzszvl
脑脉通低剂量 vΠs y v qtyz ? s q|{v
vΠtu y v qss ? s q{|w
脑脉通中剂量 vΠs y u qss ? s qyvuul
vΠtu y u qxs ? s qxw{wl
脑脉通高剂量 vΠs y u qyyz ? s qxtytl
vΠtu y u qyyz ? s qxtywl
注 }与老龄脑缺血 v «组比较 otl Π s qsx oul Π s qst ~与老龄大
鼠脑缺血Π再灌注 tu «组比较 ovl Π s qst owl Π s qsst k表 u同l
表 u 脑脉通对脑缺血Π再灌注后
各组脑组织梗死面积的影响k ξ ? σl
组别
脑缺血Π再灌
注时间Π« ν
脑组织梗死面积
Πh
老龄假手术 w s
老龄脑缺血 vΠs x vt qwxv ? t qw{w
vΠtu w vy qvzu ? s qxs|
尼莫地平 vΠs x uv q|y{ ? w qvwwul
vΠtu w uw q{|z ? v qy{|vl
脑脉通低剂量 vΠs x vv qyvu ? u qyvx
vΠtu w vx qt|z ? t qy|w
脑脉通中剂量 vΠs x ut qstu ? v qs|{ul
vΠtu w uv qxw{ ? v qxyuwl
脑脉通高剂量 vΠs x uy qytz ? t qxy{tl
vΠtu w uy q|u ? u qvy{wl
3 .3 脑组织含水量
老龄脑缺血 v «模型组与假手术组比脑组织含
水量无明显增加 ∀至再灌注 tu «时 o脑组织含水量
明显增加 o与假手术组比较有显著的统计学意义 ∀
尼莫地平 !脑脉通中 !高剂量组与老龄大鼠脑缺血Π
再灌注 tu «组比较有显著的统计学意义 ~而与假手
术组比较无显著性差异 ∀脑脉通低剂量组脑组织含
水量与模型组比较无显著性差异 ∀尼莫地平 !脑脉
通中 !高剂量组间比较无统计学意义k表 vl ∀
3 .4 病理形态
3 .4 .1 ‹∞染色 老龄大鼠脑缺血Π再灌注模型组
缺血 v «时 ‹∞染色上缺血损伤累及广泛皮层及纹
状体外侧 o半暗带范围大 o缺血中心区与周围区界限
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第 u|卷第 t期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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¤±∏¤µ¼oussw
表 v 脑脉通对脑缺血Π再灌注后
各组脑组织含水量的影响k ξ ? σl
组别
脑缺血Π再
灌注时间Π« ν
脑组织含水量
Πh
老龄假手术 w {s q{z ? t qssz
老龄脑缺血 vΠs x {x qswy ? s qztzt oul
尼莫地平 vΠs y {u qv|{ ? t qsxv
vΠtu y {t qyw{ ? s qz|{wl
脑脉通低剂量 vΠs y {v qvv{ ? s qzxz
vΠtu w {w qzyv ? t qssx
脑脉通中剂量 vΠs y {t qzs{ ? t qtuwvl
vΠtu w {t qxsv ? s qzsvxl
脑脉通高剂量 vΠs y {t q{xy ? s qwuuvl
vΠtu w {u qtwv ? s qztzxl
注 }与老龄假手术组比较 otl Π  s qst ~与老龄脑缺血 v «组比
较 oul Π s qst ovl Π  s qsst ~与老龄大鼠脑缺血Π再灌注 tu «组比
较 owl Π s qst oxl Π s qsst
不易区分 o神经元排列紊乱 o变性的神经元数目相对
较少 o梗死中心区可见细胞坏死 o部分细胞消失 o可
见微血管 !神经元和胶质细胞k图 tl ∀缺血 v «再灌
注 tu «组神经元坏死性变性 o胞浆嗜酸 o胞核溶解 o
细胞周边呈扇形空泡改变 o周边半暗带范围较大k图
ul ∀另在梗死区范围内可见程度不同 !数量不等的
染色较深的神经元 o呈塌陷或皱缩形状 ∀这类神经
元周围有水肿 o还可见到细胞浆肿胀的神经元 o星形
细胞呈不同程度的肿胀 ∀研究中还发现在缺血的中
心部位神经元的破坏在缺血后 v «即可出现 o同时 o
亦可见到神经元早期凋亡的迹象 o并随着再灌注时
间的延长逐渐向半暗带区扩展 o半暗带区神经元的
完整性保持相对较好且时间相对较长 ∀
尼莫地平组k图 yl !脑脉通中 !高剂量组上述改
变较轻k图 w oxl ~脑脉通低剂量组常规染色光镜下仍
可见较重的病理改变k图 vl o与模型组比较无明显
差异 ∀
3 .4 .2 ‘¬¶¶¯. ¶染色 ‘¬¶¶¯. ¶染色发现染色后尼氏
小体呈蓝色 o模型组各组神经元胞浆呈深蓝色 o尼氏
体分界不清 o胞体塌陷或皱缩 o胞核椭圆或三角型 o
染成淡蓝至深蓝色k图 zl ~其时间及空间分布特点
与 ‹∞染色上神经元的变化一致 o多数神经元周围
水肿 ∀对侧半球没有发现异常神经元 ∀缺血损伤的
神经元的突起呈螺丝样并有不同程度的崩解 ~u种
染色所显示的异常神经元范围基本一致 o各组的异
常神经元所在范围随再灌注时间延长而有扩大的趋
势 o再灌注 tu «组异常神经元所在范围明显扩大 ∀
尼莫地平组k图 {l !脑脉通中 !高剂量组仍可见
到较多的尼氏小体 o尼氏小体胞体塌陷或皱缩现象
少见k图 | otsl ∀
3 .5 电镜观察
老龄假手术组k图 ttl o神经元细胞体积大 o细胞
质丰富 o可见粗面内质网 !微丝 !细胞核大 o呈圆形或
椭圆形 o有 t ∗ v个 ~常染色质丰富 o异染色质较少 o
可见线粒体轻微肿胀现象 ∀老龄大鼠脑缺血 v «
组 o核轻度不规则 o核膜完整 o出现异染色质边集现
象 ~异形线粒体较少 o多数线粒体脊清楚 !连续 ~缺血
v «再灌注 tu «o许多神经元及神经胶质细胞胞体固
缩或肿胀 ~核固缩或溶解坏死 o染色质凝集成块或溶
解 o异染色质边集 o核膜连续性破坏或凹陷 ~许多线
粒体肿胀成空泡状 o嵴模糊 !断裂 !消失 o线粒体内基
质电子密度降低k图 tul ∀
尼莫地平组可见核轻度不规则 o核膜完整 o异染
色质边集现象少见 ~异形线粒体较少 o多数线粒体脊
清楚 !连续 ∀脑脉通中 !高剂量组缺血 v «组神经元
细胞核基本正常 o细胞质丰富 o细胞器量较大 o大量
线粒体 !粗面内质网及游离的核糖体 o血管内皮基膜
完整 o可见毛细血管周围极轻度水肿 ∀再灌注 tu «
组神经元细胞核正常 o可见大而明显的核仁 o细胞质
丰富 o细胞器量较大 o粗面内质网及游离的核糖体量
较多 o大量线粒体 o线粒体嵴几乎正常 o有 v ∗ w个初
级溶酶体 ot个次级溶酶体k图 tv otwl ~可见较多的
神经胶质细胞 ~血管内皮基膜完整 ∀
4 讨论
≤²∏¯¯ ≈t 提出在脑卒中治疗机会上存在/多个治
疗机会窗0的概念 o包括/初级0及/次级预防0窗 !/脑
缺血超早期干预窗0 !缺血损伤发生后的恢复期和修
复期可能存在的/治疗机会窗0 ∀这符合中医药治疗
缺血性脑损伤的主要理论依据之一 ∀本实验采用线
栓法阻断 ≤„ o方法更为简单 o对脑组织的直接损伤
小 o能阻断豆纹动脉和其他直接从 ≤„发出的小皮
层支 o与临床上脑梗死发生的常见类型相似 o便于制
作脑缺血后再灌注动物模型 ~采用脑缺血 v «后再
灌注模仿临床治疗时间窗 o更加符合临床药物治疗
研究实际 ∀中医认为老年/缺血性脑卒中0因气虚血
瘀 o浊毒内蕴所致 o治疗应以调整气血 o解毒降浊为
主 ∀脑脉通可以益气活瘀 o解毒降浊以改善/内结毒
瘀0的病理状态 ∀于 ≤„ 阻塞前 !再灌注之始给予
脑脉通 o是模拟临床上/预防窗0 !/脑缺血超早期干
预窗0而设计的 o此时给药一可益气扶正 o增加机体
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抗邪能力 ~二可截断内生之毒的产生 o防止形成内结
毒瘀的状态 o阻止其对缺血损伤的神经元产生毒性
作用 ∀
脑脉通中 !高剂量组均可明显改善脑缺血Π再灌
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注所致的神经元损伤 o表现为改善神经功能障碍 !减
轻脑组织含水量 !缩小梗死面积 !保护神经元 o与尼
莫地平有相同的疗效 ∀但脑脉通高剂量组灌药时间
长可出现便溏现象 ~脑脉通低剂量组无明显疗效 ∀
根据研究结果 o结合药理研究法则 o认为脑脉通
中剂量组为治疗缺血性脑损伤的最佳剂量 ∀
脑脉通治疗组可见大量的核糖体出现 o同时可
见大量线粒体 o线粒体嵴几乎正常 o说明神经元正在
合成自身修复所需的内源性蛋白 o从而有利于神经
元的修复≈u  ∀研究还发现 o脑脉通高 !中剂量组神经
元凋亡现象明显轻于老龄大鼠脑缺血Π再灌注组 o其
正常神经细胞及神经胶质细胞数明显增加 o微血管
内皮细胞形态正常 o基膜完整 o说明本方可能可保
护神经胶质细胞及血管内皮细胞 o从而有利于微小
环境的改善 o利于神经元对缺血的耐受 ~或可能通过
上调星形胶质细胞的活化状态 o而有利于神经元的
修复≈v ow  ∀上述现象说明 o脑脉通可能能通过清除再
灌注所产生的自由基等有害物质 o从而保护神经元
免遭自由基的损伤 ~或通过调整线粒体呼吸功能 o提
高氧化磷酸化偶联能力 o增加利用氧的能力 ~或通过
整体调节作用给神经元提供自身修复所需的蛋白
质 o从而有利于神经元的修复 ∀其机理有待进一步
研究 ∀
≈参考文献 
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Χυρρ Οπιν Νευρολot||y o|ktl }wv q
≈u  陶 沂 o石 晶 o郑惠民 o等 q缺血预处理对沙土鼠脑缺血Π再
灌注后线粒体功能的影响 q临床神经病学杂志 ousss otvkvl }
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k Ηεναν Χολλεγε οφ Τραδιτιοναλ Χηινεσε Μεδινχινε o Ζηενγζηου wxsss{ o Χηιναl
≈Αβστραχτ  Οβϕεχτιϖε}ײ¶·∏§¼ ±¨ ∏µ²2³µ²·¨¦·¬√¨ ©¨©¨¦·²©‘¤²°¤¬·²±ª²± ¥µ¤¬± §¤°¤ª¨ ¤©·¨µ©²¦¤¯ ¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤µ¨³¨µ©∏¶¬²± kŒΠ• l
¬±·«¨ ¤ª¨§µ¤·¶q Μετηοδ }tt ªµ²∏³¶²©us ∗ uu2°²±·«²¯§≥⁄µ¤·¶º µ¨¨ ¶∏¥­¨¦·¨§·²v «²∏µ¶²© °¬§§¯¨¦¨µ¨¥µ¤¯ ¤µ·¨µ¼ ²¦¦∏¯¶¬²± º¬·«·«¨ ¬±2
·µ¤¯∏°¬±¤¯ ©¬¯¤° ±¨··«¦«±¬´∏¨ o©²¯ ²¯º §¨¥¼ tu «²∏µ¶²©µ¨©¨µ©∏¶¬²±q ‘¨µ√²∏¶¶¼°³·²±o²¨ §¨ °¤²©¥µ¤¬±o¬±©¤¦·¶¬½¨ o °²µ³«²¯²ª¼ ¤±§¶∏³¨µ©¬±¨
¶·µ∏¦·∏µ¨ ²©¥µ¤¬±o ¦¨·º µ¨¨ °²±¬·²µ¨§·«²∏ª«²∏·¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤¤±§µ¨³¨µ©∏¶¬²±q Ρεσυλτ }Œ±©¤¦·¶¬½¨ ²©¥µ¤¬±¬±¬¶¦«¨ °¬¤¤±§µ¨³¨µ©∏¶¬²±
ªµ²∏³¶º µ¨¨ ¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ ªµ¨¤·¨µq’ §¨¨ °¤²©¬·º¤¶«¬ª«¨µo±¨ µ√²∏¶¶¼°³·²± ²©¬·º¤¶°²µ¨ ¶¨µ¬²∏¶o¤±§°²µ³«²¯²ª¼ ¤±§¶∏³¨µ©¬±¨ ¶·µ∏¦·∏µ¨ ²©
¥µ¤¬± º µ¨¨ °²µ¨ ²¥√¬²∏¶·«¤±·«²¶¨ ²©¶«¤°2²³¨µ¤·¨§ªµ²∏³q‘¨µ√²∏¶¶¼°³·²±o²¨ §¨ °¤²©¥µ¤¬±o¬±©¤¦·¶¬½¨ o °²µ³«²¯²ª¼ ¤±§¶∏³¨µ©¬±¨ ¶·µ∏¦2
·∏µ¨ ²©¥µ¤¬±¬±·µ¨¤·¨§ªµ²∏³¶º µ¨¨ ¬¯ª«¨µ·«¤±·«²¶¨ ²©∏±·µ¨¤·¨§ªµ²∏³¶k Π s qsstl qΧονχλυσιον }‘¤²°¤¬·²±ª¦¤± ³µ²·¨¦·¥µ¤¬± §¤°¤ª¨ ¤©·¨µ
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≈Κεψ ωορδσ  ¤ª¨§~¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤~±¤²°¤¬·²±ª~¶∏³¨µ©¬±¨ ¶·µ∏¦·∏µ¨ ~±¨ ∏µ²2³µ²·¨¦·¬√¨ ©¨©¨¦·
≈责任编辑 方文贤 
本刊自 t||x年 t月 t日开始对来稿收取处理费k每篇 xs元l o请作者在寄发稿件的同时将处理费通过邮
局寄汇本刊k请勿在稿件中夹带现金l ∀汇单上请注明论文题目及第一作者姓名 ∀收款地址 }北京市东直门
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